JPH04228085A

JPH04228085A - Ｌ−トリプトフアンの製造法

Info

Publication number: JPH04228085A
Application number: JP3115224A
Authority: JP
Inventors: Masato Terasawa; 真人寺沢; Shoichi Nara; 昭一奈良; Makoto Goto; 誠後藤; Koichi Uchida; 内田　康一; Hisashi Yamagata; 山縣　恒; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1990-09-06
Filing date: 1991-04-20
Publication date: 1992-08-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は微生物を用いるＬ−トリ
プトファンの製造法に関し、さらに詳しくは、対原料収
率に優れかつ副生物の産生の少ない新規なＬ−トリプト
ファンの製造法に関する。

【０００２】Ｌ−トリプトファンは、必須アミノ酸の一
つとして人間及び動物の栄養上重要な役割をするもので
、医薬、食品、飼料添加等の需要が近年急激に増加して
いる。

【０００３】

【従来の技術】Ｌ−トリプトファンの工業的製法として
は、他のアミノ酸の場合と同様に立体異性体が存在する
ので、化学合成法ではＬ−体のみの製造は困難となり、
主として発酵法によっている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、発酵法
による既知のＬ−トリプトファンの製造法では、Ｌ−ト
リプトファンの収率等に限界があり、より効率的な製造
法の確立が求められている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
微生物を用いるＬ−トリプトファンの効率的な製造方法
を確立すべく新たな観点から鋭意検討を行った。その結
果、今回、コリネ型細菌に属する微生物菌体を、該微生
物菌体が増殖しない条件下に、グルコース及びインドー
ルを含む水性反応液中で酵素反応させると、対原料収率
に優れ、副生物も少く、効率的にＬ−トリプトファンを
製造することができることを見い出し、本発明を完成す
るに至った。

【０００６】かくして、本発明によれば、コリネ型細菌
に属するビオチン要求性微生物菌体またはその固定化物
を用い、少くともグルコース及びインドールを含有し且
つビオチンを実質的に含有しない水性反応液中で酵素反
応を行ない、該反応液中にＬ−トリプトファンを生成さ
せ、該反応液からＬ−トリプトファンを採取することを
特徴とするＬ−トリプトファンの製造方が提供される。

【０００７】本発明の方法は、微生物が保持する代謝系
は正常に機能している、すなわち微生物菌体の保持する
エネルギーの共役を伴う酵素反応系は正常に機能してい
るにもかかわらず、該微生物菌体の増殖を全く伴わない
条件を設定し、その条件下でエネルギー共役を伴う酵素
反応を介して効率よくＬ−トリプトファンを製造しよう
というものである。このようなＬ−トリプトファンの製
造法は、従来全く知られていない新規な方法である。

【０００８】以下、本発明の方法をさらに詳細に説明す
る。　　本発明の方法に使用される微生物は、コリネ型
細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ　　ｂａｃｔｅｒｉａ）に
属し、増殖の必須因子としてビオチンを要求し、酵素反
応によってグルコースとインドールからＬ−トリプトフ
ァンを産生する能力を有するものであり、そのような能
力を有するものであればいかなる種の微生物であっても
よく、またそれらの変異株であってもよい。

【０００９】そのような微生物の具体例としては、例え
ば以下のものがあげられる。

【００１０】ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ‐２３３
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９７）、ブレビバクテリウム
・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａ
ｖｕｍ）ＭＪ‐２３３‐ＡＢ‐４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ
‐１４９８）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ‐２３
３‐ＡＢＴ‐１１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１５００）、ブ
レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ‐２３３‐ＡＢＤ‐２１
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９９）、ブレビバクテリウム
・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ６８７１）、
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（Ａ
ＴＣＣ１３７４５、ブレビバクテリウム・デバリカツム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｄｉｖａｒｉｃａ
ｔｕｍ）（ＡＴＣＣ１４０２０）、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（ＡＴＣＣ１３
８６９）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）
（ＡＴＣＣ２１２９６）、コリネバクテリウム・グルタ
ミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ３１８３０）など。

【００１１】上記した微生物の中で、ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ‐２３３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９
７；この微生物の詳細については特公昭５７‐２６７５
５号公報を参照されたい）並びに本菌より得られた変異
株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ‐２３３‐
ＡＢ‐４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９８）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ‐２３３‐ＡＢＤ‐２１（Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９９）及びブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ‐２３３‐ＡＢＴ‐１１（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ‐１５００）が本発明の方法に特に好適に用いられる
。

【００１２】なお、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ‐２３３‐ＡＢ‐４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４
９８）は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ‐２３３
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９７）を親株としてＤＬ−α
‐アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノール資化
性微生物であり（特公昭５９‐２８３９８号公報参照）
、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ‐２３３‐ＡＢＴ
‐１１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１５００）は、ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ‐２３３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐
１４９７）を親株としたＬ−α‐アミノ酪酸トランスア
ミナーゼ高活性異変株であり（特開昭６２‐５１９９８
号公報参照）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ‐２
３３‐ＡＢＤ‐２１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９９）は
、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ‐２３３（ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ‐１４９７）を親株としたＤ‐α‐アミノ酪
酸デアミナーゼ高活性異変株である（特開昭６１−１７
７９９３号公報参照）。

【００１３】本発明の方法に使用される上記のコリネ型
細菌に属するビオチン要求性微生物菌体の調製に使用す
る培地は、特に制限されるものではなく、増殖の必須因
子であるビオチンを含有する一般の微生物に使用される
と同様の培地を使用することができ、通常用いられる炭
素源、窒素源、無機塩、成長促進物質等の栄養分を適宜
配合して調製することができる。

【００１４】微生物菌体の調製に使用しうる培地の炭素
源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フ
ラクトース、マルトース、廃糖密等の炭水化物；ピルビ
ン酸、フマール酸、乳酸、コハク酸等の各種の有機酸な
どが使用でき、さらに微生物の資化性によって、エタノ
ール、メタノール等のアルコール類；炭化水素等も用い
ることができる。これらの炭素源の中でグルコースを主
炭素源として用いるのが特に好ましい。

【００１５】培地の窒素源としては、例えば、アンモニ
ア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種
の無機および有機アンモニウム塩類；尿素および他の窒
素含有物質；ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン
・スチープ・リカー、カザミノ酸等の窒素含有有機物な
どの種々のものを用いることができる。

【００１６】さらに、無機物としては、例えば、リン酸
一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄、塩化ナトリウム、炭
酸カルシウム等が用いうる。ビタミン、アミノ酸等の成
長促進物質としては、使用する培地の炭素源、窒素源等
によって変え得るが、少なくとも増殖の必須因子である
ビオチンを添加し、また必要に応じてサイアミン等を添
加することができる。

【００１７】培養は通気撹拌培養、振盪培養等の好気的
条件下で行う。培養温度は一般に２０〜４０℃、好まし
くは２５〜３５℃の範囲内とすることができる。培養途
中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近とすること
ができ、培養中のｐＨの調整は酸、アルカリを適宜添加
して行うことができる。

【００１８】培養開始時の炭素源濃度は好ましくは１〜
５重量％、更に好ましくは２〜３重量％の範囲内が適当
である。培養期間は一般に０．５〜３日間、最適期間は
１〜２日間である。

【００１９】本発明の方法を実施する場合、上記の如く
培養することにより得られる培養物から菌体を集め、水
や適当な緩衝液で洗浄した後そのまま使用することがで
きる。あるいは該菌体をそれ自体既知の方法で固定化し
固定化物として使用することができる。微生物菌体の固
定化法としては、例えば、アクリルアミド等の重合性モ
ノマーを用いる方法、アルギン酸塩やカラギーナン等の
適当な担体を用いて不溶化させる方法等が挙げられる。

【００２０】本発明に従う方法においては、上記の如く
調製された微生物菌体またはその固定化物の存在下に、
少なくともグルコースとインドールを含有しかつビオチ
ンを含有しない水性反応液中で、グルコースとインドー
ルがエネルギー共役を伴う酵素反応を介して反応せしめ
られ、Ｌ−トリプトファンが製造される。

【００２１】上記水性反応液中のグルコース濃度は、一
般に０．１〜５．０重量％、好ましくは０．２〜１．０
重量％、さらに好ましくは０．３〜０．８重量％の範囲
内とすることができる。グルコースは反応中上記範囲内
の濃度に維持されるように連続的または間欠的に水性反
応液に添加するのが好ましい。

【００２２】水性反応液中のインドールの濃度は、通常
、０．０１〜０．５重量％、好ましくは０．０２〜０．
３重量％、特に好ましくは０．０３〜０．１５重量％の
範囲内とすることができる。インドールもまた、反応中
上記範囲内の濃度に維持されるように連続的または間欠
的に水性反応液に添加することができる。

【００２３】該水性反応液は、上記のように、グルコー
スとインドールを含有し且つビオチンを実質的に含有し
ない水あるいはリン酸またはトリス塩酸等の緩衝液であ
ることもできるが、好ましくはグルコースとインドール
を含有し且つビオチンを含有しない合成培地が用いられ
る。

【００２４】上記合成培地には、酵母エキス、ペプトン
、コーンスティープリカー等の天然栄養物質を含まない
化学構造が既知の無機窒素源及び／又は無機物を含有す
る水溶液が包含される。本発明において用いうる合成培
地の無機窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム等を例示することができ、また、無機物
としては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄
等を例示することができる。これらの無機窒素源および
無機塩はそれぞれ、単独でまたは２種以上混合して用い
ることができる。

【００２５】これら無機窒素源及び／又は無機塩の水溶
液中における濃度は、微生物菌体の培養に通常使用され
る培地と同程度の範囲でよく、特に限定されるものでは
ないが、水性反応液中のグルコース重量対無機窒素源の
窒素重量の比（以下、これをＣ／Ｎ比と言うことがある
）を通常４〜３０、好ましくは５〜２５の範囲内に設定
して酵素反応を行なうのが適当である。

【００２６】本発明に従う方法において用いられる合成
培地の一例を示すと次のとおりである：（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４　２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４　０．５ｇ／ｌ；Ｋ２Ｈ
ＰＯ４　０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．５
ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ
４・４〜６Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ含有するｐＨ７．６の水
溶液。

【００２７】本発明の方法に使用される合成培地には、
ビオチン又はビオチンを含む天然物は実質的に含有され
ないが、ビオチンの含有されないことの明らかなアミノ
酸、ビタミン、糖類等は添加することはできる。

【００２８】本発明の方法に使用される前記のコリネ型
細菌に属するビオチン要求性の微生物は、ビオチンを実
質的に含まない前記培地中では増殖することができない
。

【００２９】本発明の方法において使用される前記のよ
うにして調製された微生物菌体の使用量は、特に制限さ
れるものではないが、培地の容量を基準にして一般に１
〜５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、好ましくは２〜２０％（ｗ
ｔ／ｖｏｌ）の範囲内の濃度で使用することができる。

【００３０】上記したとおりの組成を有する合成培地中
における該微生物又はその固定化物を用いる酵素反応は
、一般に約２０〜約５０℃、好ましくは約３０〜約４０
℃の温度で通常約１０〜約７２時間行うことができる。

【００３１】この酵素反応は、好気的条件で行うのが好
ましく、該合成培地中の溶存酵素濃度は一般に０．１ｐ
ｐｍ〜３ｐｐｍ、好ましくは０．３〜２ｐｐｍの範囲内
に維持されるように反応系中に空気その他の酵素含有ガ
スを、連続的又は間欠的に供給して溶存酸素濃度を調製
することが好ましい。なお、溶存酵素レベルが３ｐｐｍ
以上では反応原料のインドールが劣化し、反応収量が低
くなる傾向がある。

【００３２】上記の酵素反応によって生成するＬ−トリ
プトファンの合成培地からの分離、精製は、それ自体既
知の通常用いられる方法に従って行なうことができ、例
えば、イオン交換樹脂処理法、晶析法等の方法を適宜組
合せて行うことができる。

【００３３】以上に述べた本発明の方法によれば、従来
の発酵法に比較して、Ｌ−トリプトファンの対原料収率
に優れかつ副生物の産生が少く、高収率でＬ−トリプト
ファンを得ることができる。

【００３４】

【実施例】次に実施例により本発明を更に具体的に説明
する。しかしながら、下記の実施例は本発明について具
体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、こ
れによって本発明の範囲は何ら限定されるものではない
。

【００３５】なお、以下の実施例において、Ｌ−トリプ
トファンの定性は、ペーパークロマトグラフのＲｆ値、
微生物定量法による生物活性値により確認した。定量は
高速液体クロマトグラフィー（島津ＬＣ‐５Ａ）を用い
て行った。また、反応液中のグルコースの定量は、グル
コースアナライザー（東亜電波工業製　　ＧＬＵ‐１）
を用いて行った。下記の実施例において％は特にことわ
らない限り重量％を意味する。

【００３６】実施例１培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、ＫＨ
２ＰＯ４　０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４　０．０５％、Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２
Ｏ　２ｐｐｍ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２ｐｐｍ、Ｍｎ
ＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ４　　７Ｈ
２Ｏ　２ｐｐｍ、ＮａＣｌ　２ｐｐｍ、ビオチン２００
μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣｌ　１００μｇ／ｌ、カザミ
ノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１００ｍｌを５０
０ｍｌ容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７．０
）した後、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ‐２３３（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ１４９７）を植菌し、無菌的にグルコ
ースを５ｇ／ｌの濃度になるように加え、３０℃にて２
日間振盪培養を行った。

【００３７】次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸
アンモニウム２．３％、ＫＨ２ＰＯ４　０．０５％、Ｋ
２ＨＰＯ４　０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．
０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ
４・ｎＨ２Ｏ　２０ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、
チアミン・ＨＣｌ　１００μｇ／ｌ、カザミノ酸０．３
％、酵母エキス０．３％）の１０００ｍｌを２ｌ容通気
撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前記
培養物の２０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、
通気量１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６にて２４時間
培養を行った。

【００３８】培養終了後、培養物５００ｍｌから遠心分
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応
液［（ＮＨ４）２ＳＯ４２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４　　０
．５ｇ／ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２
０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ；チ
アミン‐塩酸１００μｇ／ｌ；（ｐＨ７．６）］１００
０ｍｌに懸濁させ、その懸濁液を２ｌ容通気撹拌槽に仕
込み、グルコース２０ｇとインドール２ｇを添加して、
回転数３００ｐｐｍ、通気量０．１ｖｖｍ、温度３３℃
、ｐＨ７．６にて２４時間反応を行った。

【００３９】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−トリプト
ファンを定量した。

【００４０】この反応終了後の培養液５００ｍｌを、強
酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ‐１Ｂ、三菱
化成製）のカラムに通してＬ−トリプトファンを吸着さ
せ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶出させたのち、
Ｌ−トリプトファン画分を濃縮し、冷エタノールでＬ−
トリプトファンの結晶を析出させた。結果を後に掲げる
第１表に示す。

【００４１】なお、比較例として、反応液にビオチンを
２００μｇ／ｌの濃度で添加して反応を行った以外は上
記と同様に実験を行い、生成したＬ−トリプトファン量
を測定した。その結果を下記第１表に示す。

【００４２】

【表１】＊　　比較例での対グルコース収率

【００４３】

【数１】

【００４４】を１００％とする相対値実施例２実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢ‐４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９８）
を培養し、培養終了後、実施例１と同様の条件にて集菌
して反応させた後、上清液中のＬ−トリプトファンを定
量した。また、実施例１と同様にしてＬ−トリプトファ
ンの結晶を析出させた。さらに、比較例として、反応液
にビオチンを２００μｇ／ｌの濃度で添加して反応を行
つた以外は上記と同様に実験を行い、生成したＬ−トリ
プトフアン量を測定した。その結果を第２表に示す。

【００４５】

【表２】＊　　比較例での対グルコース収率

【００４６】

【数２】

【００４７】を１００％とする相対値実施例３実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢＴ‐１１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１５００
）を培養し培養終了後、実施例１と同様の条件にて集菌
して反応させた後、上清液中のＬ−トリプトファンを定
量した。また、実施例１と同様にしてＬ−トリプトファ
ンの結晶を析出させた。さらに、比較例として、反応液
にビオチンを２００μｇ／ｌの濃度で添加して反応を行
つた以外は上記と同様に実験を行い、生成したＬ−トリ
プトフアン量を測定した。その結果を第３表に示す。

【００４８】

【表３】第　　３　　表＊　　比較例での対グルコース収率

【００４９】

【数３】

【００５０】を１００％とする相対値実施例４実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢＤ‐２１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９９
）を培養し培養終了後、実施例１と同様の条件にて集菌
して反応させた後、上清液中のＬ−トリプトファンを定
量した。また、実施例１と同様にしてＬ−トリプトファ
ンの結晶を析出させた。さらに、比較例として、反応液
にビオチンを２００μｇ／ｌの濃度で添加して反応を行
つた以外は上記と同様に実験を行い、生成したＬ−トリ
プトフアンを定量した。その結果を第４表に示す。

【００５１】

【表４】＊　　比較例での対グルコース収率

【００５２】

【数４】

【００５３】を１００％とする相対値実施例５実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９７）を培養し、培
養終了後、培養物５００ｍｌから遠心分離にて集菌後、
脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液［（ＮＨ４）
２ＳＯ４　２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４　　０．５ｇ／ｌ；
Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　
０．５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ；Ｍ
ｎＳＯ４　４〜６Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ；チアミン‐塩酸
１００μｇ／ｌ；（ｐＨ７．６）］１０００ｍｌに懸濁
後、その懸濁液を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グルコー
スは第５表に示す各実験区の濃度になるように添加し、
さらに、インドール１ｇ添加して、回転数３００ｒｐｍ
、通気量０．１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６にて２
４時間反応を行った。なお、インドールを３時間毎に１
ｇづつ反応開始時の分と合わせて計３ｇ添加した。また
、グルコースをその都度上記の各実験区のグルコース濃
度に達するように間欠的に添加した（但し、全量２０ｇ
止まりとした）。

【００５４】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−トリプト
ファンと残存グルコース量を定量した。また、比較例と
して反応初発にグルコース２０ｇを添加したものを用い
た。その結果を第５表に示す。

【００５５】

【表５】＊　　比較例での対グルコース収率

【００５６】

【数５】

【００５７】を１００％とする相対値実施例６実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢ‐４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９８）
を培養し培養終了後、実施例５と同様の条件にて集菌し
て反応させた後、上清中のＬ−トリプトファンを定量し
た。また、比較例として、反応初発にグルコース２０ｇ
を添加したものを用いた。その結果を第６表に示す。

【００５８】

【表６】＊　　比較例での対グルコース収率

【００５９】

【数６】

【００６０】を１００％とする相対値実施例７実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢＴ‐１１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１５００
）を培養し培養終了後、実施例５同様の条件にて集菌し
て反応させた後、上清中のＬ−トリプトファンを定量し
た。また、比較例として、反応初発にグルコース２０ｇ
を添加したものを用いた。その結果を第７表に示す。

【００６１】

【表７】＊　　比較例での対グルコース収率

【００６２】

【数７】

【００６３】を１００％とする相対値実施例８実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢＤ‐２１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９９
）を培養し培養終了後、実施例５と同様の条件にて集菌
して反応させた後、上清中のＬ−トリプトファンを定量
した。また、比較例として、反応初発にグルコース２０
ｇを添加したものを用いた。その結果を第８表に示す。

【００６４】

【表８】＊　　比較例での対グルコース収率

【００６５】

【数８】

【００６６】を１００％とする相対値実施例９実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９７）を培養し、培
養終了後、培養物５００ｍｌから遠心分離にて集菌後、
脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液［（ＮＨ４）
２ＳＯ４　２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４　　０．５ｇ／ｌ；
Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　
０．５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２　　Ｏ　２０ｐｐｍ
；ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ；チアミン‐
塩酸１００μｇ／ｌ；（ｐＨ７．６）］１０００ｍｌに
懸濁後、その懸濁液を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グル
コース２０ｇと、インドールは第９表に示す各実験区の
インドール濃度になるように該液に添加し、回転数３０
０ｒｐｍ、通気量０．１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．
６にて２４時間反応を行った。なお、反応中インドール
を該反応液に数時間毎に間欠的に添加総量が３ｇになる
まで、その都度第９表に示す各実験区のインドール濃度
に達するように添加した。

【００６７】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−トリプト
ファンを定量した。さらに、比較例として、反応初発に
インドール３ｇを添加したものを用いた。

【００６８】実施例１と同様にしてＬ−トリプトファン
の結晶を析出させた。その結果を第９表に示す。

【００６９】

【表９】実施例１０実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢ‐４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９８）
を培養し培養終了後、実施例９同様の条件にて集菌して
反応させた後、上清中のＬ−トリプトファンを定量した
。さらに、比較例として、反応初発にインドール３ｇを
添加したものを用いた。

【００７０】実施例１と同様にしてＬ−トリプトファン
の結晶を析出させた。その結果を第１０表に示す。

【００７１】

【表１０】実施例１１実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢＴ‐１１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１５００
）を培養し培養終了後、実施例９と同様の条件にて集菌
して反応させた後、上清中のＬ−トリプトファンを定量
した。さらに、比較例として、反応初発にインドール３
ｇを添加したものを用いた。

【００７２】実施例１と同様にしてＬ−トリプトファン
の結晶を析出させた。その結果を第１１表に示す。

【００７３】

【表１１】実施例１２実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢＤ‐２１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９９
）を培養し培養終了後、実施例９と同様の条件にて集菌
して反応させた後、上清中のＬ−トリプトファンを定量
した。また、比較例として、反応初発にインドール３ｇ
を添加したものを用いた。

【００７４】実施例１と同様にしてＬ−トリプトファン
の結晶を析出させた。その結果を第１２表に示す。

【００７５】

【表１２】実施例１３実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３を培養し、培養終了後、培養物１００ｍｌずつ
を遠心分離して集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌
体を反応液［グルコース５０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　　
０．５ｇ／ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ
４・７Ｈ２Ｏ　０．５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　
２０ｐｐｍ；チアミン‐塩酸塩１００μｇ／ｌ；（ｐＨ
８．０）］５０ｍｌに懸濁後インドールを０．１ｇ添加
し、Ｃ／Ｎ比が第１３表に示した実験区になるよう窒素
源を添加した。なお、窒素源として硫酸アンモニウムを
用いた。またｐＨ調整のため、加熱滅菌（１５０℃、５
時間加熱）した炭酸カルシウムを５０ｇ／ｌの濃度で添
加した。反応は５００ｍｌ三角フラスコを用い、３３℃
、回転数２２０ｒｐｍにて、２４時間振盪反応を行つた
。

【００７６】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−トリプト
ファン量及びグルコース残量を定量した。その結果を第
１３表に示す。

【００７７】

【表１３】

【００７８】

【数９】

【００７９】実施例１４実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢ‐４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９８）
を培養し、実施例１３と同様に条件にて反応させた後、
上清液中のＬ−トリプトファンとグルコース残量を定量
した。その結果を第１４表に示す。

【００８０】

【表１４】

【００８１】

【数１０】

【００８２】実施例１５実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢＴ‐１１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１５００
）を培養し、実施例１３と同様の条件にて反応させた後
、上清液中のＬ−トリプトファンとグルコース残量を定
量した。その結果を第１５表に示す。

【００８３】

【表１５】

【００８４】

【数１１】

【００８５】実施例１６実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢＤ‐２１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９９
）を培養し、実施例１３と同様の条件にて反応させた後
、上清液中のＬ−トリプトファンとグルコース残量を定
量した。その結果を第１６表に示す。

【００８６】

【表１６】

【００８７】

【数１２】

【００８８】実施例１７実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９７）を培養し、培
養終了後、培養物５００ｍｌから遠心分離にて集菌後、
脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液［（ＮＨ４）
２ＳＯ４　２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４　　０．５ｇ／ｌ；
Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　
０．５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ；Ｍ
ｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　２０ｐｐｍ；チアミン‐塩酸
１００μｇ／ｌ；（ｐＨ７．６）］１０００ｍｌに懸濁
後、該懸濁液を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グルコース
２０ｇと、インドール２ｇを添加して、回転数３０００
ｒｐｍにて、通気量を調製して、反応液中の溶存酸表濃
度を第１７表の各実験区に示すように変化させ、温度３
３℃、ｐＨ７．６にて２４時間反応を行った。

【００８９】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−トリプト
ファンを定量した。なお、反応液中の溶存酸素濃度は、
醗酵用酸素計［オリエンタル電気（株）製］で測定した
。その結果を第１７表に示す。

【００９０】

【表１７】実施例１８実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢ‐４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９８）
を培養し、培養終了後、実施例１７と同様の条件にて集
菌して反応させた後、上清中のＬ−トリプトファンを定
量した。その結果を第１８表に示す。

【００９１】

【表１８】実施例１９実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢＴ‐１１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１５００
）を培養し、培養終了後、実施例１７と同様の条件にて
集菌して反応させた後、上清中のＬ−トリプトファンを
定量した。その結果を第１９表に示す。

【００９２】

【表１９】実施例２０実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ
‐２３３‐ＡＢＤ‐２１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ‐１４９９
）を培養し培養終了後、実施例１７と同様の条件にて集
菌して反応させた後、上清中のＬ−トリプトファンを定
量した。その結果を第２０表に示す。

【００９３】

【表２０】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　コリネ型細菌に属するビオチン要求性
微生物菌体またはその固定化物を用い、少くともグルコ
ース及びインドールを含有し且つビオチンを実質的に含
有しない水性反応液中で酵素反応を行ない、該反応液中
にＬ−トリプトファンを生成させ、該反応液からＬ−ト
リプトファンを採取することを特徴とするＬ−トリプト
ファンの製造法。
【請求項２】　　水性反応液中のグルコース濃度を０．
２〜１．０重量％の範囲内に保つようにグルコースを連
続的または間欠的に添加して酵素反を行なう請求項１記
載の方法。
【請求項３】　　水性反応液中のインドール濃度を０．
０３〜０．１５重量％の範囲内に保つようにインドール
を連続的または間欠的に添加して酵素反応を行なう請求
項１記載の方法。
【請求項４】　　水性反応液が合成培地である請求項１
記載の方法。
【請求項５】　　合成培地中の窒素源の窒素重量対グル
コース重量の比を５〜２５の範囲内に維持して酵素反応
を行なう請求項４記載の方法。
【請求項６】　　水性反応液中の溶存酸素濃度を０．１
〜３ｐｐｍの範囲内に維持して酵素反応を行なう請求項
１記載の方法。