JP3012990B2 - Ｄ―アスパラギン酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 イ．発明の目的 （産業上の利用分野） 本発明は、化学合成法および酵素反応法の融合技術に
よるＤ−アスパラギン酸の製造法に関するものである。
本発明によれば高収量で効率良くＤ−アスパラギン酸を
製造することが出来る。

Ｄ−アスパラギン酸は、周知の如く、医薬、農薬等の
中間原料として重要なアミノ酸であり、その需要が近年
増加しつつある。

（従来の技術と課題） Ｄ−アスパラギン酸のの工業的製法としては、DL−ア
スパラギン酸の酵素的脱炭酸によりＬ−アスパラギン酸
からＬ−アラニンを生成せしめ、その後未反応Ｄ−アス
パラギン酸とＬ−アラニンとを分離してＤ−アスパラギ
ン酸を製造する方法（特公昭53−1831号公報）が提案さ
れている。

しかしこの製造法では、DL−アスパラギン酸からのＤ
−アスパラギン酸の収量は50％であること、またＤ−ア
スパラギン酸の生産量はＬ−アラニンの需要により制約
を受けること等の問題があり、Ｄ−アスパラギン酸のよ
り効果的な製造法の開発が望まれていた。

本発明者らは、Ｄ−アスパラギン酸の高効率製造プロ
セスの開発につき鋭意検討を行い、化学合成法と酵素反
応法とを組み合せた融合技術により安価なフマル酸より
高効率にＤ−アスパラギン酸を製造する方法を見いだし
本発明を完成するに到った。

（発明の構成及び効果） 本発明は以下の〜の工程を順に繰り返すことによ
り、効率良くＤ−アスパラギン酸を製造する方法を提供
するものである。

フマル酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウム
イオンを水性溶媒中100℃以上の温度で加熱処理するこ
とにより化学合成法によりDL−アスパラギン酸を製造す
る。

DL−アスパラギン酸にアスパルターゼを含有する微
生物又はその処理物を作用させて、Ｌ−アスパラギン酸
のみをフマル酸とアンモニアに分解する。

クロマト分離により未反応Ｄ−アスパラギン酸とフ
マル酸とを分離する。

分離したフマル酸は再度の工程に供する。

本発明によれば、Ｄ−アスパラギン酸をフマル酸から
高効率に製造することができる。

（発明の具体的な説明） 本発明は前記〜の４工程から成り、「工程」で
は、フマル酸又はその塩およびアンモニア又はアンモニ
ウムイオンの存在下、100〜170℃、好ましくは、130〜1
60℃で加熱処理することにより効率良くDL−アスパラギ
ン酸を製造する。

フマル酸又はその塩の仕込み濃度は、0.5〜５モル／
、好ましくは、１〜３モル／である。また、アンモ
ニア又はアンモニウムイオンの仕込み濃度は、0.5〜10
モル／、好ましくは１〜７モル／である。反応時の
pHは６〜11、好ましくは８〜10である。また、反応時間
は、１〜48時間、好ましくは、２〜24時間である。

工程で使用する微生物としては、アスパルターゼを
含有する微生物であれば限定されるものではないが、例
えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium
u flavum）MJ−233（FERM BP−1497）、同MJ−233−AB
−41（FERM BP−1498）、エシェリヒア・コリ（Escher
ichia coli）ATCC 27325、エシェリヒア・コリ（Esche
richia coli）Ｂ ATCC 11303等が好適に用いられる。

本発明に用いられる上記微生物は、菌体のまま用いる
ことも出来るし、超音波破砕等の処理により破砕した菌
体の破砕物をも使用することが出来る。また、菌体又は
菌体破砕物をポリアクリルアミド、アルギン酸、κ−カ
ラギーナン等の適当な固定化剤に固定化して使用するこ
とも出来る。

本発明の方法に使用される上記微生物菌体の調製に使
用する培地は、特に限定されるものではなく一般の微生
物に使用されるものでよい。例えばブレビバクテリウム
（Brevibacteriumu）属に属する微生物では、培地の炭
素源としては、例えば、グルコース、エタノール、フマ
ル酸、リンゴ酸等が使用出来る。培地の窒素源として
は、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機塩を用いることが
出来るし、また、ペプトン、酵母エキス、コーンスチー
プリカー、カザミノ酸等の有機栄養源も使用することが
出来る。無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リン
酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養
温度は20℃〜40℃、好ましくは38℃〜37℃で行う。培養
途中のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行い、培
養中のpHの調整には、酸又はアルカリを添加して行う。
培養開始時の培地中の炭素源の濃度は0.05〜10重量％が
用いられ、具体例としてグルコースを使用する場合、グ
ルコース濃度は、好ましくは0.05〜1.0重量％、更に好
ましくは0.1〜0.3重量％が適する。培養期間は10時間〜
４日間、最適期間は15時間〜３日間である。

このようにして得られた培養物から各々菌体を集め
て、水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の酵素反応に
使用する。

本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌
体又はその破砕物又はその固定化物の存在下、水性溶媒
中で前記工程で生成したDL−アスパラギン酸を含有す
る水溶液にて酵素反応せしめる。

ここで該水溶液中に含有するDL−アスパラギン酸の濃
度は0.3〜４モル／、好ましくは１〜２モル／であ
る。

なお、DL−アスパラギン酸は、反応液への溶解度の関
係から溶解さそた状態でも粉体で存在（不溶解状態）し
ていてもさしつかえない。反応液のpHの調整はアルカリ
溶液、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水
溶液が好適に使用される。なお、反応は、アスパルター
ゼ活性の低下を防ぐ為、必要によって窒素ガス等の不活
性ガスを通気して行う。本発明において、酵素反応時の
pHは７〜10、好ましくは８〜９であり、反応温度は40〜
47℃、好ましくは42〜46℃であり、反応は通常約３〜48
時間行われる。

なお、反応には、菌体の膜透過性を高めるため、非イ
オン性の界面活性剤を添加して用いることが出来る。

上記のような反応方法によって得られる反応液中に生
成したフマル酸と未反応Ｄ−アスパラギン酸の分離・精
製は公知の活性炭吸着法又はイオン交換樹脂処理等によ
り行うことが出来る（前記工程）。

分離されたフマル酸は、再度前記工程にてDL−アス
パラギン酸に変換され、これらの工程を繰り返し行うこ
とにより対フマル酸収率80モル％以上でＤ−アスパラギ
ン酸を製造出来る。

実施例 以下の実施例におけるフマル酸の定量及びアスパラギ
ン酸の定量は、高速液体クロマトグラフィー（島津LC−
5A）を用いて行った。また、Ｄ−アスパラギン酸の光学
純度は比旋光度により確認した。

「工程（第１回目）」： フマル酸からDL−アスパラギン酸の化学合成工程 反応液（フマル酸1.1モル／、アンモニア水（25
％）3.0モル／）1000mlを２圧力容器に仕込み、150
℃、3kg/cm²で２時間反応させた後、該反応液をエバポ
レーターにて減圧濃縮し、アンモニアを除去後、2N−Na
OHにてpHを7.5に調整する。反応液中のDL−アスパラギ
ン酸量は1.0モル／であった。

「工程（第１回目）その１」： アスパルターゼ含有菌体の調製 培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH₂PO₄0.
05％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・7H₂O0.05％、CaCl₂・2H₂O
2ppm、FeSO₄・7H₂O2ppm、MnSO₄・４〜6H₂O2ppm、ZnSO₄
・7H₂O2ppm、NaCl2ppm、ビオチン200μg/、チアミン
・HCl100μg/、カザミノ酸0.1％、酵母エキス0.1％）
100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後pH7.
0）した後ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacter
ium flavum）MJ−233−AB−41（FERM BP−1498）を植
菌し、無菌的に50（WT/V）％グルコースを4ml加え、30
℃にて２日間振盪培養を行った。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム2.3％、KH₂PO
₄0.05％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・7H₂O0.05％、FeSO₂・7
H₂O20ppm、MnSO₄・４〜6H₂O20ppm、ビオチン200μg/
、チアミン・HCl100μg/、カザミノ酸0.3％、酵母
エキス0.3％）1000mlを２容通気攪拌槽に仕込み、滅
菌（120℃、20分間）後、50（WT/V）％グルコース40ml
と前記培養物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気
量1vvm、温度33℃、pH7.6にて48時間培養を行った。

なお、グルコースは、培養中培地の濃度が１（WT/V）
％をこえないように、50（WT/V）％グルコースを約１〜
２時間ごと断続的に添加した。

培養終了後、培養物1000mlから遠心分離して集菌し
た。

「工程（第１回目）その２」 アスパルターゼ含有菌体の前処理（フマラーゼ活性の除
去処理） 上記の「工程（第１回目）その１」にて調製した微
生物菌体内にはアスパルターゼの他に副反応酵素フマラ
ーゼが共存する為、原料となるフマル酸が一部リンゴ酸
に変換される問題が生じるので、あらかじめフマラーゼ
活性の除去処理を実施した。

「工程（第１回目）その１」にて調製した菌体を反
応液「Ｌ−アスパラギン酸100g、アンモニア（28％アン
モニア含有水溶液）140ml、CaCl₂・2H₂O2.2g、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート0.8g;蒸留水１
中に含有］の１に懸濁後、45℃にて５時間加熱処理を
行った。該処理物は遠心分離により集菌後、該菌体をア
スパルターゼ含有菌体として使用した。

「工程（第１回目）その３」 Ｌ−アスパラギン酸のみをフマル酸とアンモニアに分解
する工程 上記の「工程」で合成したDL−アスパラギン酸１モ
ル／溶液（pH7.5）を含む２反応槽に「工程（第
１回目）その１」と「工程（第１回目）その２」で調
製した菌体50g（湿菌体）を添加し、46℃にて500rpmの
攪拌条件下で20時間反応を行った。反応上清液中のフマ
ル酸およびアスパラギン酸量を定量したところ、フマル
酸0.48モル／、アスパラギン酸0.50モル／であっ
た。

「工程（第１回目）」 クロマトグラフによるＤ−アスパラギン酸とフマルの分
離 上記の「反応液」1000mlを活性炭（しらさぎKL、武田
薬品製）カラムに導通し、蒸留水により溶出する。この
溶出液を減圧濃縮後、冷エタノールにて結晶を析出乾燥
させた。アスパラギン酸結晶の回収量は64gであった。
さらに回収したアスパラギン酸結晶について比旋光度を
測定したところ▲［α］²³ _D▼＝25.5℃（Ｃ＝10,2N−HC
l）で光学純度98％であった。

「工程（第１回目）と「工程（第２回目）」 上記の「工程（第１回目）」で活性炭カラムに吸着
されたフマル酸を2N−アンモニア水1.5にて溶出後、
「工程（第１回目）」と同様の操作により化学合成反
応を行った。

反応液中に生成したDL−アスパラギン酸は、0.3モル
／であった。該水溶液からアンモニアを減圧濃縮装置
にて（50℃、3hr）蒸発除去後、2N−NaOHにてpH7.5に調
整する。該調整0.45モル／のDL−アスパラギン酸溶液
を次記の「工程」のアスパルターゼ反応に供する。

「工程（第２回目）」 前記の「工程（第１回目）その３」と同様の酵素反
応を10時間行った。

「工程（第２回目）」 上記の酵素反応終了液1000mlを前記の「工程（第１
回目）その３」と同様に活性炭カラムに導通し、蒸留水
による流出液からアスパラギン酸の結晶を析出乾燥させ
た。アスパラギン酸回収量は29gであった。該結晶の比
旋光度は▲［α］²³ _D▼＝−25.5（Ｃ＝10,2N−HCl）で
光学純度98％であった。

「工程（第２回目）」は第１回目と同様に行う。

以上の如く〜の工程を２回繰り返すことによりフ
マル酸原料から64モル％の収率でＤ−アスパラギン酸が
製造され、さらに繰り返し計４回の繰り返しにより、対
フマル酸収率82モル％でＤ−アスパラギン酸を製造出来
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 内田 康一 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内 (56)参考文献 特開 昭60−91993（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 41/00 C12P 13/20 ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フマル酸又はその塩とアンモニア又はアン
   モニウムイオンを反応原料として以下の〜の工程を
   順に繰り返し行ないＤ−アスパラギン酸を製造すること
   を特徴とするＤ−アスパラギン酸の製造法。 フマル酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウム
   イオンを水性溶媒中100℃以上の温度で加熱処理するこ
   とにより化学合成法によりDL−アスパラギン酸を製造す
   る。 DL−アスパラギン酸にアスパルターゼを含有する微
   生物又はその処理物を作用させて、Ｌ−アスパラギン酸
   のみをフマル酸とアンモニアに分解する。 クロマト分離により未反応Ｄ−アスパラギン酸とフ
   マル酸とを分離する。 分離したフマル酸は再度の工程に供する。