JPH0672945A - Ｄ−リンゴ酸製造法 - Google Patents
Ｄ−リンゴ酸製造法Info
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- JPH0672945A JPH0672945A JP13633191A JP13633191A JPH0672945A JP H0672945 A JPH0672945 A JP H0672945A JP 13633191 A JP13633191 A JP 13633191A JP 13633191 A JP13633191 A JP 13633191A JP H0672945 A JPH0672945 A JP H0672945A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 フマラーゼ活性およびアスパルターゼ活性を
有する微生物菌体又はその処理物を、ＤＬ−リンゴ酸を
含有する反応液に作用させて、Ｌ−リンゴ酸を酵素法に
よりＬ−アスパラギン酸に変換し、これよりＤ−リンゴ
酸を採取する方法。 【効果】 安価なＤＬ−リンゴ酸より、効率良くＤ−リ
ンゴ酸を製造することができる。
有する微生物菌体又はその処理物を、ＤＬ−リンゴ酸を
含有する反応液に作用させて、Ｌ−リンゴ酸を酵素法に
よりＬ−アスパラギン酸に変換し、これよりＤ−リンゴ
酸を採取する方法。 【効果】 安価なＤＬ−リンゴ酸より、効率良くＤ−リ
ンゴ酸を製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素法によるＤ−リン
ゴ酸の高効率な製造法に関する。本発明によれば、ＤＬ
−リンゴ酸中のＬ−リンゴ酸をＬ−アスパラギン酸に変
換するため、Ｄ−リンゴ酸の分離が容易になり、Ｄ−リ
ンゴ酸を高純度、高収量で採取することが可能である。
ゴ酸の高効率な製造法に関する。本発明によれば、ＤＬ
−リンゴ酸中のＬ−リンゴ酸をＬ−アスパラギン酸に変
換するため、Ｄ−リンゴ酸の分離が容易になり、Ｄ−リ
ンゴ酸を高純度、高収量で採取することが可能である。
【０００２】Ｄ−リンゴ酸は、医薬、農薬等の中間体原
料として、産業上重要な化合物として期待されている。
料として、産業上重要な化合物として期待されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】Ｄ−リンゴ酸の工業的
製法は、これまでほとんど知られていない。本発明者ら
は、酵素法によるＤ−リンゴ酸製造プロセスの開発につ
いて鋭意検討を行い、安価なＤＬ−リンゴ酸より効率良
くＤ−リンゴ酸を製造する方法を見い出し、本発明を完
成するに至った。
製法は、これまでほとんど知られていない。本発明者ら
は、酵素法によるＤ−リンゴ酸製造プロセスの開発につ
いて鋭意検討を行い、安価なＤＬ−リンゴ酸より効率良
くＤ−リンゴ酸を製造する方法を見い出し、本発明を完
成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、フマラーゼ活
性およびアスパルターゼ活性を有する微生物菌体又はそ
の処理物を、ＤＬ−リンゴ酸を含有する反応液に作用さ
せて、Ｌ−リンゴ酸をまずフマラーゼによりフマル酸へ
変換した後、アスパルターゼによりＬ−アスパラギン酸
へと変換し、生成したＬ−アスパラギン酸と未反応Ｄ−
リンゴ酸を分離することにより、高収量でＤ−リンゴ酸
を採取する方法を提供するものである。この方法によれ
ば、効率良く高純度のＤ−リンゴ酸を製造することがで
きる。
性およびアスパルターゼ活性を有する微生物菌体又はそ
の処理物を、ＤＬ−リンゴ酸を含有する反応液に作用さ
せて、Ｌ−リンゴ酸をまずフマラーゼによりフマル酸へ
変換した後、アスパルターゼによりＬ−アスパラギン酸
へと変換し、生成したＬ−アスパラギン酸と未反応Ｄ−
リンゴ酸を分離することにより、高収量でＤ−リンゴ酸
を採取する方法を提供するものである。この方法によれ
ば、効率良く高純度のＤ−リンゴ酸を製造することがで
きる。
【０００５】本発明に使用する微生物菌体としては、フ
マラーゼ活性およびアスパルターゼ活性を有する菌体、
例えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
umuflavum) ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）、同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９８），エシェリヒア・コリ（Escherichia coli)
ＡＴＣＣ ２７３２５，エシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli) Ｂ ＡＴＣＣ１１３０３等が好適に用いられ
る。
マラーゼ活性およびアスパルターゼ活性を有する菌体、
例えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
umuflavum) ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）、同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９８），エシェリヒア・コリ（Escherichia coli)
ＡＴＣＣ ２７３２５，エシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli) Ｂ ＡＴＣＣ１１３０３等が好適に用いられ
る。
【０００６】本発明に用いられる上記微生物は、菌体の
まま用いることもできるし、超音波破砕等の処理により
破砕した菌体の破砕物をも使用することができる。ま
た、菌体又は菌体破砕物をポリアクリルアミド、アルギ
ン酸、κ−カラギーナン等の適当な固定化剤に固定化し
て使用することもできる。
まま用いることもできるし、超音波破砕等の処理により
破砕した菌体の破砕物をも使用することができる。ま
た、菌体又は菌体破砕物をポリアクリルアミド、アルギ
ン酸、κ−カラギーナン等の適当な固定化剤に固定化し
て使用することもできる。
【０００７】本発明の方法に使用される上記微生物菌体
の調製に使用する培地は、特に限定されるものではなく
一般の微生物に使用されるものでよい。例えばブレビバ
クテリウム（Brevibacteriumu)属に属する微生物では、
培地の炭素源としては、例えば、グルコース、エタノー
ル、フマル酸、リンゴ酸等が使用できる。培地の窒素源
としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機塩を用いるこ
とができるし、また、ペプトン、酵母エキス、コーンス
チーブリカー、カザミノ酸等の有機栄養素源も使用する
ことができる。無機塩としては、リン酸一水素カリウ
ム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用い
られる。
の調製に使用する培地は、特に限定されるものではなく
一般の微生物に使用されるものでよい。例えばブレビバ
クテリウム（Brevibacteriumu)属に属する微生物では、
培地の炭素源としては、例えば、グルコース、エタノー
ル、フマル酸、リンゴ酸等が使用できる。培地の窒素源
としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機塩を用いるこ
とができるし、また、ペプトン、酵母エキス、コーンス
チーブリカー、カザミノ酸等の有機栄養素源も使用する
ことができる。無機塩としては、リン酸一水素カリウ
ム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用い
られる。
【０００８】培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で
行い、培養温度は２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜
３７℃である。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは
７〜８付近であり、培養中のｐＨの調整には、酸又はア
ルカリを添加して行う。培養開始時の培地中の炭素源の
濃度は０．０５〜１０重量％であり、例えば、グルコー
スを使用する場合、グルコース濃度は、好ましくは、
０．０５〜１．０重量％、さらに好ましくは０．１〜
０．３重量％が適する。培養期間は１０時間〜４日間、
最適期間は１５時間〜３日間である。
行い、培養温度は２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜
３７℃である。培養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは
７〜８付近であり、培養中のｐＨの調整には、酸又はア
ルカリを添加して行う。培養開始時の培地中の炭素源の
濃度は０．０５〜１０重量％であり、例えば、グルコー
スを使用する場合、グルコース濃度は、好ましくは、
０．０５〜１．０重量％、さらに好ましくは０．１〜
０．３重量％が適する。培養期間は１０時間〜４日間、
最適期間は１５時間〜３日間である。
【０００９】このようにして得られた培養物から菌体を
集めて、水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の酵素反
応に使用する。
集めて、水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の酵素反
応に使用する。
【００１０】本発明の方法においては、上記で調製され
た微生物菌体又はその破砕物又はその固定化物の存在
下、ＤＬ−リンゴ酸を含有する水溶液を酵素反応させ
る。
た微生物菌体又はその破砕物又はその固定化物の存在
下、ＤＬ−リンゴ酸を含有する水溶液を酵素反応させ
る。
【００１１】ここで、該水溶液中に含有するＤＬ−リン
ゴ酸の濃度は０．３〜４モル／１０００ml、好ましくは
０．５〜２モル／１０００mlである。
ゴ酸の濃度は０．３〜４モル／１０００ml、好ましくは
０．５〜２モル／１０００mlである。
【００１２】反応液のｐＨの調整は、アンモニア水を用
いて行う。これは反応液中に生成したフマル酸とアンモ
ニアから、Ｌ−アスパラギン酸を生成させるためであ
る。なお、必要に応じて、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム等のアンモニウム塩を添加することができる。
いて行う。これは反応液中に生成したフマル酸とアンモ
ニアから、Ｌ−アスパラギン酸を生成させるためであ
る。なお、必要に応じて、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム等のアンモニウム塩を添加することができる。
【００１３】反応時のｐＨは６〜１０、好ましくは８〜
９であり、反応温度は、３０〜５０℃、好ましくは、３
５〜４６℃である。反応時間は通常約３〜４８時間であ
る。
９であり、反応温度は、３０〜５０℃、好ましくは、３
５〜４６℃である。反応時間は通常約３〜４８時間であ
る。
【００１４】なお、反応に微生物菌体をそのまま使用す
る場合には、菌体の膜透過性を向上させるため、非イオ
ン性の界面活性剤等を添加することができる。
る場合には、菌体の膜透過性を向上させるため、非イオ
ン性の界面活性剤等を添加することができる。
【００１５】上記のような反応方法によって得られる反
応液中に生成したＤ−リンゴ酸およびＬ−アスパラギン
酸は、該反応液を遠心分離により除菌した後、上澄液に
存在するＬ−アスパラギン酸を常法通り等電点沈殿法に
より沈殿分離する。該残液から通常のイオン交換法等に
よりＤ−リンゴ酸を回収することができる。
応液中に生成したＤ−リンゴ酸およびＬ−アスパラギン
酸は、該反応液を遠心分離により除菌した後、上澄液に
存在するＬ−アスパラギン酸を常法通り等電点沈殿法に
より沈殿分離する。該残液から通常のイオン交換法等に
よりＤ−リンゴ酸を回収することができる。
【００１６】本発明の方法によれば、Ｄ−リンゴ酸は理
論値の８０％以上の回収率で回収できる。
論値の８０％以上の回収率で回収できる。
【００１７】
【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明する。
以下の実施例におけるＤ−リンゴ酸量の測定は、高速液
体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を用いて行っ
た。また、Ｄ−リンゴ酸の光学純度は比旋光度により確
認した。
以下の実施例におけるＤ−リンゴ酸量の測定は、高速液
体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を用いて行っ
た。また、Ｄ−リンゴ酸の光学純度は比旋光度により確
認した。
【００１８】参考例 アスパルターゼおよびフマラーゼ含有菌体の調製 培地（尿素 ０．４％、硫酸アンモニウム １．４％、
ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０５％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．０５
％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＣａＣｌ2 ・
２Ｈ2 Ｏ ２ppm 、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２ppm 、Ｍ
ｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ２ppm 、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ ２ppm 、ＮａＣｌ ２ppm 、ビオチン２００μｇ／
１０００ml、チアミン・ＨＣｌ １００μｇ／１０００
ml、カザミノ酸 ０．１％および酵母エキス ０．１
％）１００mlを５００ml容三角フラスコに分注し、滅菌
（滅菌後ｐＨ７．０）した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３−ＡＢ−
４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）を植菌し、無菌的に
５０（Ｗ／Ｖ）％グルコースを２ml加え、３０℃にて２
日間振盪培養を行った。
ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０５％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．０５
％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＣａＣｌ2 ・
２Ｈ2 Ｏ ２ppm 、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２ppm 、Ｍ
ｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ２ppm 、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ ２ppm 、ＮａＣｌ ２ppm 、ビオチン２００μｇ／
１０００ml、チアミン・ＨＣｌ １００μｇ／１０００
ml、カザミノ酸 ０．１％および酵母エキス ０．１
％）１００mlを５００ml容三角フラスコに分注し、滅菌
（滅菌後ｐＨ７．０）した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３−ＡＢ−
４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）を植菌し、無菌的に
５０（Ｗ／Ｖ）％グルコースを２ml加え、３０℃にて２
日間振盪培養を行った。
【００１９】次に、本培養培地（硫酸アンモニウム
２．３％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０５％、Ｋ2 ＨＰＯ4
０．０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、Ｆｅ
ＳＯ4・７Ｈ2 Ｏ ２０ppm 、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2
Ｏ ２０ppm 、ビチオン ２００μｇ／１０００ml、チ
アミン・ＨＣｌ １００μｇ／１０００ml、カザミノ酸
０．３％および酵母エキス ０．３％）１０００mlを２
０００ml容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０
分間）後、無菌的に５０（Ｗ／Ｖ）％グルコース２０ml
と前記培養物の２０mlを添加して、回転数１０００rpm
、通気量１vvm、温度３３℃、ｐＨ７．６にて１５時間
培養を行った。
２．３％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０５％、Ｋ2 ＨＰＯ4
０．０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、Ｆｅ
ＳＯ4・７Ｈ2 Ｏ ２０ppm 、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2
Ｏ ２０ppm 、ビチオン ２００μｇ／１０００ml、チ
アミン・ＨＣｌ １００μｇ／１０００ml、カザミノ酸
０．３％および酵母エキス ０．３％）１０００mlを２
０００ml容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０
分間）後、無菌的に５０（Ｗ／Ｖ）％グルコース２０ml
と前記培養物の２０mlを添加して、回転数１０００rpm
、通気量１vvm、温度３３℃、ｐＨ７．６にて１５時間
培養を行った。
【００２０】なお、グルコースは、培養中の培地の濃度
が１（Ｗ／Ｖ）％をこえないように、５０（Ｗ／Ｖ）％
グルコースを約１〜２時間ごと断続的に添加した。
が１（Ｗ／Ｖ）％をこえないように、５０（Ｗ／Ｖ）％
グルコースを約１〜２時間ごと断続的に添加した。
【００２１】培養終了後、培養物１０００mlから遠心分
離により集菌した。
離により集菌した。
【００２２】実施例 上記参考例で得た集菌体を反応液［ＤＬ−リンゴ酸 ５
０ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
０．８ｇ／蒸留水１０００ml（２５％アンモニア水でｐ
Ｈを８．０に調整）］１０００mlに懸濁し、４５℃にて
２４時間振盪反応させた。反応終了後、遠心分離（８０
００rpm 、４０分間、２℃）にて上澄液と菌体を分離し
た。
０ｇ、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
０．８ｇ／蒸留水１０００ml（２５％アンモニア水でｐ
Ｈを８．０に調整）］１０００mlに懸濁し、４５℃にて
２４時間振盪反応させた。反応終了後、遠心分離（８０
００rpm 、４０分間、２℃）にて上澄液と菌体を分離し
た。
【００２３】該上澄液１００mlに３６Ｎ−Ｈ2 ＳＯ4 溶
液を添加してｐＨを２．８に調整後、析出した沈殿物を
遠心分離（８０００rpm ，４０分間、２℃）後、上澄液
中のリンゴ酸量を測定したところ２．２mg/ml であっ
た。さらに該溶液を強塩基性樹脂（ローム・アンド・ハ
ース社製「アンバーライトＩＲＡ−４００」、Ｒ2 ＣＯ
3 型）を充填したカラムに通し、リンゴ酸を樹脂に吸着
させた。次に１Ｎ−炭酸アンモニウムにて溶出後濃縮
し、Ｌ−リンゴ酸の粗結晶を析出させた。これをアセト
ンで洗浄し、乾燥させた。回収したリンゴ酸結晶につい
て比旋光度を測定したところ［α］D 20 ＝＋２．２°
（ｃ＝８．５，Ｈ2 Ｏ）であった。
液を添加してｐＨを２．８に調整後、析出した沈殿物を
遠心分離（８０００rpm ，４０分間、２℃）後、上澄液
中のリンゴ酸量を測定したところ２．２mg/ml であっ
た。さらに該溶液を強塩基性樹脂（ローム・アンド・ハ
ース社製「アンバーライトＩＲＡ−４００」、Ｒ2 ＣＯ
3 型）を充填したカラムに通し、リンゴ酸を樹脂に吸着
させた。次に１Ｎ−炭酸アンモニウムにて溶出後濃縮
し、Ｌ−リンゴ酸の粗結晶を析出させた。これをアセト
ンで洗浄し、乾燥させた。回収したリンゴ酸結晶につい
て比旋光度を測定したところ［α］D 20 ＝＋２．２°
（ｃ＝８．５，Ｈ2 Ｏ）であった。
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、ＤＬ−リンゴ酸より、
効率良くＤ−リンゴ酸を分離、採取することができる。
効率良くＤ−リンゴ酸を分離、採取することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 フマラーゼ活性およびアスパルターゼ活
性を有する微生物菌体又はその処理物を、ＤＬ−リンゴ
酸を含有する反応液に作用させてＬ−リンゴ酸を酵素法
によりＬ−アスパラギン酸に変換し、これよりＤ−リン
ゴ酸を採取することを特徴とするＤ−リンゴ酸の製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13633191A JPH0672945A (ja) | 1991-06-07 | 1991-06-07 | Ｄ−リンゴ酸製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13633191A JPH0672945A (ja) | 1991-06-07 | 1991-06-07 | Ｄ−リンゴ酸製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0672945A true JPH0672945A (ja) | 1994-03-15 |
Family
ID=15172725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13633191A Pending JPH0672945A (ja) | 1991-06-07 | 1991-06-07 | Ｄ−リンゴ酸製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0672945A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006254795A (ja) * | 2005-03-17 | 2006-09-28 | Shimane Univ | アスパラギン酸脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、ｌ−アスパラギン酸製造方法、および、ｄ−リンゴ酸製造方法 |
-
1991
- 1991-06-07 JP JP13633191A patent/JPH0672945A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006254795A (ja) * | 2005-03-17 | 2006-09-28 | Shimane Univ | アスパラギン酸脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、ｌ−アスパラギン酸製造方法、および、ｄ−リンゴ酸製造方法 |
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