JPH02211885A - Ｌ―イソロイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、酵素反応によるＬ−イソロイシンの製造法に
関するものである。

本発明によれば、原料のひとつであるエタノールの消費
量が大幅に低減化されると同時に反応時の発泡もまた抑
制され、Ｌ−イソロイシンを高効率に製造することが出
来る。

〔従来技術とその課題〕

し−イソロイシンは必須アミノ酸として、人間及び動物
の栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医薬、食品
、飼料強化剤としてその需要が近年急激に増加しつつあ
る。Ｌ−イソロイシンの工業的製造法としては、他のア
ミノ酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合
成法ではＬ体のみの製造は困難であり、主に醗酵法によ
り生産が行われている。

醗酵法としてはＤＬ−α−アミノ酪酸、スレオニン等の
Ｌ−イソロイシンの前駆物質を使用する方法（特公昭４
３−８７０９号、特公昭４０−２８８０号等）、前駆物
質を特に加えない所謂直接醗酵法（特公昭３８−７０９
１号、特開昭４９９３５８６号等）がある。

一方酵素法としては、アンモニウムイオン又はイソロイ
シン以外のし−若しくはＤＬ−α−アミノ酸の存在下に
、Ｄ　−Ｌ−１又はＤＬ−α−ケトーβ−メチルバレリ
アン酸からＬ−イソロイシンを製造する方法（特公昭４
６−２９７８９号）、アンモニウムイオン又はイソロイ
シン以外のし−若しくはり、Ｌ−アミノ酸の存在下に、
Ｄ−イソロイシン或いはＤ−アロイソロイシンの単独若
しくは混合物、又はこれらとその光学異性体との適宜混
合物に作用させてＬ−イソロイシンを製造する方法（特
公昭４６−２９７８８号）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉ
ａ）属細菌の固定化物を用いてグルコースとＤ−スレオ
ニンからＬ−イソロイシンを製造する方法（日本醗酵工
業会大会講演要旨集ｐ、４７〜４８昭和５２年度）等が
報告されている。

然しなから、これらの方法は、いずれも原料費が嵩むと
か収率が低いとかの課題を抱えている。

本発明者等は先に、本発明に用いた微生物菌体の増殖必
須成分であるビオチンを含まない完全合成培地を酵素反
応の反応液として用いることにより、大幅にＬ−イソロ
イシンの収率を向上させる方法（特開昭６３−１１２９
９１号）を提案しているが、さらに高収率にＬ−イソロ
イシンを製造すべく鋭意検討を重ねた− 〔発明の構成及び効果〕 本発明者らは、さらに効率良くＬ−イソロイシンを生成
するためには、本発明に用いる微生物菌体を予め金属イ
オンを含む溶液に浸漬することにより、Ｌ−イソロイシ
ン生成活性を低下させることなく反応原料のひとつであ
るエタノールの消費量を大幅に低減化出来ることを見出
した。さらに該菌体処理により反応時に運転管理が難し
くなる発泡をも抑制することが出来ることを見出した。

その結果、さらに高収率にＬ−イソロイシンを製造出来
ることを見出し本発明を完成するに至った〔発明の要旨
〕 本発明の要旨は次に記載の通りである。

「ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃＬｅｒｉｕｍ）属に属する微生物菌体若しくはその
固定化物の存在下、炭素源及びＬ−又はＤＬ−α−アミ
ノ酪酸および／又はその塩あるいは、α−ケト酪酸およ
び／又はその塩あるいは、Ｌ−又はＤＬ−α−ヒドロキ
シ酪酸および／又はその塩を含有するが、ビオチンを含
まぬ水溶液中で、溶存酸素存在下に酵素反応させて該溶
液中にＬ−イソロイシンを生成せしめるに際し、予め該
微生物菌体を金属塩含有水溶液中に浸漬させることを特
徴とするＬ−イソロイシンの製造法、」 なお、上記の「発明の要旨」中金属塩がカルシウム、ナ
トリウム、カリウム、及びマグネシウムの塩化物又は硫
化物である場合が好ましい態様である。又、該金属塩の
濃度は５０　ｍ　Ｍ　ｏ　１〜３Ｍｏ１であるのが好ま
しい。

従来、本発明のような酵素反応によるＬ−イソロイシン
の生産は報告が無く、又実施されてもいなく、本発明は
新規な方法である。

本発明に使用される微生物はビオチン要求性のブレビバ
クテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　属に属
する。好ましくはエタノール資化性のものが望まれる。

このなかにはＬ−イソロイシン生産菌が含まれる。該微
生物は例えばブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−
２３３〔微工研条寄第１４９７号（微工研菌寄　第３０
６８号）〕、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　　ｆｌａｖｕｍ）　　Ｍ　　
Ｊ　　−２３３Ａ　　Ｂ　　−４１〔微工研条寄第１４
９８号（微工研菌寄　第３８１２号））、ブレビバクテ
リウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　
ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３−Ａ　Ｂ　Ｔ−１１
〔微工研条寄第１５００号（微工研菌寄第８４２３号）
〕及びブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｓ）　Ｍ　Ｊ　−２３３
−ＡＢＤ−２１（微工研条寄第１４９９号（微工研菌寄
　第８０５５号）等であり、これらは本発明に好適に用
いられる。

なお、上記の（微工研条寄　第１４９８号）は（微工研
条寄　第１４９７号）を親株としてＤＬ−α−アミノ酪
酸耐性を積極的に付与されたエタノール資化性微生物で
ある（特公昭５９−２８３９８号公報３〜４欄参照）、
（微工研条寄　第１５００号）は、（微工研条寄　第１
４９７号）を親株としたし一α−アミノ酪酸トランスア
ミナーゼ高活性変異株である（特願昭６０−１９０６０
９号明細書３〜５頁参照）、また、（微工研条寄第１４
９９号）は（微工研条寄　第１４９７号）を親株とした
Ｄ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株である（
特願昭６０−０１７５０１号明細書５〜７頁参照）。

又、本願特許請求の範囲に記載の「炭素源」は微生物の
培養に一般に使用される炭素源を！味するが、この本願
発明の炭素源には、α−アミノ酪酸、α−ケト酪酸及び
α−ヒドロキシ酪酸並びにこれらの塩は含まれない。

以下に本発明のＬ−イソロイシンの製造法を具体的に説
明する。

本発明の菌体調製に使用する培地組成は、好ましくはエ
タノールを主炭素源とするが、特に限定はなく一般の微
生物に使用されるもので良い、窒素源としてはアンモニ
ア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、尿素等を単独若しくは混合して用いることが出
来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
菌の生育及びＬ−イソロイシン生成に必要であれば、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、コンスティープリカー
、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し
用いる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行う、培
養途中のｐＨは５〜ＩＯ１好ましくは７〜８付近にて行
い、培養中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加して行
う。

培養開始のエタノール濃度は好ましくは１〜５容量％、
更に好ましくは２〜３容量％が適する。

培養期間は２〜９日間、最適期間は４〜７日間である。

このようにして得られた培養物から菌体を集めて適当な
緩衝液で洗浄し、その洗浄菌体を本発明の方法に使用す
各。

本発明の方法においては、上記で！１１１！！された微
生物菌体を、金属イオンを含有する溶液中にｉｔ？Ｊｉ
処理した後、該処理菌体の存在下、少なくとも炭素源（
好ましくはエタノール）を含有する水溶液にα−アミノ
酪酸又はその塩あるいは、α−ケト酪酸又はその塩ある
いは、α−ヒドロキシ酪酸又はその塩を添加して酵素反
応させ、Ｌ−イソロイシンを生成せしめる。

微生物菌体の処理に使用する金属イオンとしては、例え
ばカルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム等
の塩化物、硫化物が好適に用いられる。これら金属塩の
濃度は、５０ｍＭ〜３　Ｍ　。

Ｅ、好ましくは、１００ｍＭ　〜２Ｍｏｊが好適に使用
される。

また、微生物菌体の処理時の濃度は、０．５〜３０重量
％、好ましくは、１〜２０重量％である、処理時の温度
は、０℃〜６０℃、好ましくは、１０℃〜３０℃である
。処理液のｐＨは特に制限されるものではないが、ｐＨ
６，０〜９．０が好適に用いられる。処理時間は、金属
イオンの種類及び濃度により異なるが、一般に１０分間
〜５時間、好ましくは、３０分間〜２時間である。

以上のようににして調製した処理菌体は酵素反応に使用
されるが、該菌体の固定化物も反応に供することが出来
る。

本発明の菌体の固定化物は、公知の固定化法例えばアク
リルアミド、アルギン酸塩、カラギーナン等による包括
法、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロース
等によるイオン結合法などから適宜選択して調製できる
。

反応液に添加されるエタノールの濃度は１〜２０容量％
、好ましくは２〜１０容量％が適当である。

反応液は、上記の様にエタノールを含有する水（ｐＨ７
，０〜９．０）あるいはリン酸又はトリス塩酸等の緩ｉ
ｈ液（ｐＨ７，０〜９．０）を用いることもできるが、
好ましくはエタノールを含有する完全合成培地が用いら
れる。ここで完全合成培地とは、化学構造が公知の無機
窒素源及び無機塩を含有する水溶液である０本発明に用
いられる完全合成培地の無機窒素源としては、アンモニ
ア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等が例示でき、また無機塩
としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等が例示
される。これらの無機窒素源、無機塩は、単独でも２種
以上混合して用いることもできる。

これら無機窒素源および無機塩の水溶液としての濃度は
、通常の微生物菌体の培養に使用される培地と同程度の
範囲でよく、特に限定されない。

完全合成培地の一例を示すと、（ＮＨ４）、Ｓ０４　　
２ｇ／ｌ；ＫＨｔＰＯ＊　　　０．５ｇ／ｊ；Ｋｍ　　
ＨＰ　Ｏ＋　　０．　５　ｇ／　ｊ　ｉ　Ｍｇ　３０４
　　・７Ｈ００，５ｇ／ｌ　：Ｆｅ５０＋　　Ｈ７Ｈ−
０２０ｐｐｍ；Ｍｎ５Ｏ＋　　・４〜６Ｈｔ　Ｏ２０ｐ
ｐｍを含有するｐＨ７，６の水溶液がある。

上述の様に、本発明に使用される完全合成培地には、ビ
オチン又はビオチンを含む天然物は含有されない、ビオ
チンの含有されないことの明らかなアミノ酸、ビタミン
、糖類等を添加することはできる。

反応液に添加するα−アミノ酪酸又はその塩あるいは、
α−ケト酪酸又はその塩、あるいはα−ヒドロキシ酪酸
又はその塩の濃度は特に制限されるものではないが、一
般には０．１〜２０％（Ｗｔ／ｖｏｌ）、好ましくは、
２〜１０％の濃度範囲で使用するのが適当である。

又該微生物菌体の使用量も特に制限されるものではない
が、一般に１〜５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、好ましくは２
〜３０％の濃度で使用することが出来る。

本発明において、酵素反応は、約２０〜５０℃、好まし
くは約３０〜４０℃の温度で、通常約ｌＯ〜約７２時間
行われる。

上記酵素反応は、反応に用いられるビオチンを含まぬ水
溶液、好ましくはエタノールを含有する水溶液、特に好
ましくは上述のエタノールを含有する完全合成培地中の
溶存酸素が０．Ｏ５ｐｐｍ以上が好ましいが、ｓｐｐｍ
を越えぬように行う、反応水溶液中の溶存酸素が８ｐｐ
ｍを越えると酵素反応阻害が現れるので好ましくない。

反応時の反応液の溶存酸素濃度の調節には、溶存酸素測
定装置〔オリエンタル電気■製〕等を用いて、反応液の
溶存酸素を経時的に測定し、空気若しくは酸素を反応系
に連続又は間歇的に供給する通気量等を加減して行う。

上記のような反応方法によって得られる反応液中ニ生成
したＬ−イソロイシンの分離・精製は、イオン交換樹脂
処理法あるいは、沈澱法等により容易に行うことが出来
る。

以下に実施例を示す、なお、Ｌ−イソロイシンの定性は
、ペーパークロマトグラフのＲｆ値、電気泳動法の易動
度、微生物定量法による生物活性値により確認した。定
量はロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏ
ｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）　ＡＴＣ
Ｃ８０４２を用いるマイクロバイオアッセイ法と高速液
体クロマトグラフィー（島原ＬＣ−５Ａ）とを併用して
行った。また、下記の実施例において％と表したのは重
量％を意味する。

実施例−１ 培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、ＫＨ
−ＰＯ４０，０５％、Ｋ、ＨＰＯ４０，０５％、Ｍ　ｇ
　Ｓ　Ｏ＊　　・７Ｈ，ＯＯ，０５％４、ＣａＣ１，−
２Ｈ，０２ｐｐｍ、Ｆｅ５０＊・７８．０　２ｐｐｍ、
Ｍｎ５Ｏ，・４〜６Ｈ。

０　２ｐｐｍ、Ｚｎ５Ｏ＊　　・ＩＨ，Ｏ’２ｐｐｍ、
ＮａＣ１２ｐｐｍ１ビオチン２００　ｐ　ｇ　／　Ｊ、
チアミン・ＨＣｌ　１００μｇ／Ｊ、カザミノ酸０．１
％、酵母エキス　０．１％）１００ｍｊを５００ｍｊ容
三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）した後
、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３−Ａ
Ｂ−４１（微工研条寄　第１４９８号）を植菌し、無菌
的にエタノールを２　ｍ　ｌ加え、３０℃にて２日間振
盪培養を行った。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２．３％、ＫＨ，
ＰＯ４Ｇ、０５％、Ｋ２ＨＰ０．　　００５％、Ｍ　ｇ
　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，００，０５％、Ｆｅ５０＊　　・Ｉ
Ｈｚ　０　２０ｐｐｍ、Ｍｎ５Ｏ＋・４〜６Ｈｚ　　０
　２０ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｊ、チアミン・Ｈ
Ｃ＆　１００μｇ／ｌ、カザミノ酸０．３％、酵母エキ
ス０．３％）の１００９ｍｊを２１容通気攪拌槽に仕込
み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、エタノールの２０
ｒｎｊと前記前培養物の２０ｍｊを添加して、回転数１
１００Ｑｒｐ、通気量１ｖｖｍ、温度３３℃ｐＨ７゜６
にて４８時間培養を行った。

なお、エタノールは、培養中略地中の濃度が２容量％を
越えないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。

培養終了後、培養物１００ｍｌから遠心分離にて集菌し
た。これを脱塩蒸留水にて２度洗浄して得た菌体を、第
１表に示した各金属塩水溶液ｌＯＱ　ｍ　Ｊに懸濁し、
それぞれ２５℃にて１時間浸漬させた。該浸漬処理菌体
は遠心分離にて集Ｗｔ＆第２表に示した反応液１００　
ｍ　ｌにて洗浄後、該処理菌体をそれぞれ第２表に示し
た反応液１００ｍ１に懸濁後、該懸濁液を２００ｍ＆容
遣気攪津槽に仕込み、エタノール２　ｍ　Ｊと各反応原
料をそれぞれ１５ｇ／ｊの濃度となるように添加して、
回転数１１００Ｏｒｐ、温度３３℃、ＰＨ７，６にて５
時間反応を行った。この時の反応液の溶存酸素濃度はｏ
、ｔｐｐｍに保たれた０反応終了後、遠心分離にて除菌
した上清液中のエタノールの残量をガスクロマトグラフ
により分析し、エタノール消費量を求めた。また、上記
上清液４　Ｑ　ｍ　ｊを、強酸陽イオン交換樹脂（Ｈ”
型）のカラムに通してＬ−イソロイシンを吸着させ、水
洗後、０゜５Ｎアンモニア水で溶出させたのち、Ｌ−イ
ソロイシン画分を濃縮し、冷エタノールでＬ−イソロイ
シンの結晶を析出させた。結果を第１−１表、第１−２
表及び第１−３表に示した。

第　２　表　基本反応液組成 （ＮＨ４）　Ｚ　ＳＯ４２３ｇ／Ｊ ＫＨ２Ｐ０４　　　　　　　　　０．５　ｇ／ＩＫ、Ｈ
ＰＯ４０，５ｇ／ｊ Ｍｇ　ｉｉｏ＋　　・７　Ｈ２Ｏ５ｇ／　ＪＦ　ｅ　Ｓ
Ｏ４・７　Ｈ，０２０ｍｇ／　ｊＭｎＳＯ＋　　・４〜
６Ｈ，０２０ｍｇ／ｊチア・ミンー塩酸　　　　　　１
００μｇ／１（ｐＨ７，６） 上記の基本反応液に下記原料を添加して用いた。

ＤＬ−α−アミノ酪酸　　　　　　　１５ｇ／ｊ！又は α−ケト酪酸ナトリウム　　　　　　１５ｇ／ｌ又は ＤＬ−α−ヒドロキシ酪酸ナトリウム １５ｇ／ｊ！

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖ
   ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物菌体若しくは
   この固定化物の存在下、Ｌ−又はＤＬ−α−アミノ酪酸
   および／又はその塩あるいは、α−ケト酪酸および／又
   はその塩あるいは、Ｌ−又はＤＬ−α−ヒドロキシ酪酸
   および／又はその塩と炭素源を含有するがビオチンを含
   まぬ水溶液中で、溶存酸素存在下に酵素反応させて該溶
   液中にＬ−イソロイシンを生成せしめるに際し、予め該
   微生物菌体を金属塩含有水溶液中に浸漬させることを特
   徴とするＬ−イソロイシンの製造法。