JPH01108992A - Ｌ−イソロイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 弦貞土亘 本発明は、酵素法によるＬ−イソロイシンの製造法に関
するものでちる。

本発明によればＬ−又はＤＬ−α−ヒドロキシ酪酸から
、高収攪で効率よくＬ−イソロイシンを製造することが
できる。

Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸として、人間および動
物の栄養上重要な役割りをするアミノ酸でろ９、医薬、
食品、飼料添加剤等としてその需要が近年急激に増加し
つつある。

盈ｌユ亙 Ｌ−イソロイシンの工業的製造法としては、他のアミノ
酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合成法
では５体のみの製造は困難であり、主に醗酵法により生
産が行われている。醗酵法としてはＤＬ−α−アミノ酪
酸、スレオニン等のし−イソロイシンの前駆物質を使用
する方法（特公昭４３−８７０９号、同４０−２８８０
号公報等）、前駆物質を特に加えない所謂直接醗酵法（
特公昭３８−７０９１号、特開昭４９−９３５８６号公
報等）がある。一方酵素法としては、アンモニウムイオ
ンまたはインロイシン以外のＬ−若しくはＤＬ−アミノ
酸の存在下に、Ｄ−１Ｌ−１またはＤＬ−α−ケト−β
−メチルバレリアン酸からＬ−イソロイシンを製造する
方法（特公昭４６−２９７８９号公報）、アンモニウム
イオンまたはインロイシン以外のＬ−若しくはＤＬ−ア
ミノ酸の存在下に、Ｄ−イソロイシンるるいはＤ−アロ
インロイシンの単独もしくは混合物、又はこれらとその
光学異性体との適宜混合物に作用させてＬ−イソロイシ
ンを製造する方法（特公昭４６−２９７８８号公報）、
セラチア（３ａｒｒａｔｉａ　）属細菌の固定化物を用
いてグルコースとＤ−スレオニンからＬ−イソロイシン
を製造する方法（日本醗酵工学会大会講演要旨集ｐ、４
７〜４８昭和５２年度）等が報告されている。しかしな
がらこれらの方法は、原料費が嵩むとか収率が低い課題
を抱えている。

１ｙｖすＩＬ 本発明は、ビオチン要求性のプレビバクテリウＡ　（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｊｕｍ　）　属に属する微生物菌
体４しくはその固定化物の存在下、Ｌ−又はＤＬ−α−
ヒドロキシ酪酸又はその塩を、少なくともエタノールを
含有する水溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−イソ
ロイシンを生成せしめ、これからＬ−イソロイシンを採
取することを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法を提
供するものでるる。

ｊＩＦと１１ 本発明によれば、工業的に安価に製造されるＬ−又はＤ
Ｌ−ヒドロキシ酪酸又はその塩から、高収量で効率よ〈
Ｌ−イソロイシンが製造できる。

本発明の方法において、酵素反応時の水溶液として好ま
しく用いられるエタノールを含有する水溶液は、発酵法
の場合に用いられる培地のＩＩｃ菌等煩雑な操作が必要
でないので、生産管理は容易である。

本発明の方法は、従来このような酵素法によるＬ−父は
ＤＬ−ヒドロキシ酪酸からのＬ−イソロイシンの生産は
、報告が無く又実施されてもいなく、本発明は新規な方
法でろる。

１ＪｐＪｕ９ｎ記１ 本発明に使用される微生物は、ビオチン要求性のブレビ
バクテリウム　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）　
ｌｉに属するものであり、好ましくはエタノール資化性
のものである。このなかにはＬ−イソロイシン生産菌が
含まれる。本発明に使用される微生物菌体としては例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　）　Ｍ　Ｊ　−２３３（
微工研菌寄　＠３０６８号）、ブレビバクテリウム・フ
ラパＡ　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕ
ｍ　）　Ｍ　Ｊ−２３３−ＡＢ−４１（微工研菌寄　第
３８１２号）、プレビバクテリウＡｌｌフラパＡ　（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ　　）ＭＪ−
２３３−ＡＢＴ−１１（微工研菌寄　第８４２３号）及
びブレビバクテリウム・７ラバＡ　（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　）　Ｍ　Ｊ　−２３３−
ＡＢＤ−２１（微工研菌寄　第８０５５号）等であり、
これらの１が本発明に好適に用いられる。

なお、上記の（微工研菌寄　第３８１２号）は、（微工
研菌寄　第３０６８号）を親株としてＤＬ−α−アミノ
酪酸耐性を積極的に付与されたエタノール資化性微生物
である（％公昭５９−２８３９８号公報３〜４欄参照）
。（微工研菌寄　第８４２３号）は、（微工研菌寄　第
３０６８号）を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランス
アミナーゼ高活性変異株である（特開昭６２−５１９９
８号公報参照）。また、（微工研菌寄　第８０５５号）
は（微工研菌寄　第３０６８号）を親株としたＤ−α−
アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株でるる（特開昭６
１−１７７９９３号公報参照）。

これらの微生物菌体の他にブレビバクテリウム拳アンモ
ニアゲネス（ｇｒｅｖｉｂａｅｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏ
ｎｉａｇｅｎｅｓ　）　ＡＴＣＣａ　ｓ　７１．同ＡＴ
ＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテ
リウム”デパリカタＡ　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０等を
用いることもできる。

本発明に見いられるビオチル要求性のブレビバクテリウ
ム属に属する微生物菌体は、微生物菌体そのままで用い
ることもできるし、又これらを公知の手法で固定化した
固定化物を使用することもできる。この固定化手法とし
ては、菌体をアクリルアミド等の重合性モノマーを用い
たり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の適当な担
体に不溶化させる等がめる。

本発明の方法に使用される上記のビオチン要求性のブレ
ビバクテリウム礪に属する微生物菌体の調製に使用する
培地は、特に限定されるものではなく一般の微生物に使
用されるものでよい。中でも好ましいものは、エタノー
ルを主炭素源とする培地である。

本発明に使用する微生物菌体の調整に使用する培地の窒
素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは混
合して用いることが出来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
菌の生育及びＬ−イソロイシン生成に必要であれば、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカ
ー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
し用いる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行う。培
養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近にて行
い、培養中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加して行
う。

培養開始時のエタノール」度は好ましくは１〜５容量％
、更に好ましくは２〜３容量％・が適する。

培養期間は２〜９日間、最適期間は４〜７日間である。

このようにして得られた培養物から菌体を集めて、水又
は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素反応に使
用する。

本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌体
（ここには、その固定化物も含まれる）の存在下、Ｌ−
又はＤＬ−α−ヒドロキシ酪酸又はその塩を、少なくと
もエタノールを含有する水溶液にて酵素反応させる。こ
こで該水溶液に添加されるエタノールの積度は０．５〜
４０容量％、好ましくは１〜２０容量多でろる。

Ｌ−又はＤＬ−α−ヒドロキシ酪酸又はその塩の酵素反
応における使用濃度は、一般に０．１〜２０％（Ｗｔ／
ｖｏｊｌ　）が好ましい。

本発明の方法において、酵素反応に用いる水溶液は、上
記の様にエタノールを含有する永めるいはリン酸又はト
リス塩酸等の緩衝液を用いることもできるが、好ましく
はエタノールを含みこれに更に公知の窒素源及び無機塩
を含有するものが用いられる。これらの窒素源及び無機
塩を反応系に添加するとＬ−イソロイシンの生成量が向
上するので好ましい。これらの窒素源及び無機塩には、
ビオチンが含まれないことが必要で、ビオチンがこれら
に含まれていると反応系で微生物の増殖が起り、原料エ
タノールが浪費され父、微生物の増殖による副生成物等
の分離・精製等が煩雑になるので好ましくない。

本発明に用いられる窒素源としては、アンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム等の無機窒素源が好ましく例示でき
、また無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫
酸鉄等が例示される。これらの無機窒素源、無機塩は、
単独でも２種以上混合して用いることもできる。

これら無機９素源及び／又は無機塩の水溶液としての濃
度は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地と同程
度の範囲でよく、特に限定されない。

上述の様に、本発明に使用される酵素反応の水溶液には
、ビオチン又はビオチンを含む天然物は含有されない。

ビオチンの含有されないことの明らかな化学構造公知の
アミノ酸、ビタミン、糖類等は添加することはできる。

本発明の方法においては、酵素反応に用いられる前記の
微生物菌体の使用量は、特に限定されるものではないが
、一般に１〜５０％（ｗｔ、Ａｏｌ）の濃度で便用する
ことが出来る。

本発明において、酵素反応は、約２０〜約５０℃、好ま
しくは約３０〜約４０℃の１度で、通常約１０〜約７２
時間行われる。

上゛記酵素反応は、反応に用いられるエタノールを含有
する水溶液中の溶存酸素濃度がｏ、ｏ　ｓ　ｐｐｍ以上
、８ｐｐｍ以下となる様に、反応系中に空気もしくは酸
素を、連続又間歇的に供給して行うのが好ましい。

上記のような反応方法によって得られる反応液中に生成
したＬ−イソロイシンの分離・精製は、公知のイオン交
換樹脂処理法ろるいは、沈殿法等により行うことができ
る６ 」υＬＬ 以下の実験例において、Ｌ−イソロイシンの定性は、ペ
ーパークロマトグラフのＲｆ値、電気泳動法の易動度、
微生物定量法による生物活性値により確認した。定量は
ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏ
ｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　）人ＴＣＣ８
０４２を用いるマイクロバイオアッセイ法と高速液体ク
ロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）とを併用して行っ
た。また、下記の実験例において聾と表したのは重量％
を意味する。

実施例−１ 培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、ＫＨ
２ＰＯ４０，０５％、ＫｔＨＰＯａ　０．０５％、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２０Ｇ、０５％、ＣａＣｔｚ・２Ｈｚ０　
２ｐｐｍ、ＦｅＳＯ４＊　７Ｈ２０２ｐｐｍ、　　Ｍｎ
ＳＯ４＠　４〜６Ｈ２０２ｐｐｍ。

ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０２ｐｐｍ、　　ＮａＣｌ２　ｐｐ
ｍ、　　ビオチン２００　ｐｔ／Ｌ、　チアミン・Ｉ（
ｃｔ１００μｆ／１１カザミノ酸　０．１％、酵母エキ
ス　０．１％）１００ｄを５００　ｄ容三角フラスコに
分注、滅菌（滅菌後ｐｉ（７，０）した後ブレビバクテ
リウム・フラパＡ　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｆｌａｖｕｍ　）　Ｍ　Ｊ　−２３３（微工研菌寄　第
３０６８号）を植菌し、無菌的にエタノールを２−加え
、３０℃にて２日間振盪培養を行った。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２．３％、ＫＨ２
ＰＯ４Ｇ、０５％、ＫｚＨＰＯｉ　　０．０５％、Ｍｇ
ＳＯ４＊７ＨｚＯＯ，０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈｚ０　
２０　ｐｐｍ。

Ｍｎ５Ｏａ　・ｎＨｚｏ　　２０　ｐｐｍ、ビオテ＞　
　ｚｏｏｐ？／Ａｓチ７ミ／　・Ｈｃｔｌ　００１’　
ｆ／Ｚ　−、カサミ／　酸０−３　％、酵母エキス０．
３％）の１０００ｄを２を容通気攪拌槽に仕込み、滅菌
（１２０℃、２０分間）後、エタノールの２０ｄと前記
前培養物の２０−を添加して、回転数ｔ　ｏ　ｏ　ｏ　
ｒｐｍ、通気量１　ｗｍ％温度３３℃　ｐＨ７，６にて
４８時間培養を行った。

尚、エタノールは、培養中培地の温度が２容量％を越え
ないように、約１〜２時間ごと断続的に参加した。

培養終了後、培養物５０（ｊｄから遠心分離にて集菌し
た。これを脱塩蒸留水にて２度洗浄して得た国体を、反
応液（（ＮＨａ）２ｓＯ４２ｆ／ＡＳＫ山ＰＯ４０，５
ｆ／Ａ；ＫＨ２ＰＯ４Ｑ、、５　ｔ／Ｌ：　ＭｇＳＯ４
・７　Ｈｚ　００．５　ｔ／Ｌ”、　Ｆｅ１ｏ４−７＆
０　２０　ｐｐｍ　；　ＭｎＳＯ４４〜６　＆　０　２
０　ｐｐｍ　：デアミンー塩酸ｘｏｏｐｆ／１−ｓＤＬ
−ｆｆ−ヒドロキシ酪酸ｔｏｆ／ｚ（ｐＨ７，ｓ））の
ｔｏｏＯｄＫａ濁後、該懸濁液を２を容通気攪拌槽に仕
込み、エタノール２０ｄを添加して、回転数３０　Ｏｒ
ｐｍ、溶存酸素濃度０．１９２ｍ５ｉＩｉ度３３℃、ｐ
Ｈ７，６にて１５時間反応を行った。

反応終了後、遠心分離（４ＱＱＯｒｐｍ、ｉｓ分間、４
℃）にて除菌した上溝液中のＬ−イソロイシンを定量し
た。

また、反応終了後の培養液５００１１Ｌｌを、強酸性陽
イオン交換樹脂（Ｈ型）のカラムに通してＬ−イソロイ
シンを吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶出
させたのち、Ｌ−イソロイシン画分をａ縮し、冷エタノ
ールでＬ−イソロイシンの結晶を析出させた。結果を第
１表に示した。

第１表 実施例−２ 実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・７ラ
バＡ　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ
　）　Ｍ　Ｊ　−２３３−ＡＢ−４１（微工研菌寄　第
３８１２号）を培養し、また実施例−１と同様の条件に
て反応させた上清液中のＬ−イソロイシンを定量した。

また、実施例−１と同様にしてＬ−イソロイシンの結晶
を析出させた。結果は第２表に示した。

第２表 実施例−３ 実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・７ラ
パＡ　（Ｂｒｅｖｉｂａｅｔａｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ
　）　Ｍ　Ｊ　−２３３−ＡＢＴ−１１（徴工研菌寄　
第８４２３号）を培養し、また実施例−１と同様の条件
にて反応させた上清液中のＬ−イソロイシンを定量した
。また、実施例−１と同様にしてＬ−イソロイシンの結
晶を析出させた。結果は第３表に示した。

第３表 実施例−４ 実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラ
パＡ　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ
　）　Ｍ　Ｊ　−２３３−ＡＢＤ−２１（微工研菌寄　
第８０５５号）を培養し、また実施例−１と同様の条件
にて反応させた後上清液中のＬ−イソロイシンを定量し
た。また、実施例−１と同様にしてＬ−イソロイシンの
結晶を析出させた。結果を第４表に示した。

第４表 実施例−５ 実施例−１と同様の条件にてプレビバクテリウＡ”フラ
バＡ　（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ
　）　Ｍ　Ｊ　−２３３（微工研菌寄　第３０６８号）
を培養し、培養物１００１１４から遠心分離にて集菌後
、これを硫酸アンモニウムｏ、ｓｒ、ＤＬ−α−ヒドロ
キシ酪酸ｏ、ｓｒ、エタノール１ｄを含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨｙ、５）ｓｏ＊に懸濁し振盪しながら３
０℃、４８時間反応を行った。

−反応終了後、遠心分離にて除菌した上清液中に、Ｌ−
イソロイシンが０．９η／ｗＩ蓄積された。

上記上清液４０ｄから、実施例−１と同様の操作にてＬ
−イソロイシンの結晶を析出させたところ、２０ｗｑの
粗結晶を得た。

特許出願人　　三菱油化株式会社 代理人　弁理士　長　谷　正　久 代理人　弁理士　山　本　隆　也 手続補正書（自発） 昭和６３年１月１３日

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖ
   ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物菌体もしくは
   その固定化物の存在下、Ｌ−又はＤＬ−α−ヒドロキシ
   酪酸又はその塩を、少なくともエタノールを含有する水
   溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−イソロイシンを
   生成せしめ、これからＬ−イソロイシンを採取すること
   を特徴とするＬ−イソロイシンの製造法。
2. （２）該ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
   ｉｕｍ）属に属する微生物がエタノール資化性を有する
   ものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の製造法。