JP2721989B2 - L―イソロイシンの製造法 - Google Patents
L―イソロイシンの製造法Info
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- JP2721989B2 JP2721989B2 JP2972489A JP2972489A JP2721989B2 JP 2721989 B2 JP2721989 B2 JP 2721989B2 JP 2972489 A JP2972489 A JP 2972489A JP 2972489 A JP2972489 A JP 2972489A JP 2721989 B2 JP2721989 B2 JP 2721989B2
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- isoleucine
- salt
- acid
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Description
【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、酵素反応によるL−イソロイシンの製造法
に関するものである。
に関するものである。
本発明によれば、原料のひとつであるエタノールの消
費量が大幅に低減化されると同時に反応時の発泡もまた
抑制され、L−イソロイシンを高効率に製造することが
出来る。
費量が大幅に低減化されると同時に反応時の発泡もまた
抑制され、L−イソロイシンを高効率に製造することが
出来る。
L−イソロイシンは必須アミノ酸として、人間及び動
物の栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医薬、食
品、飼料強化剤としてその需要が近年急激に増加しつつ
ある。L−イソロイシンの工業的製造法としては、他の
アミノ酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学
合成法ではL体のみの製造は困難であり、主に醗酵法に
より生産が行われている。
物の栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医薬、食
品、飼料強化剤としてその需要が近年急激に増加しつつ
ある。L−イソロイシンの工業的製造法としては、他の
アミノ酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学
合成法ではL体のみの製造は困難であり、主に醗酵法に
より生産が行われている。
醗酵法としてはDL−α−アミノ酪酸、スレオニン等の
L−イソロイシンの前駆物質を使用する方法(特公昭43
−8709号、特公昭40−2880号等)、前駆物質を特に加え
ない所謂直接醗酵法(特公昭38−7091号、特開昭49−93
586号等)がある。
L−イソロイシンの前駆物質を使用する方法(特公昭43
−8709号、特公昭40−2880号等)、前駆物質を特に加え
ない所謂直接醗酵法(特公昭38−7091号、特開昭49−93
586号等)がある。
一方酵素法としては、アンモニウムオイオン又はイソ
ロイシン以外のL−若しくはDL−α−アミノ酸の存在下
に、D−、L−、又はDL−α−ケト−β−メチルバレリ
アン酸からL−イソロイシンを製造する方法(特公昭46
−29789号)、アンモニウムイオン又はイソロイシン以
外のL−若しくはD,L−アミノ酸の存在下に、D−イソ
ロイシン或いはD−アロイソロイシンの単独若しくは混
合物、又はこれらとその光学異性体との適宜混合物に作
用させてL−イソロイシンを製造する方法(特公昭46−
29788号)、セラチア(Serratia)属細菌の固定化物を
用いてグルコースとD−スレオニンからL−イソロイシ
ンを製造する方法(日本醗酵工業会大会講演要旨集p.47
〜48昭和52年度)等が報告されている。
ロイシン以外のL−若しくはDL−α−アミノ酸の存在下
に、D−、L−、又はDL−α−ケト−β−メチルバレリ
アン酸からL−イソロイシンを製造する方法(特公昭46
−29789号)、アンモニウムイオン又はイソロイシン以
外のL−若しくはD,L−アミノ酸の存在下に、D−イソ
ロイシン或いはD−アロイソロイシンの単独若しくは混
合物、又はこれらとその光学異性体との適宜混合物に作
用させてL−イソロイシンを製造する方法(特公昭46−
29788号)、セラチア(Serratia)属細菌の固定化物を
用いてグルコースとD−スレオニンからL−イソロイシ
ンを製造する方法(日本醗酵工業会大会講演要旨集p.47
〜48昭和52年度)等が報告されている。
然しながら、これらの方法は、いずれも原料費が嵩む
とか収率が低いとかの課題を抱えている。
とか収率が低いとかの課題を抱えている。
本発明者等は先に、本発明に用いた微生物菌体の増殖
必須成分であるビオチンを含まない完全合成培地を酵素
反応の反応液として用いることにより、大幅にL−イソ
ロイシンの収率を向上させる方法(特開昭63−112991
号)を提案しているが、さらに高収率にL−イソロイシ
ンを製造すべく鋭意検討を重ねた。
必須成分であるビオチンを含まない完全合成培地を酵素
反応の反応液として用いることにより、大幅にL−イソ
ロイシンの収率を向上させる方法(特開昭63−112991
号)を提案しているが、さらに高収率にL−イソロイシ
ンを製造すべく鋭意検討を重ねた。
本発明者らは、さらに効率良くL−イソロイシンを生
成するためには、本発明に用いる微生物菌体を予め金属
イオンを含む溶液に浸漬することにより、L−イソロイ
シン生成活性を低下させることなく反応原料のひとつで
あるエタノールの消費量を大幅に低減化出来ることを見
出した。さらに該菌体処理により反応時に運転管理が難
しくなる発泡をも抑制することが出来ることを見出し
た。その結果、さらに高収率にL−イソロイシンを製造
出来ることを見出し本発明を完成するに至った。
成するためには、本発明に用いる微生物菌体を予め金属
イオンを含む溶液に浸漬することにより、L−イソロイ
シン生成活性を低下させることなく反応原料のひとつで
あるエタノールの消費量を大幅に低減化出来ることを見
出した。さらに該菌体処理により反応時に運転管理が難
しくなる発泡をも抑制することが出来ることを見出し
た。その結果、さらに高収率にL−イソロイシンを製造
出来ることを見出し本発明を完成するに至った。
本発明の要旨は次に記載の通りである。
「ビオチン要求性のブレビバクテリウム(Brevibacteri
um)属に属する微生物菌体若しくはこの固定化物の存在
下、炭素源及びL−又はDL−α−アミノ酪酸および/又
はその塩あるいは、α−ケト酪酸および/又はその塩あ
るいは、L−又はDL−α−ヒドロキシ酪酸および/又は
その塩を含有するが、ビオチンを含まぬ水溶液中で、溶
存酸素存在下に酵素反応させて該溶液中にL−イソロイ
シンを生成せしめるに際し、予め該微生物菌体を金属塩
含有水溶液中に浸漬させることを特徴とするL−イソロ
イシンの製造法。」 なお、上記の「発明の要旨」中金属塩がカルシウム、
ナトリウム、カリウム、及びマグネシウムの塩化物又は
硫化物である場合が好ましい態様である。又、該金属塩
の濃度は50mMol〜3Molであるのが好ましい。
um)属に属する微生物菌体若しくはこの固定化物の存在
下、炭素源及びL−又はDL−α−アミノ酪酸および/又
はその塩あるいは、α−ケト酪酸および/又はその塩あ
るいは、L−又はDL−α−ヒドロキシ酪酸および/又は
その塩を含有するが、ビオチンを含まぬ水溶液中で、溶
存酸素存在下に酵素反応させて該溶液中にL−イソロイ
シンを生成せしめるに際し、予め該微生物菌体を金属塩
含有水溶液中に浸漬させることを特徴とするL−イソロ
イシンの製造法。」 なお、上記の「発明の要旨」中金属塩がカルシウム、
ナトリウム、カリウム、及びマグネシウムの塩化物又は
硫化物である場合が好ましい態様である。又、該金属塩
の濃度は50mMol〜3Molであるのが好ましい。
従来、本発明のような酵素反応によるL−イソロイシ
ンの生産は報告がなく、又実施されてもいなく、本発明
は新規な方法である。
ンの生産は報告がなく、又実施されてもいなく、本発明
は新規な方法である。
本発明に使用される微生物はビオチン要求性のブレビ
バクテリウム(Brevibacterium)属に属する。好ましく
はエタノール資化性のものが望まれる。このなかにはL
−イロイシン生産菌が含まれる。該微生物は例えばブレ
ビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)M
J−233〔微工研条寄第1497号(微工研菌寄 第3068
号)〕、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacteri
um flavum)MJ−233−AB−41〔微工研条寄第1498号(微
工研菌寄 第3812号)〕、ブレビバクテリウム・フラバ
ム(Brevibacterium flavum)MJ−233−ABT−11〔微工
研条寄第1500号(微工研菌寄 第8423号)〕及びブレビ
バクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)MJ
−233−ABD−21〔微工研条寄第1499号(微工研菌寄 第
8055号)等であり、これらは本発明に好適に用いられ
る。
バクテリウム(Brevibacterium)属に属する。好ましく
はエタノール資化性のものが望まれる。このなかにはL
−イロイシン生産菌が含まれる。該微生物は例えばブレ
ビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)M
J−233〔微工研条寄第1497号(微工研菌寄 第3068
号)〕、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacteri
um flavum)MJ−233−AB−41〔微工研条寄第1498号(微
工研菌寄 第3812号)〕、ブレビバクテリウム・フラバ
ム(Brevibacterium flavum)MJ−233−ABT−11〔微工
研条寄第1500号(微工研菌寄 第8423号)〕及びブレビ
バクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)MJ
−233−ABD−21〔微工研条寄第1499号(微工研菌寄 第
8055号)等であり、これらは本発明に好適に用いられ
る。
なお、上記の(微工研条寄 第1498号)は(微工研条
寄 第1497号)を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性を
積極的に付与されたエタノール資化性微生物である(特
公昭59−28398号公報3〜4欄参照)。(微工研条寄
第1500号)は、(微工研条寄 第1497号)を親株とした
L−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株で
ある(特願昭60−190609号明細書3〜5頁参照)。ま
た、(微工研条寄 第1499号)は(微工研条寄 第1497
号)を親株としたD−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活
性変異株である(特願昭60−017501号明細書5〜7頁参
照)。
寄 第1497号)を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性を
積極的に付与されたエタノール資化性微生物である(特
公昭59−28398号公報3〜4欄参照)。(微工研条寄
第1500号)は、(微工研条寄 第1497号)を親株とした
L−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株で
ある(特願昭60−190609号明細書3〜5頁参照)。ま
た、(微工研条寄 第1499号)は(微工研条寄 第1497
号)を親株としたD−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活
性変異株である(特願昭60−017501号明細書5〜7頁参
照)。
又、本願特許請求の範囲に記載の「炭素源」は微生物
の培養に一般に使用される炭素源を意味するが、この本
願発明の炭素源には、α−アミノ酪酸、α−ケト酪酸及
びα−ヒドロキシ酪酸並びにこれらの塩は含まれない。
の培養に一般に使用される炭素源を意味するが、この本
願発明の炭素源には、α−アミノ酪酸、α−ケト酪酸及
びα−ヒドロキシ酪酸並びにこれらの塩は含まれない。
以下に本発明のL−イソロイシンの製造法を具体的に
説明する。
説明する。
本発明の菌体調製に使用する培地組成は、好ましくは
エタノールを主炭素源とするが、特に限定はなく一般の
微生物に使用されるもので良い。窒素源としてはアンモ
ニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、尿素等を単独若しくは混合して用いることが
出来る。
エタノールを主炭素源とするが、特に限定はなく一般の
微生物に使用されるもので良い。窒素源としてはアンモ
ニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、尿素等を単独若しくは混合して用いることが
出来る。
無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
に菌の生育及びL−イソロイシン生成に必要であれば、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コンステイープリカ
ー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
し用いる。
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
に菌の生育及びL−イソロイシン生成に必要であれば、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コンステイープリカ
ー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
し用いる。
培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養
温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行う。培養途中
のpHは5〜10、好ましくは7〜8付近にて行い、培養中
のpの調整には酸、アルカリを添加して行う。
温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行う。培養途中
のpHは5〜10、好ましくは7〜8付近にて行い、培養中
のpの調整には酸、アルカリを添加して行う。
培養開始のエタノール濃度は好ましくは1〜5容量
%、更に好ましくは2〜3容量%が適する。培養期間は
2〜9日間、最適期間は4〜7日間である。
%、更に好ましくは2〜3容量%が適する。培養期間は
2〜9日間、最適期間は4〜7日間である。
このようにして得られた培養物から菌体を集めて適当
な緩衝液で洗浄し、その洗浄菌体を本発明の方法に使用
する。
な緩衝液で洗浄し、その洗浄菌体を本発明の方法に使用
する。
本発明の方法においては、上記で調整された微生物菌
体を、金属イオンを含有する溶液中に浸漬処理した後、
該処理菌体の存在下、少なくとも炭素源(好ましくはエ
タノール)を含有する水溶液にα−アミノ酪酸又はその
塩あるいは、α−ケト酪酸又はその塩あるいは、α−ヒ
ドロキシ酪酸又はその塩を添加して酵素反応させ、L−
イソロイシンを生成せしめる。
体を、金属イオンを含有する溶液中に浸漬処理した後、
該処理菌体の存在下、少なくとも炭素源(好ましくはエ
タノール)を含有する水溶液にα−アミノ酪酸又はその
塩あるいは、α−ケト酪酸又はその塩あるいは、α−ヒ
ドロキシ酪酸又はその塩を添加して酵素反応させ、L−
イソロイシンを生成せしめる。
微生物菌体の処理に使用する金属イオンとしては、例
えばカルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム
等の塩化物、硫化物が好適に用いられる。これら金属塩
の濃度は、50mM〜3Mol、好ましくは、100mM〜2Molが好
適に使用される。
えばカルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム
等の塩化物、硫化物が好適に用いられる。これら金属塩
の濃度は、50mM〜3Mol、好ましくは、100mM〜2Molが好
適に使用される。
また、微生物菌体の処理時の濃度は、0.5〜30重量
%、好ましくは、1〜20重量%である。処理時の温度
は、0℃〜60℃、好ましくは、10℃〜30℃である。処理
液のpHは特に制限されるものではないが、pH6.0〜9.0が
好適に用いられる。処理時間は、金属イオンの種類及び
濃度により異なるが、一般に10分間〜5時間、好ましく
は、30分間〜2時間である。
%、好ましくは、1〜20重量%である。処理時の温度
は、0℃〜60℃、好ましくは、10℃〜30℃である。処理
液のpHは特に制限されるものではないが、pH6.0〜9.0が
好適に用いられる。処理時間は、金属イオンの種類及び
濃度により異なるが、一般に10分間〜5時間、好ましく
は、30分間〜2時間である。
以上のようににして調製した処理菌体は酵素反応に使
用されるが、該菌体の固定化物も反応に供することが出
来る。
用されるが、該菌体の固定化物も反応に供することが出
来る。
本発明の菌体の固定化物は、公知の固定化法例えばア
クリルアミド、アルギン酸塩、カラギーナン等による包
括性、DEAE−セファデックス、DEAE−セルロース等によ
るイオン結合法などから適宜選択して調製できる。
クリルアミド、アルギン酸塩、カラギーナン等による包
括性、DEAE−セファデックス、DEAE−セルロース等によ
るイオン結合法などから適宜選択して調製できる。
反応液に添加されるエタノールの濃度は1〜20容量
%、好ましくは2〜10容量%が適当である。
%、好ましくは2〜10容量%が適当である。
反応液は、上記の様にエタノールを含有する水(pH7.
0〜9.0)あるいはリン酸又はトリス塩酸等の緩衝液(pH
7.0〜9.0)を用いることもできるが、好ましくはエタノ
ールを含有する完全合成培地が用いられる。ここで完全
合成培地とは、化学構造が公知の無機窒素源及び無機塩
を含有する水溶液である。本発明に用いられる完全合成
培地の無機窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム等が例示でき、また無機塩としては、リン酸
一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等が例示される。これらの
無機窒素源、無機塩は、単独でも2種以上混合して用い
ることもできる。
0〜9.0)あるいはリン酸又はトリス塩酸等の緩衝液(pH
7.0〜9.0)を用いることもできるが、好ましくはエタノ
ールを含有する完全合成培地が用いられる。ここで完全
合成培地とは、化学構造が公知の無機窒素源及び無機塩
を含有する水溶液である。本発明に用いられる完全合成
培地の無機窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム等が例示でき、また無機塩としては、リン酸
一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等が例示される。これらの
無機窒素源、無機塩は、単独でも2種以上混合して用い
ることもできる。
これら無機窒素源および無機塩の水溶液としての濃度
は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地と同程度
の範囲でよく、特に限定されない。
は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地と同程度
の範囲でよく、特に限定されない。
完全合成培地の一例を示すと、(NH4)2SO4 2g/l;KH2PO
4 0.5g/l;K2HPO4 0.5g/l;MgSO4・7H2O 0.5g/l;FeSO4・7
H2O 20ppm;MnSO4・4〜6H2O 20ppmを含有するpH7.6の
水溶液がある。
4 0.5g/l;K2HPO4 0.5g/l;MgSO4・7H2O 0.5g/l;FeSO4・7
H2O 20ppm;MnSO4・4〜6H2O 20ppmを含有するpH7.6の
水溶液がある。
上述の様に、本発明に使用される完全合成培地には、
ビオチン又はビオチンを含む天然物は含有されない。ビ
オチンの含有されないことの明らかなアミノ酸、ビタミ
ン、糖類等を添加することはできる。
ビオチン又はビオチンを含む天然物は含有されない。ビ
オチンの含有されないことの明らかなアミノ酸、ビタミ
ン、糖類等を添加することはできる。
反応液に添加するα−アミノ酪酸又はその塩あるい
は、α−ケト酪酸又はその塩、あるいはα−ヒドロキシ
酪酸又はその塩の濃度は特に制限されるものではない
が、一般には0.1〜20%(wt/vol)、好ましくは、2〜1
0%の濃度範囲で使用するのが適当である。
は、α−ケト酪酸又はその塩、あるいはα−ヒドロキシ
酪酸又はその塩の濃度は特に制限されるものではない
が、一般には0.1〜20%(wt/vol)、好ましくは、2〜1
0%の濃度範囲で使用するのが適当である。
又該微生物菌体の使用量も特に制限されるものではな
いが、一般に1〜50%(wt/vol)、好ましくは2〜30%
の濃度で使用することが出来る。
いが、一般に1〜50%(wt/vol)、好ましくは2〜30%
の濃度で使用することが出来る。
本発明において、酵素反応は、約20〜50℃、好ましく
は約30〜40℃の温度で、通常約10〜約72時間行われる。
は約30〜40℃の温度で、通常約10〜約72時間行われる。
上記酵素反応は、反応に用いられるビオチンを含まぬ
水溶液、好ましくはエタノールを含有する水溶液、特に
好ましくは上述のエタノールを含有する完全合成培地中
の溶存酵素が0.05ppm以上が好ましいが、8ppmを越えぬ
ように行う。反応水溶液中の溶存酵素が8ppmを越えると
酵素反応阻害が現れるので好ましくない。
水溶液、好ましくはエタノールを含有する水溶液、特に
好ましくは上述のエタノールを含有する完全合成培地中
の溶存酵素が0.05ppm以上が好ましいが、8ppmを越えぬ
ように行う。反応水溶液中の溶存酵素が8ppmを越えると
酵素反応阻害が現れるので好ましくない。
反応時の反応液の溶存酵素濃度の調節には、溶存酵素
測定装置〔オリエンタル電気(株)製〕等を用いて、反
応液の溶存酵素を経時的に測定し、空気若しくは酸素を
反応系に連続又は間歇的に供給する通気量等を加減して
行う。
測定装置〔オリエンタル電気(株)製〕等を用いて、反
応液の溶存酵素を経時的に測定し、空気若しくは酸素を
反応系に連続又は間歇的に供給する通気量等を加減して
行う。
上記のような反応方法によって得られる反応液中に生
成したL−イソロイシンの分離・精製は、イオン交換樹
脂処理法あるいは、沈澱法等により容易に行うことが出
来る。
成したL−イソロイシンの分離・精製は、イオン交換樹
脂処理法あるいは、沈澱法等により容易に行うことが出
来る。
以下に実施例を示す。なお、L−イソロイシンの定性
は、ペーパークロマトグラフのRf値、電気泳動法の易動
度、微生物定量法による生物活性値により確認した。定
量はロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconosto
c mesenteroides)ATCC 8042を用いるマイクロバイオア
ッセイ法と高速液体クロマトグラフィー(島津LC−5A)
とを併用して行った。また、下記の実施例において%と
表したのは重量%を意味する。
は、ペーパークロマトグラフのRf値、電気泳動法の易動
度、微生物定量法による生物活性値により確認した。定
量はロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconosto
c mesenteroides)ATCC 8042を用いるマイクロバイオア
ッセイ法と高速液体クロマトグラフィー(島津LC−5A)
とを併用して行った。また、下記の実施例において%と
表したのは重量%を意味する。
実施例−1 培地(尿素0.4%、硫酸アンモニウム1.4%、KH2PO4
0.05%、K2HPO4 0.05%、MgSO4・7H2O 0.05%、CaCl2・
2H2O 2ppm、FeSO4・7H2O 2ppm、MnSO4・4〜6H2O 2pp
m、ZnSO4・7H2O 2ppm、NaCl 2ppm、ビオチン200μg/l、
チアミン・HCl 100μg/l、カザミノ酸0.1%、酵母エキ
ス 0.1%)100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅菌
(滅菌後pH7.0)した後、ブレビバクテリウム・フラバ
ム(Brevibacterium flavum)MJ−233−AB−41(微工研
条寄 第1498号)を植菌し、無菌的にエタノールを2ml
加え、30℃にて2日間振盪培養を行った。
0.05%、K2HPO4 0.05%、MgSO4・7H2O 0.05%、CaCl2・
2H2O 2ppm、FeSO4・7H2O 2ppm、MnSO4・4〜6H2O 2pp
m、ZnSO4・7H2O 2ppm、NaCl 2ppm、ビオチン200μg/l、
チアミン・HCl 100μg/l、カザミノ酸0.1%、酵母エキ
ス 0.1%)100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅菌
(滅菌後pH7.0)した後、ブレビバクテリウム・フラバ
ム(Brevibacterium flavum)MJ−233−AB−41(微工研
条寄 第1498号)を植菌し、無菌的にエタノールを2ml
加え、30℃にて2日間振盪培養を行った。
次に、本培養培地(硫酸アンモニウム2.3%、KH2PO4
0.05%、K2HPO4 0.05%、MgSO4・7H2O 0.05%、FeSO4・
7H2O 20ppm、MnSO4・4〜6H2O 20ppm、ビオチン200μg
/l、チアミン・HCl100μg/l、カザミノ酸0.3%、酵母エ
キス0.3%)の1000mlを2l容通気攪拌槽に仕込み、滅菌
(120℃、20分間)後、エタノールの20mlと前記前培養
物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温
度33℃pH7.6にて48時間培養を行った。
0.05%、K2HPO4 0.05%、MgSO4・7H2O 0.05%、FeSO4・
7H2O 20ppm、MnSO4・4〜6H2O 20ppm、ビオチン200μg
/l、チアミン・HCl100μg/l、カザミノ酸0.3%、酵母エ
キス0.3%)の1000mlを2l容通気攪拌槽に仕込み、滅菌
(120℃、20分間)後、エタノールの20mlと前記前培養
物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温
度33℃pH7.6にて48時間培養を行った。
なお、エタノールは、培養中培地中の濃度が2容量%
を越えないように、約1〜2時間ごと断続的に添加し
た。
を越えないように、約1〜2時間ごと断続的に添加し
た。
培養終了後、培養物100mlから遠心分離にて集菌し
た。これを脱塩蒸留水にて2度洗浄して得た菌体を、第
1表に示した各金属塩水溶液100mlに懸濁し、それぞれ2
5℃にて1時間浸漬させた。該浸漬処理菌体は遠心分離
にて集菌後第2表に示した反応液100mlにて洗浄後、該
処理菌体をそれぞれ第2表に示した反応液100mlに懸濁
後、該懸濁液を200ml容通気攪拌槽に仕込み、エタノー
ル2mlと各反応原料をそれぞれ15g/lの濃度となるように
添加して、回転数1000rpm、温度33℃、pH7.6にて5時間
反応を行った。この時の反応液の溶存酸素濃度は0.1ppm
に保たれた。反応終了後、遠心分離にて除菌した上清液
中のエタノールの残量をガスクロマトグラフにより分析
し、エタノール消費量を求めた。また、上記上清液40ml
を、強酸陽イオン交換樹脂(H+型)のカラムに通してL
−イソロイシンを吸着させ、水洗後、0.5Nアンモニア水
で溶出させたのち、L−イソロイシン画分を濃縮し、冷
エタノールでL−イソロイシンの結晶を析出させた。結
果を第1−1表、第1−2表及び第1−3表に示した。
た。これを脱塩蒸留水にて2度洗浄して得た菌体を、第
1表に示した各金属塩水溶液100mlに懸濁し、それぞれ2
5℃にて1時間浸漬させた。該浸漬処理菌体は遠心分離
にて集菌後第2表に示した反応液100mlにて洗浄後、該
処理菌体をそれぞれ第2表に示した反応液100mlに懸濁
後、該懸濁液を200ml容通気攪拌槽に仕込み、エタノー
ル2mlと各反応原料をそれぞれ15g/lの濃度となるように
添加して、回転数1000rpm、温度33℃、pH7.6にて5時間
反応を行った。この時の反応液の溶存酸素濃度は0.1ppm
に保たれた。反応終了後、遠心分離にて除菌した上清液
中のエタノールの残量をガスクロマトグラフにより分析
し、エタノール消費量を求めた。また、上記上清液40ml
を、強酸陽イオン交換樹脂(H+型)のカラムに通してL
−イソロイシンを吸着させ、水洗後、0.5Nアンモニア水
で溶出させたのち、L−イソロイシン画分を濃縮し、冷
エタノールでL−イソロイシンの結晶を析出させた。結
果を第1−1表、第1−2表及び第1−3表に示した。
第2表 基本反応液組成 (NH4)2SO4 23g/l KH2PO4 0.5g/l K2HPO4 0.5g/l MgSO4・7H2O 5g/l FeSO4・7H2O 20mg/l MnSO4・4〜6H2O 20mg/l チアミン一塩酸 100μg/l (pH 7.6) 上記の基本反応液に下記原料を添加して用いた。
DL−α−アミノ酪酸 15g/l 又は αケト酪酸ナトリウム 15g/l 又は DL−α−ヒドロキシ酪酸ナトリウム 15g/l
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:13) (72)発明者 山縣 恒 茨城県稲敷郡阿見町中央8丁目3番1号 三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央8丁目3番1号 三菱油化株式会社中央研究所内
Claims (1)
- 【請求項1】ビオチン要求性のブレビバクテリウム(Br
evibacterium)属に属する微生物菌体若しくはこの固定
化物の存在下、L−又はDL−α−アミノ酪酸および/又
はその塩あるいは、α−ケト酪酸および/又はその塩あ
るいは、L−又はDL−α−ヒドロキシ酪酸および/又は
その塩と炭素源を含有するがビオチンを含まぬ水溶液中
で、溶存酸素存在下に酵素反応させて該溶液中にL−イ
ソロイシンを生成せしめるに際し、予め該微生物菌体を
金属塩含有水溶液中に浸漬させることを特徴とするL−
イソロイシンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2972489A JP2721989B2 (ja) | 1989-02-10 | 1989-02-10 | L―イソロイシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2972489A JP2721989B2 (ja) | 1989-02-10 | 1989-02-10 | L―イソロイシンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02211885A JPH02211885A (ja) | 1990-08-23 |
JP2721989B2 true JP2721989B2 (ja) | 1998-03-04 |
Family
ID=12284057
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2972489A Expired - Lifetime JP2721989B2 (ja) | 1989-02-10 | 1989-02-10 | L―イソロイシンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2721989B2 (ja) |
-
1989
- 1989-02-10 JP JP2972489A patent/JP2721989B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH02211885A (ja) | 1990-08-23 |
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