JPH02124086A - シユードモナス属細菌の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はアミノ酸ラセマーゼを含有する微生物の培養方
法に関する。

（従来技術） 本発明者らは、先にン二−ドモナス属に属するアミノ酸
ラセマーゼを含有する微生物を培養するニ際シ、グリセ
ロール、エタノール又は酒石酸等を主炭素源として培養
する方法を提供している。

（特開昭６２−２０５７８１９報参照）。

本発明者らはさらに、高活性の菌体を高収量で得ること
を目的に、主炭素源であるグリセロール、エタノール又
は酒石酸の添加方法について鋭意検討した結果、それら
炭素源の培地中の濃度を０．５％以下に保たれるように
、該炭素源を連続的または断続的に添加することにより
目的を達成し、本発明を完成するに至った。

（発明の構成と効果） 本発明は、シュードモナス属に属するアミノ酸ラセマー
ゼを含有する微生物を培養する際にして、主炭素源であ
るグリセロール、エタノール及び／又は酒石酸の培地中
における濃度を０．５重量％以下、好ましくは０．３重
量％以下に保つようにグリセロール、エタノール又は酒
石酸を連続的又は断続的に添加する方法であり、本方法
によればアミノ酸ラセマーゼ活性を著しく高めることが
できる。

上記微生物の培養は、培地に主炭素源としてのグリセロ
ール、エタノール又は酒石酸を上記濃度で連続的又は断
続的に添加しつつ行なうことを除けば、通常の培養と同
様にして行なうことができる。

かくして上記培養において培地に用いられる窒素源とし
ては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、燐酸アンモニウム等のアンモニウム塩、及び
アンモニア、さらに硝酸カリ、硝酸ナトリウム、硝酸ア
ンモニウム等の硝酸塩、グルタミン酸、グルタミン、ア
スパラギン酸、アスパラギン等の有機窒素なとが適当で
あり、無機物としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、カルシウムの硫
酸塩または塩酸塩などが用いられ、成長促進物質として
は、サイアミン、ビオチン等のビタミン類、メチオニン
、システィン等のアミノ酸、あるいはこれらの全部もし
くは部分的に含有する酵母エキス、ポリペプトン、肉エ
キス、コーンステイープリカー、カザミノ酸等が用いら
れる。

培養温度は通常１０〜４５°Ｃ１好ましくは２５〜４０
°Ｃの範囲内であり、また培地ｐＨは３〜１０、好まし
くは、５〜９の範囲内にすることができる。培養中のｐ
Ｈ変化がある場合には、アンモニア、苛性ソーダ、苛性
カリなどを添加して上記の範囲で一定に保持することが
望ましい。

更に培養は好気的条件下で行い、培養中の溶存酸素が律
速因子とならないように通気撹拌をすることが望ましい
。

以上に述べた本発明によれは、アミノ酸ラセマーゼを高
活性で含有するンユードモナス属細菌を効率よく大量に
つくることかできる。

なお、培地中のグリセロール又はエタノールの濃度はガ
スクロマトグラフィー（島津ＧＣ−３８Ｆ）により、ま
た酒石酸の濃度は高速液体クロマトグラフィー（島津Ｌ
Ｃ−５Ａ）により測定することができる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ ポリペプトン１０２、肉エキスｌ　０９　、ＮａＣｌ３
２、蒸留水１０００ｍｌ、　ｐＨ７，２の培地１００ｍ
Ｑを５００ｍｆｆ容三角フラスコに分注し、１２０°Ｃ
１５分間滅菌処理した。この培地にラセマーゼ生産菌で
ある・／ニードモナス・プチダ（ＩＦＯ１２９９６）を
１白金耳量植菌し、３０°Ｃで１５時間振盪培養を行っ
た後、この培養物２０ｍＱを下記表１に示す各培地１０
００ｍ１２（いわしや製２リットルジャーファーメンタ
−）に植菌し、６００　ｒｐｍ。

ｌ　ｖｖｍ、３０°Ｃで２０時間通気・撹拌培養を行っ
た。なお、炭素源であるグリセロース、エタノール又は
酒石酸は１％、０．６％、０．５％、０．３％、０．２
％を越えないように培地に添加された。

また、ｐＨは必要に応じて２５〜２８％アンモニア添加
にて７．２前後に調整した。

該各培養物１０ｍＱから遠心分離（６，ＯＯＯｒｐｍ。

１５分間、４°Ｃ）により集菌し、該集菌菌体を０゜ｌ
　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）４０ｍ１２にて１度洗
浄後、同衝撃液の４ｍ（２に懸濁する。菌体懸濁液を超
音波破砕機（ブランラン２００型）により破砕した後、
延伸分離（１２，ＯＯＯｒｐｍ、４０分間、４°Ｃ）に
より上清を分離し、これを粗酵素液とし、さらに該粗酵
素液中のセリン分解活性を抑制させるため、−２０°Ｃ
にて２４時間凍結保存した。

表　　１ に２ＨＰ０．　　　　　　　　　　　　　　　　　　７
２Ｋ　Ｈ２ｐ　ｏ　＊　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２７（Ｎ　Ｈ＋）２Ｓ　Ｏｔ　　　　　　　　
　　　　　　　　１２〜１７Ｓ０．７Ｈ□ＯＯ，１７ ト　リ　プ　ト　ン　（Ｄｉｒｃｏ）　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１７酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）
　　　　　　　　　　　ｌ　ｌ主炭素源＊　　　　　　
　　　　　　　＊蒸留水　　　　　　　　　　　　１０
００ｍ１２ｐＨ７，０ ＊　グリセロール、エタノール、酒石酸の初発添加濃度
は１％、０．６％、０．５％、０．３％、０．２％とし
、全添加量は２％とした。

表　　２ １００ｍＭｈリス（ヒドロキシメチルアミンメタン） １００ｍＭ　　Ｄ−（？リン ０−０４　ｍＭ　　ピリドキサール５リン酸ｐＨ８，０
の水溶液 表２に示す反応液４．５ｍ１２に各々の主炭素源の濃度
を用いた培養で得られた前述の粗酵素液の０．５ｍＱを
加え３７°０３０分間反応させた後、反応液中のセリン
の旋光度変化を旋光針（日本分光ＤＩＰ３６０型）を用
い、酸性条件下で測定し、更に全セリン濃度をＨＰＬＣ
にて測定し、Ｄ−セリンからのＬ−セリンの生成量を求
め、その結果よりグリセロールを主炭素源として０．２
％を越えないように添加した場合の活性を１００として
下記表３を作成した。また、酵素液中のタンパク質屋度
はＬｏｗｒｙ等の方％ｈＣＪ、　Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｍ
、　　ｌ　９３２６５　１９５１）に従い求めた。

なお、対照としては、各炭素源を初発２％添加して培養
した菌体を用いた。

箸Ｊ麦 船 グリセロールＯ１ ２％を越えないように添加し て培養した菌体のラセマ ゼ活性を１００と する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）培地中のグリセロール、エタノール及び／又は酒
   石酸の濃度が０．５％以下に保たれるように、培地にグ
   リセロール、エタノール及び／又は酒石酸を連続的又は
   断続的に添加しながら培養することを特徴とするシュー
   ドモナス属に属するアミノ酸ラセマーゼを含有する微生
   物の培養方法。
2. （２）アミノ酸ラセマーゼがシュードモナス・プチダ（
   Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９
   ６である特許請求の範囲第１項記載の方法。