JP2721990B2 - Ｌ―イソロイシンの製造法 - Google Patents
Ｌ―イソロイシンの製造法Info
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- JP2721990B2 JP2721990B2 JP2972589A JP2972589A JP2721990B2 JP 2721990 B2 JP2721990 B2 JP 2721990B2 JP 2972589 A JP2972589 A JP 2972589A JP 2972589 A JP2972589 A JP 2972589A JP 2721990 B2 JP2721990 B2 JP 2721990B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、酵素法によるＬ−イソロイシンの製造法に
関するものである。
関するものである。
本発明によれば高収量で効率よくＬ−イソロイシンを
製造することができる。
製造することができる。
Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸として、人間および
動物の栄養上重要な役割りをするアミノ酸であり、医
薬、食品、飼料添加剤等としてその需要が近年急激に増
加しつつある。
動物の栄養上重要な役割りをするアミノ酸であり、医
薬、食品、飼料添加剤等としてその需要が近年急激に増
加しつつある。
Ｌ−イソロイシンの工業的製造法としては、他のアミ
ノ酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合成
法ではＬ体のみの製造は困難であり、主に醗酵法により
生産が行われている。醗酵法としてはDL−α−アミノ酪
酸、スレオニン等のＬ−イソロイシンの前駆物質を使用
する方法（特公昭43−8709号、同40−2880号公報等）、
前駆物質を特に加えない所謂直接醗酵法（特公昭38−70
91号、特開昭49−93586号公報等）がある。一方酵素法
としては、アンモニウムイオンまたはイソロイシン以外
のＬ−若しくはDL−アミノ酸の存在下に、Ｄ−、Ｌ−、
またはDL−α−ケト−β−メチルバレリアン酸からＬ−
イソロイシンを製造する方法（特公昭46−29789号公
報）、アンモニウムイオンまたはイソロイシン以外のＬ
−若しくはDL−アミノ酸の存在下に、Ｄ−イソロイシン
あるいはＤ−アロイソロイシンの単独もしくは混合物、
又はこれらとその光学異性体との適宜混合物に作用させ
てＬ−イソロイシンを製造する方法（特公昭46−29788
号公報）、セラチア（Serratia）属細菌の固定化物を用
いてグルコースとＤ−スレオニンからＬ−イソロイシン
を製造する方法（日本醗酵工学会大会講演要旨集p.47〜
48昭和52年度）等が報告されている。しかしながらこれ
らの方法は、原料費が嵩むとか収率が低い課題を抱えて
いる。
ノ酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合成
法ではＬ体のみの製造は困難であり、主に醗酵法により
生産が行われている。醗酵法としてはDL−α−アミノ酪
酸、スレオニン等のＬ−イソロイシンの前駆物質を使用
する方法（特公昭43−8709号、同40−2880号公報等）、
前駆物質を特に加えない所謂直接醗酵法（特公昭38−70
91号、特開昭49−93586号公報等）がある。一方酵素法
としては、アンモニウムイオンまたはイソロイシン以外
のＬ−若しくはDL−アミノ酸の存在下に、Ｄ−、Ｌ−、
またはDL−α−ケト−β−メチルバレリアン酸からＬ−
イソロイシンを製造する方法（特公昭46−29789号公
報）、アンモニウムイオンまたはイソロイシン以外のＬ
−若しくはDL−アミノ酸の存在下に、Ｄ−イソロイシン
あるいはＤ−アロイソロイシンの単独もしくは混合物、
又はこれらとその光学異性体との適宜混合物に作用させ
てＬ−イソロイシンを製造する方法（特公昭46−29788
号公報）、セラチア（Serratia）属細菌の固定化物を用
いてグルコースとＤ−スレオニンからＬ−イソロイシン
を製造する方法（日本醗酵工学会大会講演要旨集p.47〜
48昭和52年度）等が報告されている。しかしながらこれ
らの方法は、原料費が嵩むとか収率が低い課題を抱えて
いる。
本発明者等は、先にブレビバクテリウム属に属する微
生物菌体の存在下、エタノールおよびα−ケト酪酸を含
有する水溶液を酵素反応させ該溶液中にＬ−イソロイシ
ンを生成せしめるに際し、反応液にピルビン酸又はその
塩を添加する方法を提案している（特願昭62−271180
号）。
生物菌体の存在下、エタノールおよびα−ケト酪酸を含
有する水溶液を酵素反応させ該溶液中にＬ−イソロイシ
ンを生成せしめるに際し、反応液にピルビン酸又はその
塩を添加する方法を提案している（特願昭62−271180
号）。
本発明者等は、ピルビン酸又はその塩に代わる、より
安価な原料等につき鋭意検討した結果、フマル酸又はそ
の塩、Ｌ−又はDL−リンゴ酸又はその塩、オキザロ酢酸
又はその塩等の有機酸あるいは、Ｌ−又はDL−アスパラ
ギン酸又はその塩、Ｌ−又はDL−グルタミン酸又はその
塩等のアミノ酸の添加により高収量でＬいイソロイシン
を生成させることを見出し本発明を完成するに到った。
安価な原料等につき鋭意検討した結果、フマル酸又はそ
の塩、Ｌ−又はDL−リンゴ酸又はその塩、オキザロ酢酸
又はその塩等の有機酸あるいは、Ｌ−又はDL−アスパラ
ギン酸又はその塩、Ｌ−又はDL−グルタミン酸又はその
塩等のアミノ酸の添加により高収量でＬいイソロイシン
を生成させることを見出し本発明を完成するに到った。
本発明はビオチン要求性のブレビバクテリウム（Brev
ibacterium）属に属する微生物菌体又はその固定化物の
存在下、少なくともエタノールとα−ケト酪酸又はその
塩を含有する水溶液中で酵素反応せしめ、水溶液中にＬ
−イソロイシンを生成させるに際し、該水溶液にさらに
上記のα−ケト酪酸以外の有機酸および／又はアミノ酸
を添加することを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法
を提供するものである。
ibacterium）属に属する微生物菌体又はその固定化物の
存在下、少なくともエタノールとα−ケト酪酸又はその
塩を含有する水溶液中で酵素反応せしめ、水溶液中にＬ
−イソロイシンを生成させるに際し、該水溶液にさらに
上記のα−ケト酪酸以外の有機酸および／又はアミノ酸
を添加することを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法
を提供するものである。
なお、上記の本発明において、次の各項記載の態様及
びこれらの組み合わせの態様が好ましい。
びこれらの組み合わせの態様が好ましい。
添加する有機酸（アミノ酸以外のもの）が、フマル酸
又はその塩、リンゴ酸又はその塩、オキザロ酢酸又はそ
の塩或いは乳酸又はその塩である態様。
又はその塩、リンゴ酸又はその塩、オキザロ酢酸又はそ
の塩或いは乳酸又はその塩である態様。
添加するアミノ酸が、Ｌ−アスパラギン酸又はその塩
である態様或いは添加するアミノ酸がＬ−グルタミン酸
又はその塩である態様。
である態様或いは添加するアミノ酸がＬ−グルタミン酸
又はその塩である態様。
微生物がブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacte
rium flavum）MJ−233、同MJ−233−AB−41,同MJ−233
−ABT−11,同MJ−233−ABD−21である態様。
rium flavum）MJ−233、同MJ−233−AB−41,同MJ−233
−ABT−11,同MJ−233−ABD−21である態様。
酵素反応の行われる水溶液がビオチンを含まない態
様。
様。
本発明によれば、有機酸および／又はアミノ酸を酵素
反応水溶液に添加することで、高収量で効率よくＬ−イ
ソロイシンが製造できる。
反応水溶液に添加することで、高収量で効率よくＬ−イ
ソロイシンが製造できる。
本発明の方法において、酵素反応時に用いられるエタ
ノールを含有する水溶液は、醗酵法の場合に用いられる
培地の滅菌等煩雑な操作が必要でないので、生産管理が
容易である。
ノールを含有する水溶液は、醗酵法の場合に用いられる
培地の滅菌等煩雑な操作が必要でないので、生産管理が
容易である。
本発明に使用される微生物は、ビオチン要求性のブレ
ビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するものであ
り、好ましくはエタノール資化性のものである。このな
かにはＬ−イソロイシン生産菌が含まれる。本発明に使
用される微生物菌体としては例えば、ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233〔微工
研条寄第1497号（微工研菌寄 第3068号）〕、ブレビバ
クテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−2
33−AB−41〔微工研条寄第1498号（微工研菌寄 第3812
号）〕、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum）MJ−233−ABT−11〔微工研条寄第1500号
（微工研菌寄 第8423号）〕及びブレビバクテリウム・
フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABD−21
〔微工研条寄第1499号（微工研菌寄 第8055号）〕等で
あり、これらの菌が本発明に好適に用いられる。
ビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するものであ
り、好ましくはエタノール資化性のものである。このな
かにはＬ−イソロイシン生産菌が含まれる。本発明に使
用される微生物菌体としては例えば、ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233〔微工
研条寄第1497号（微工研菌寄 第3068号）〕、ブレビバ
クテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−2
33−AB−41〔微工研条寄第1498号（微工研菌寄 第3812
号）〕、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum）MJ−233−ABT−11〔微工研条寄第1500号
（微工研菌寄 第8423号）〕及びブレビバクテリウム・
フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABD−21
〔微工研条寄第1499号（微工研菌寄 第8055号）〕等で
あり、これらの菌が本発明に好適に用いられる。
なお、上記の（微工研条寄 第1498号）は、（微工研
条寄 第1497号）を親株としDL−α−アミノ酪酸耐性を
積極的に付与されたエタノール資化性微生物である（特
公昭59−28393号公報３〜４欄参照）。（微工研条寄
第1500号）は、（微工研条寄 第1497号）を親株とした
Ｌ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株で
ある（特願昭60−190609号明細書３〜５頁参照）。ま
た、（微工研条寄 第1499号）は（微工研条寄 第1497
号）を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活
性変異株である（特開昭61−177993号公報参照）。
条寄 第1497号）を親株としDL−α−アミノ酪酸耐性を
積極的に付与されたエタノール資化性微生物である（特
公昭59−28393号公報３〜４欄参照）。（微工研条寄
第1500号）は、（微工研条寄 第1497号）を親株とした
Ｌ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株で
ある（特願昭60−190609号明細書３〜５頁参照）。ま
た、（微工研条寄 第1499号）は（微工研条寄 第1497
号）を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活
性変異株である（特開昭61−177993号公報参照）。
これらの微生物の他にブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 6871、
同ATCC 13745、同ATCC 13746、ブレビバクテリウム・デ
バリカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC 14020
等を用いることもできる。
アゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 6871、
同ATCC 13745、同ATCC 13746、ブレビバクテリウム・デ
バリカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC 14020
等を用いることもできる。
本発明に用いられるビオチン要求性のブレビバクテリ
ウム属に属する微生物菌体は、微生物菌体そのままで用
いることもできるし、又これらを公知の方法で固定化し
た固定化物を使用することもできる。この固定化手法と
しては、菌体をアクリルアミド等の重合性モノマーを用
いたり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の適当な
担体に不溶化させる等がある。
ウム属に属する微生物菌体は、微生物菌体そのままで用
いることもできるし、又これらを公知の方法で固定化し
た固定化物を使用することもできる。この固定化手法と
しては、菌体をアクリルアミド等の重合性モノマーを用
いたり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の適当な
担体に不溶化させる等がある。
本発明の方法に使用される上記のビオチン要求性のブ
レビバクテリウム属に属する微生物菌体の調製に使用す
る培地は、特に限定されるものではなく一般の微生物に
使用されるものでよい。中でも好ましいものは、エタノ
ールを主炭素源とする培地である。
レビバクテリウム属に属する微生物菌体の調製に使用す
る培地は、特に限定されるものではなく一般の微生物に
使用されるものでよい。中でも好ましいものは、エタノ
ールを主炭素源とする培地である。
本発明に使用する微生物菌体の調製に使用する培地の
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは
混合して用いることが出来る。
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは
混合して用いることが出来る。
無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
に菌の生育及びＬ−イソロイシン生成に必要であれば、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添
加し用いる。
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
に菌の生育及びＬ−イソロイシン生成に必要であれば、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添
加し用いる。
培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養
温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行う。培養途中
のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行い、培養中
のpHの調製には酸、アルカリを添加して行う。
温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行う。培養途中
のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行い、培養中
のpHの調製には酸、アルカリを添加して行う。
培養開始時のエタノール濃度は好ましくは１〜５容量
％、更に好ましくは２〜３容量％が適する。
％、更に好ましくは２〜３容量％が適する。
培養期間は２〜９日間、最適期間は４〜７日間であ
る。
る。
このようにして得られた培養物から菌体を集めて、水
又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素反応に
使用する。
又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素反応に
使用する。
本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌
体（ここには、その固定化物も含まれる）の存在下、少
なくともエタノールと、α−ケト酪酸を含有する水溶液
に、さらに有機酸および／又はアミノ酸を添加して酵素
反応させる。ここで該水溶液に添加されるエタノールの
濃度は0.5〜40容量％、好ましくは１〜20容量％であ
る。
体（ここには、その固定化物も含まれる）の存在下、少
なくともエタノールと、α−ケト酪酸を含有する水溶液
に、さらに有機酸および／又はアミノ酸を添加して酵素
反応させる。ここで該水溶液に添加されるエタノールの
濃度は0.5〜40容量％、好ましくは１〜20容量％であ
る。
該水溶液は、上記の様にエタノールを含有する水ある
いはリン酸又はトリス塩酸等の緩衝液を用いることもで
きるが、好ましくはエタノールを含み更に窒素あるいは
無機塩類を含む水溶液が用いられる。
いはリン酸又はトリス塩酸等の緩衝液を用いることもで
きるが、好ましくはエタノールを含み更に窒素あるいは
無機塩類を含む水溶液が用いられる。
本発明の方法において、酵素反応系に添加できる窒素
源あるいは無機塩類としては、通常の微生物菌体菌体の
培養に使用される培地に添加されるものから選んで使用
することができる。ただし、この場合、ビオチンを含ま
ないものを用いる必要がある。ビオチンを含有する窒素
源等を使用すると、酵素反応に使用する微生物菌体の増
殖が起こり、このために原料エタノールの使用量が増大
し、副生物のため目的物の分離・精製が煩雑になる等の
問題が生ずる。
源あるいは無機塩類としては、通常の微生物菌体菌体の
培養に使用される培地に添加されるものから選んで使用
することができる。ただし、この場合、ビオチンを含ま
ないものを用いる必要がある。ビオチンを含有する窒素
源等を使用すると、酵素反応に使用する微生物菌体の増
殖が起こり、このために原料エタノールの使用量が増大
し、副生物のため目的物の分離・精製が煩雑になる等の
問題が生ずる。
本発明に用いられる窒素源の具体例としては、アンモ
ニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素源等が例示
でき、また無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リ
ン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガ
ン、硫酸鉄等が例示される。これらの窒素源、無機塩
は、単独でも２種以上混合して用いることもできる。
ニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素源等が例示
でき、また無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リ
ン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガ
ン、硫酸鉄等が例示される。これらの窒素源、無機塩
は、単独でも２種以上混合して用いることもできる。
これら窒素源および／又は無機塩の水溶液としての濃
度は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地と同程
度の範囲でよく、特に限定されない。
度は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地と同程
度の範囲でよく、特に限定されない。
この様な反応液の一例を示すと、(NH4)2SO4 2g/l;KH2
PO4 0.5g/l;K2HPO4 0.5g/l;MgSO4・7H2O 0.5g/l;FeSO4
・7H2O 20ppm;MnSO4・４〜６H2O 20ppm含有するpH7.6の
水溶液がある。
PO4 0.5g/l;K2HPO4 0.5g/l;MgSO4・7H2O 0.5g/l;FeSO4
・7H2O 20ppm;MnSO4・４〜６H2O 20ppm含有するpH7.6の
水溶液がある。
上述の様に、本発明に使用される酵素反応の反応液に
は、ビオチン又はビオチンを含む天然物は含有されな
い。ビオチンの含有されないことの明らかなアミノ酸、
ビタミン、糖類等は添加することができる。
は、ビオチン又はビオチンを含む天然物は含有されな
い。ビオチンの含有されないことの明らかなアミノ酸、
ビタミン、糖類等は添加することができる。
本発明の方法においては、有機酸の具体例としては、
フマル酸、Ｌ−又はDL−リンゴ酸、オキザロ酢酸、Ｌ−
又はDL−乳酸や又はそれらのカルシウム塩、ナトリウム
塩、およびカリウム塩等が例示でき、又アミノ酸として
は、Ｌ−又はDL−アスパラギン酸、Ｌ−又はDL−グルタ
ミン酸又はそれらのカルシウム塩、ナトリウム塩及びカ
リウム塩等が例示される。これらの有機酸、アミノ酸は
単独でも２種以上混合して用いることもできる。
フマル酸、Ｌ−又はDL−リンゴ酸、オキザロ酢酸、Ｌ−
又はDL−乳酸や又はそれらのカルシウム塩、ナトリウム
塩、およびカリウム塩等が例示でき、又アミノ酸として
は、Ｌ−又はDL−アスパラギン酸、Ｌ−又はDL−グルタ
ミン酸又はそれらのカルシウム塩、ナトリウム塩及びカ
リウム塩等が例示される。これらの有機酸、アミノ酸は
単独でも２種以上混合して用いることもできる。
又、有機酸あるいはアミノ酸の酵素反応時の濃度には
特に制限はないが、一般にはそれぞれ0.1〜20％（wt/vo
l）、好ましくは0.5〜10％（wt/vol）の濃度範囲で使用
するのが適当である。
特に制限はないが、一般にはそれぞれ0.1〜20％（wt/vo
l）、好ましくは0.5〜10％（wt/vol）の濃度範囲で使用
するのが適当である。
α−ケト酪酸の反応時の濃度には特に制限はないが、
一般には0.05〜20％（wt/vol）の濃度範囲で使用するの
が適当である。なお、α−ケト酪酸又はその塩の添加
は、一括して添加してもいいし、逐次添加してもかまわ
ない。又、該菌体の使用量も特に制限されるものではな
いが、一般に１〜50％（wt/vol）の濃度で使用すること
が出来る。
一般には0.05〜20％（wt/vol）の濃度範囲で使用するの
が適当である。なお、α−ケト酪酸又はその塩の添加
は、一括して添加してもいいし、逐次添加してもかまわ
ない。又、該菌体の使用量も特に制限されるものではな
いが、一般に１〜50％（wt/vol）の濃度で使用すること
が出来る。
本発明において、酵素反応は、約20〜約50℃、好まし
くは約30〜約40℃の温度で、通常約10〜約72時間行われ
る。
くは約30〜約40℃の温度で、通常約10〜約72時間行われ
る。
上記のような反応方法によって得られる反応液中に生
成したＬ−イソロイシンの分離・精製は、公知のイオン
交換樹脂処理あるいは、沈澱法等により行うことができ
る。
成したＬ−イソロイシンの分離・精製は、公知のイオン
交換樹脂処理あるいは、沈澱法等により行うことができ
る。
以下の実施例において、Ｌ−イソロイシンの定性は、
ペーパークロマトグラフのRf値、電気泳動法法の易動
度、微生物定量法による生物活性値より確認した。定量
はロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）ATCC 8042を用いるマイクロバイオアッ
セイ法と高速液体クロマトグラフィー（島津LC−5A）と
を併用して行った。また、下記の実験例において％と表
したのは重量％を意味する。
ペーパークロマトグラフのRf値、電気泳動法法の易動
度、微生物定量法による生物活性値より確認した。定量
はロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）ATCC 8042を用いるマイクロバイオアッ
セイ法と高速液体クロマトグラフィー（島津LC−5A）と
を併用して行った。また、下記の実験例において％と表
したのは重量％を意味する。
実施例−１ 培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH2PO4
0.05％、K2HPO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、CaCl2・
2H2O 2ppm、FeSO4・7H2O 2ppm、MnSO4・４〜６H2O 2pp
m、ZnSO4・7H2O 2ppm、NaCl 2ppm、ビオチン 200μg/
l、チアミン・HCl 100μg/l、カザミノ酸 0.1g、酵母エ
キス 0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅菌
（滅菌後pH7.0）した後ブレビバクテリウム・フラバム
（Brevibacterium flavum）MJ−233（微工研条寄 第14
97号）を植菌し、無菌的にエタノールを2ml加え、30℃
にて２日間振盪培養を行った。
0.05％、K2HPO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、CaCl2・
2H2O 2ppm、FeSO4・7H2O 2ppm、MnSO4・４〜６H2O 2pp
m、ZnSO4・7H2O 2ppm、NaCl 2ppm、ビオチン 200μg/
l、チアミン・HCl 100μg/l、カザミノ酸 0.1g、酵母エ
キス 0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅菌
（滅菌後pH7.0）した後ブレビバクテリウム・フラバム
（Brevibacterium flavum）MJ−233（微工研条寄 第14
97号）を植菌し、無菌的にエタノールを2ml加え、30℃
にて２日間振盪培養を行った。
次に、本培養培地（硫酸アンモニウム2.3％、KH2PO4
0.05％、K2HPO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、FeSO4・
7H2O 20ppm、MnSO4・４〜６H2O 20ppm、ビオチン200μg
/l、チアミン・HCl100μg/l、カザミノ酸0.3％、酵母エ
キス0.3％）1000mlを2l容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（1
20℃、20分間）後、エタノールの20mlと前記前培養物の
20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温度33
℃pH7.6にて48時間培養を行った。
0.05％、K2HPO4 0.05％、MgSO4・7H2O 0.05％、FeSO4・
7H2O 20ppm、MnSO4・４〜６H2O 20ppm、ビオチン200μg
/l、チアミン・HCl100μg/l、カザミノ酸0.3％、酵母エ
キス0.3％）1000mlを2l容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（1
20℃、20分間）後、エタノールの20mlと前記前培養物の
20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温度33
℃pH7.6にて48時間培養を行った。
なお、エタノールは、培養中培地の濃度が２容量％を
越えないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。
越えないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。
培養終了後、培養物500mlから遠心分離にて集菌し
た。これを脱塩蒸溜水にて２度洗浄して得た菌体を、反
応液〔(NH4)2SO4 2.3％；KH2PO4 0.05％；K2HPO4 0.05
％；MgSO4・7H2O 0.05％；FeSO4・7H2O 20ppm;MnSO4・
４〜６H2O 20ppm;チアミン・塩酸100μg/l;α−ケト酪
酸ナトリウム1.0％（pH7.6）〕1,000mlに懸濁後、該懸
濁液を2l容通気攪拌槽に仕込み、これに更にエタノール
20ml及び第１表に示した各有機酸、アミノ酸をそれぞれ
10g/l添加して、回転数300rpm、温度33℃、pH7.6にて15
時間反応を行った。この時の反応液中の溶存酸素濃度は
0.1ppmに保たれた。
た。これを脱塩蒸溜水にて２度洗浄して得た菌体を、反
応液〔(NH4)2SO4 2.3％；KH2PO4 0.05％；K2HPO4 0.05
％；MgSO4・7H2O 0.05％；FeSO4・7H2O 20ppm;MnSO4・
４〜６H2O 20ppm;チアミン・塩酸100μg/l;α−ケト酪
酸ナトリウム1.0％（pH7.6）〕1,000mlに懸濁後、該懸
濁液を2l容通気攪拌槽に仕込み、これに更にエタノール
20ml及び第１表に示した各有機酸、アミノ酸をそれぞれ
10g/l添加して、回転数300rpm、温度33℃、pH7.6にて15
時間反応を行った。この時の反応液中の溶存酸素濃度は
0.1ppmに保たれた。
各反応終了後、遠心分離（4,000rpm、15分間、４℃）
にて除菌した上清液中のＬ−イソロイシンを定量した。
にて除菌した上清液中のＬ−イソロイシンを定量した。
また、各反応終了後の培養液500mlを、それぞれ強酸
性イオン交換樹脂（H+型）のカラムに通してＬ−イソロ
イシンを吸着させ、水洗後、0.5規定アンモニア水で溶
出させたのち、Ｌ−イソロイシン画分を濃縮し、冷エタ
ノールでＬ−イソロイシンの結晶を析出させた。結果を
第１表に示した。
性イオン交換樹脂（H+型）のカラムに通してＬ−イソロ
イシンを吸着させ、水洗後、0.5規定アンモニア水で溶
出させたのち、Ｌ−イソロイシン画分を濃縮し、冷エタ
ノールでＬ−イソロイシンの結晶を析出させた。結果を
第１表に示した。
なお、有機酸、アミノ酸を添加しない反応液を用いた
場合には、Ｌ−イソロイシンの生成は3.4g/lであった。
場合には、Ｌ−イソロイシンの生成は3.4g/lであった。
実施例−２ 実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−AB−41（微
工研条寄 第1498号）を培養し、また実施例−１と同様
の条件にてそれぞれ反応させた後、上清液中のＬ−イソ
ロイシンをそれぞれ定量した。また、実施例−１と同様
にしてＬ−イソロイシンの結晶を析出させた。結果は第
２表に示した。
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−AB−41（微
工研条寄 第1498号）を培養し、また実施例−１と同様
の条件にてそれぞれ反応させた後、上清液中のＬ−イソ
ロイシンをそれぞれ定量した。また、実施例−１と同様
にしてＬ−イソロイシンの結晶を析出させた。結果は第
２表に示した。
なお、有機酸、アミノ酸、を添加しない反応液を用い
た場合には、Ｌ−イソロイシンの生成は3.5g/lであっ
た。
た場合には、Ｌ−イソロイシンの生成は3.5g/lであっ
た。
実施例−３ 実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABT−11
（微工研条寄 第1500号）を培養し、また実施例−１と
同様の条件にてそれぞれ反応させた後、上清液中のＬ−
イソロイシンをそれぞれ定量した。また、実施例−１と
同様にしてＬ−イソロイシンの結晶を析出させた。結果
は第３表に示した。
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABT−11
（微工研条寄 第1500号）を培養し、また実施例−１と
同様の条件にてそれぞれ反応させた後、上清液中のＬ−
イソロイシンをそれぞれ定量した。また、実施例−１と
同様にしてＬ−イソロイシンの結晶を析出させた。結果
は第３表に示した。
なお、有機酸、アミノ酸、を添加しない反応液を用い
た場合には、Ｌ−イソロイシンの生成は3.4g/lであっ
た。
た場合には、Ｌ−イソロイシンの生成は3.4g/lであっ
た。
実施例−４ 実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABD−21
（微工研条寄 第1499号）を培養し、また実施例−１と
同様の条件にてそれぞれ反応させた後、上清液中のＬ−
イソロイシンをそれぞれ定量した。また、実施例−１と
同様にしてＬ−イソロイシンの結晶を析出させた。結果
を第４表に示した。
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABD−21
（微工研条寄 第1499号）を培養し、また実施例−１と
同様の条件にてそれぞれ反応させた後、上清液中のＬ−
イソロイシンをそれぞれ定量した。また、実施例−１と
同様にしてＬ−イソロイシンの結晶を析出させた。結果
を第４表に示した。
なお、有機酸、アミノ酸、を添加しない反応液を用い
た場合には、Ｌ−イソロイシンの生成は3.4g/lであっ
た。
た場合には、Ｌ−イソロイシンの生成は3.4g/lであっ
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 寺沢 真人 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Br
evibacterium）属に属する微生物菌体又はその固定化物
の存在下、少なくともエタノールとα−ケト酪酸又はそ
の塩を含有する水溶液中で酵素反応せしめ、水溶液中に
Ｌ−イソロイシンを生成させるに際し、該水溶液にさら
に上記のα−ケト酪酸以外の有機酸および／又はアミノ
酸を添加することを特徴とするＬ−イソロイシンの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2972589A JP2721990B2 (ja) | 1989-02-10 | 1989-02-10 | Ｌ―イソロイシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2972589A JP2721990B2 (ja) | 1989-02-10 | 1989-02-10 | Ｌ―イソロイシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02211886A JPH02211886A (ja) | 1990-08-23 |
| JP2721990B2 true JP2721990B2 (ja) | 1998-03-04 |
Family
ID=12284086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2972589A Expired - Lifetime JP2721990B2 (ja) | 1989-02-10 | 1989-02-10 | Ｌ―イソロイシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2721990B2 (ja) |
-
1989
- 1989-02-10 JP JP2972589A patent/JP2721990B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02211886A (ja) | 1990-08-23 |
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