JPH0365193A

JPH0365193A - Ｌ―プロリンの製造方法

Info

Publication number: JPH0365193A
Application number: JP19920689A
Authority: JP
Inventors: Masato Terasawa; 真人寺沢; Miki Ikuta; ミキ生田; Shoichi Nara; 昭一奈良; Makoto Goto; 誠後藤; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1989-08-02
Filing date: 1989-08-02
Publication date: 1991-03-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はＬ−プロリンの製造方法に関し、さらに詳しく
は、対糖収率が優れ、かつ、速い生成速度でＬ−プロリ
ンを製造する方法に関する。

［従来の技術と発明が解決しようとする課題］Ｌ−プロ
リンは、輸液用や血圧降下剤の原料として重要なアミノ
酸の一つであり、近年急激に需要が増加している。

従来、Ｌ−プロリンは主として糖から直接発酵法で生産
されている。

しかしながら、公知の発酵法によるＬ−プロリンの製造
では、微生物菌体の増殖を伴うが由に、Ｌ−プロリンの
対糖収率が低くなることと、Ｌ−プロリンの生成速度が
遅いという欠点を有しており、新たな観点でＬ−プロリ
ンを効率良く生成させる方法の提供が求められていた。

すなわち、本発明の目的は、Ｌ−プロリンの対糖収率が
優れ、かつ速い生成速度でＬ−プロリンを製造する方法
を提供することにある。

［課題を解決するための手段１本発明者は、プレビバクテリウム属に属する特定の菌体
と、特定の水性培地とを作用させることにより、Ｌ−プ
ロリンを優れた対糖収率で、しかも速い生成速度で製造
できることを見い出し、本発明に到達した。

すなわち、（１）プレビバクテリウム属に属するＬ−イソロイシン
要求性の菌体またはその固定化物を、Ｌ−イソロイシン
を含有しない水性培地中で反応させてその反応液中にＬ
−プロリンを生成させ、該反応液からＬ−プロリンを採
取することを特徴とするＬ−プロリンの製造方法である
。

（２）プレビバクテリウム属に属するＬ−イソロイシン
要求性の菌体またはその固定化物を、溶存酸素濃度が０
．５〜８　ｐｐｍの水性培地中で反応させてその反応液
中にＬ−プロリンを生成させ、該反応液からＬ−プロリ
ンを採取することを特徴とするＬ−プロリンの製造方法
である。

（３）プレビバクテリウム属に属するＬ−イソロイシン
要求性の菌体またはその固定化物を、グルコース重量／
′窒素重量が２．０〜４．０の水性培地中で反応させて
その反応液中にＬ−プロリンを生成させ、該反応液から
Ｌ−プロリンを採取することを特徴とするＬ−プロリン
の製造方法である。

（４）プレビバクテリウム属に属するＬ−イソロイシン
およびビオチン要求性の菌体またはその固定化物をビオ
チンを含有しない水性培地中で反応させてその反応液中
にＬ−プロリンを生成させ該反応液からＬ−プロリンを
採取することを特徴とするＬ−プロリンの製造方法であ
る。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に使用することのできる微生物は、プレビバクテ
リウム属に属するＬ−イソロイシン要求性またはＬ−イ
ソロイシンおよびビオチン要求性の微生物であり、好ま
しくは、プレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３
−ＩＬ−０１（微工研菌寄第１０７２９号）である。

このような微生物菌体を調製する培地は、通常微生物が
Ｌ−イソロイシン要求性である場合にはＬ−イソロイシ
ンを、またＬ−イソロイシンおよびビオチン要求性であ
る場合にはＬ−インロイシンおよびビオチンを上記培地
に添加する。微生物菌体を調製するその他の培地として
は、特に限定するものではなく一般の微生物に使用され
るものでよい。

培地に使用する炭素源としては、特に制限されるもので
はないが、グルコースを特に好適に用いることができる
。

窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単
独若しくは混合して用いることができ、無機塩としては
１例えば、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウ
ム、硫酸マグネシウム等を用いることができる。

また、必要に応じ、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、
コーンステイープリカー、カザミノ酸、各種ビタミン等
の栄養素を培地に添加し用いることもできる。

培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行う、培
養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近にて行
い、培養中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加して行
う。

培養開始時のグルコース濃度は、好ましくは１〜５重量
％、さらに好ましくは２〜３重量％が適する。培養期間
は０．５〜３日間、最適期間は１〜２日間である。

このような条件下で培養して得られた微生物菌体は、水
や適当な緩衝液で洗浄した後に、そのまま使用すること
もできるし、上記菌体またはその破砕物を固定化して用
いることもできる。

菌体等を固定化する方法としては、既知の方法を好適に
採用することができ、例えば、アクリルアミド等の重合
性モノマーを用いる方法、アルギン酸塩やカラギーナン
等の適当な担体を用いて不溶化させる方法等を挙げるこ
とができる。

本発明のＬ−プロリンの製造方法においては、このよう
にして得られた微生物菌体またはその固定化物（以下、
単に菌体ということがある）を下記に示す、水性培地中
で作用させることにより、水性培地中の炭素源等と、菌
体の酵素とが反応してＬ−プロリンが生成される。

■第１の発明におけるＬ−イソロイシンを含有しない水
性培地としては、通常Ｌ−イソロイシンを含有しない完
全合成培地を好適に使用することができる。なお、ここ
で、本発明にいう完全合成培地とは、下記炭素源のほか
、無機窒素源及び無機塩を含有する水溶液である。

炭素源としては、特に制限されるものではないが、特に
グルコースが好適に用いられる。

上記水性培地における炭素源濃度は使用する炭素源によ
り一概に決定できないが例えば、炭素源がグルコースの
場合にはＯ７，５〜３０重量％、好ましくは１〜２０重
量％である。

無機窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等が挙げられ、また無機塩としては、例え
ば、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫
酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等を挙げること
ができる。

これらの無機窒素源、無機塩は、単独でも２種以上混合
して用いることもできる。

完全合成培地の一例を示すと、上記炭素源のほか、（Ｎ
Ｈ，）　　Ｓｏ、　　５０ｇ／Ｉ２、ＫＨ，ＰＯ４０，
５ｇ／Ｉ２、Ｋ、ＨＰｏ。

０．５ｇ／Ｉ２、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，ＯＯ，５ｇ
／１２、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２０ｐｐｌＩ。

Ｍｎ’ＳＯ４・４〜６８　＊　０　２０　ｐｐｌＩを含
有するｐＨ７，６の水溶液が挙げられる。

上述の様に、本発明に使用される完全合成培地には、Ｌ
−イソロイシン又はＬ−イソロイシンを含む天然物は含
有されないが、Ｌ−イソロイシンを含有しないアミノ酸
、ビタミン、糖類等を添加することはできる。

■第２の発明における溶存酸素濃度が０．５〜８　ｐｐ
ｍの水性培地は、空気または酸素を連続または間欠的に
水性培地に供給することにより得ることができる。

水性培地としては、通常、完全合成培地を好適に使用す
ることができる。なお、水性培地における炭素源、窒素
源、無機塩等は、前記のに記載の水性培地と同様のもの
を用いることができる。

炭素源濃度は、使用する炭素源の種類により一概に決定
できないが、例えば炭素源がグルコースの場合には、０
．５〜３０重量％、好ましくは１〜２０重量％である。

完全合成培地の一例を示すと、上記炭素源のほか、（Ｎ
Ｈ４）　　Ｓｏ、　　５０ｇ／ｆ２、ＫＨｚ　　ＰＯ−
０，５ｇ／β、　Ｋ、ＨＰｏ。

０、　５ｇ／Ｉ２、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・　７Ｈ，００，
５ｇ／１２、Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈｚ　　０　　２
０　　ｐｐｍ。

Ｍｎ５Ｏ４・４〜６Ｈ２０２０ｐｐｍを含有するｐＨ７
，６の水溶液が挙げられる。

上述の様に、本発明に使用される完全合成培地には、Ｌ
−インロイシン又はＬ−イソロイシンを含む天然物は含
有されないが、Ｌ−イソロイシンを含有しないアミノ酸
、ビタミン、糖類等を添加することはできる。

■第３の発明におけるグルコース重量／窒素重１１が２
．０〜４．０の水性培地は、グルコース重量ｌに対して
窒素源中の窒素重量０．２５〜０．５を含有する水性培
地である。

水性培地は、通常、完全合成培地を好適に使用すること
ができる。

なお、水性培地における窒素源、無機塩等は前記のに記
載の水性培地と同様のものを用いることができる。

グルコース濃度は、０．５〜３０重量％、好ましくは、
１〜２０重量％である。

窒素源濃度は、窒素重量として、０．２〜１２重量％、
好ましくは０．２５〜１０重量％である。

完全合成培地の一例を示すと、上記グルコースおよび窒
素源のほか、ＫＨ，、Ｐｏ、　　０．５ｇ／１２、Ｋ、
ＨＰＯ，０，５ｇ／Ｅ、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　　・７Ｈ，
００，５ｇ／ｆ２、ＦｅＳＯ４・７ＨａＯ２０ｐｐｍ、
ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ＊０　２０ｐｐｍを含有するｐＨ
７，６の水溶液が挙げられる。

■第４の発明におけるビオチンを含有しない水性培地と
しては、通常、ビオチンを含有しない、完全合成培地を
好適に使用することができる。

なお、水性培地における炭素源、窒素源、無機塩等は、
前記のに記載の水性培地と同様のものを使用することが
できる６炭素源濃度は、使用する炭素源の種類により一概に決定
できないが、例えば炭素源がグルコースの場合には、０
．５〜３０重量％、好ましくは、１〜２０重量％である
。

完全合成培地の一例を示すと、上記炭素源のほか、（Ｎ
Ｈ，）　　Ｓｏ、　　５０ｇ／ｆｉ、ＫＨ２ＰＯ４０，
５ｇ／Ｉ２、Ｋ、ＨＰｏ。

０．５ｇ／Ｉ２、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，００，５ｇ
／Ａ、ＦｅＳＯ４−７Ｈｚ　０　２０　　ｐｐｍ、Ｍｎ
５Ｏ４・４〜６Ｈｚ　０　２０　ｐｐｍを含有するｐＨ
７，６の水溶液が挙げられる。

上述の様に、本発明に使用される完全合成培地には、ビ
オチン又はビオチンを含む天然物は含有されないが、ビ
オチンを含有しないアミノ酸、ビタミン、糖類等を添加
することはできる。

本発明のＬ−プロリンの製造方法は、Ｌ−イソロイシン
要求性の菌体と、前記■、■もしくは■に記載の水性培
地とを、またはＬ−イソロイシンおよびビオチン要求性
の菌体と前記■に記載の水性培地とを作用させ、その反
応液中にＬ−プロリンを生成させた後、該反応液からＬ
−プロリンを採取する。

菌体の使用量は、特に制限されるものではないが、一般
に１〜５０％（重量／容量）の濃度で使用することがで
きる。

本発明において、酵素反応は、約２０〜約５０℃、好ま
しくは約３０〜約４０°Ｃの温度で、通常約１０〜約７
２時間行われる。

上記のような反応によって得られる反応液中に生成した
Ｌ−プロリンの分離・精製は、それ自体既知の方法に従
い、例えばイオン交換樹脂処理法、沈澱法等を適宜組合
せて行うことができる。

［実施例］次に、実施例を挙げて本発明の方法をさらに具体的に説
明する。下記の実施例において、Ｌ−プロリンの定性は
、ペーパークロマトグラフのＲｆ値、電気泳動法の易動
度、微生物定量法による生物活性値により確認した。定
量はロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｏｕｃｏ
ｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓｌ　Ａ　Ｔ　
ＣＣ８０４２を用いるマイクロバイオアッセイ法と高速
液体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）とを併用し
て行った。

グルコース残存量の定量は、グルコース定量用キット（
和光純薬工業製ニゲルコースＣテストワコー）により行
った。また、下記の実験例において％と表したのは重量
％を意味する。

（実施例１）直生史田玉前培養培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％
、ＫＨ，ＰＯ４０，０５％、Ｋｇ　）ＩＰＯ４０，０５％、　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４７
Ｈ１００，０５％、Ｃａ　ＣＱ　＊　・２　Ｈ２０２ｐ
ｐｍ、　　ＦｅＳＯ４・７Ｈ＊　０　２　　ｐｐｍ。

ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈｚ　　０　　２　　ｐｐｍ、Ｚｎ
５Ｏｎ　　・７Ｈ＊　０　２　　ｐｐｍ、ＮａＣｆ２２
ｐｐ＋ｍ、ビオチン　２００μｔ／１２、チアミン・塩
酸塩　１１００ＩＪ／Ｉ２、Ｌ−イソロイシン２００ｍ
ｇ／β、カザミノ酸　０．１％及び酵母エキス０．１％
）１００１Ｒ１を５００１Ｒ１容三角フラスコに分注、
滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）した後、プレビバクテリウム
・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖ
ｕｎ＋ＩＭＪ−２３３−ＩＬ−０１（微工研菌寄第１０
７２９号）を植菌し、無菌的にグルコースを５ｇ／２の
濃度になるように加え、３０℃にて１日間振盪培養を行
った。

次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸アンモニウム
　２．３％、ＫＨ，ＰＯ，０，０５％、Ｋ、ＨＰｏ、　
　０．０５％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４７Ｈ１Ｏ０，０５％、
Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈｚ　０２０　　ｐｐｍ、Ｍｎ
ＳＯ４・４〜６８ｇ　Ｏ２０ｐｐｎ＋、ビオチン　２０
０μｇ／１２、チアミン・塩酸塩　１００縄／Ｉ２、Ｌ
−イソロイシン　４００ｍｇ／Ｉ２、カザミノ酸　０．
３％及び酵母エキス０．３％）の１０００−を２１２容
通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、
前記前培養物の２０−を添加して、ｌｏｏｏｒｐｍにて
撹拌した後に、通気量１　　ｖｖａ＋、温度３３℃、ｐ
Ｈ７，６にて２４時間培養を行った。

このようにして得られた培養物ｆｏｏＮｌずつを遠心分
離して集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄して、菌体を調
製した。

Ｌ−プロ１ンの１造得られた菌体を水性培地［グルコース　５０ｇ／β、　
（ＮＨ４１ａ　　ＳＯ４５０ｇ／β、ＫＨｚ　ＰＯ４０
，５ｇ／１２、Ｋ、ＨＰＯ４０、５ｇ／１２、Ｍ　ｇ　
Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，００，５ｇ／Ｉ２、ＦｅＳＯ４・７Ｈ
＊０　２　ｐｐｍ、チアミン・塩酸塩　２００μｇ／Ｊ
２、ビオチン　４００μＨ／１２　（ｐＨ７，０）］　
５０ｍｔ’に懸濁し、ｐＨ調整のため、乾熱滅菌（１５
０℃、５時間加熱）した炭酸カルシウムを５０　ｇ／１
２の濃度で添加して酵素反応液とした。酵素反応は５０
Ｃ１ｔｔ’三角フラスコを用い、３３℃、回転数２２Ｏ
ｒｐｍにて４０時間振盪により行った。

反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１５分間、４
℃）にて除菌した上清液４ＯＮ１をアンバーライトＩＲ
−１２０のカラムに吸着せしめ、アンモニア水にて溶出
した。この溶出液を減圧下に濃縮し、残渣を無水エタノ
ールに溶解しエーテルを加えてＬ−プロリンを析出せし
めた。これを再結晶することによりＬ−プロリンの粗結
晶を得た。

一方、対照区として、Ｌ−イソロイシンを２００ｍｇ／
Ｉ２添加したほかは、上記と同様にしてＬ−プロリンの
粗結晶を得た。

得られたＬ−プロリンの生成量と回収量を第１表に示す
。

（実施例２）直生立益量実施例１と同様の本培養培地１５００ｍｔ’を３β容通
気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、実
施例１と同様の前培養物３０ｍ１を添加して、１１００
０ｒｐにて撹拌後、通気量１　　ｖｖｍ、温度３３℃、
ｐＨ７，６にて２４時間培養を行った。

このようにして得られた培養物３５０Ｍ１ずつを遠心分
離して集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄して、菌体を調
製した。

Ｌ−プロリンの°゛２得られた菌体を水性培地［グルコース　１００ｇ／Ｉ２
、　（Ｎ　Ｈ＊ｌ＊　　Ｓ　Ｏ４５０ｇ　／　ｔ２、Ｋ
Ｈ，ＰＯ，０，５ｇ／Ｉ２、Ｋ、ＨＰｏ。

０．５ｇ／Ｑ、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，００，５ｇ／
Ｅ、ＦｅＳＯ４・７ＨｘＯ２ｐｐｍ、チアミン・塩酸塩
　１００ｔ１ｔ／β、及びビオチンｌＯＯμｇ／Ａ　（
ｐＨ７，ｏ）コ５００ｙｄに懸濁後、反応液中の溶存酸
素濃度が第２表に示した実験区になるよう通気撹拌を行
った。またｐＨ調整のため、５Ｎ−ＮａＯＨを添加した
１反応は１１２容通気撹拌槽を用い、３３℃、にて４０
時間振盪反応を行った。　　ノ反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、　　１５分間
、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−プロリン量を定量
した。

結果を第２表に示す。

（実施例３）直生公適１実施例１と同様に菌体を調製した。

Ｌ−プロｌンの１゛２得られた菌体を水性培地［グルコース　１００ｇ／１２
、ＫＨｚ　　ＰＯ４０，５ｇ／Ｉ２、ＫＩ　ＨＰＯ，０
，５ｇ／１２、ＭｇＳＯ４７Ｈ！０　０．５ｇ／ｆｆ、
ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０２ｐｐｍ、チアミン・塩酸塩　１
００ｔ４／１２、ビオチン　１００μｇ＃！　（ｐＨ７
，ｏ）］　５５０Ｍに懸濁後、グルコース重量／窒素重
量比が第３表に示した実験区になるよう窒素源を添加し
た。なお、窒素源としては硫酸アンモニウムを用いた。

またｐｔｉ調整のため、乾熱滅菌（１５０℃、５時間加
熱）した炭酸カルシウムを５０　ｇ／４２の濃度で添加
した０反応は５００Ｗ１１三角フラスコを用い、３３℃
、回転数２２Ｏｒｐｍにて４０時間振盪反応を行った。

反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｎ＋、　　１５分
間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−プロリン量及び
グルコース残量を定量した。

結果を第３表に示す。

（実施例４）直生匹適１実施例１と同様に菌体を調製した。

Ｌ−プロリンの１′告得られた菌体を水性培地［グルコース　５０ｇ／１２、
（ＮＨ，）２　ＳＯ２５０ｇ／ｆｆ、ＫＨ，ＰＯ，０，
５ｇ／β、ＫＩ　ＨＰＯ４０；５ｇ／Ｉ２、Ｍ　ｇ　Ｓ
　Ｏａ　・７Ｈ２００，５ｇ／Ｑ、Ｆｅ５０＋　・７Ｈ
ｚ０　２　ｐｐｍ、チアミン・塩酸塩　２００μｇ／Ｉ
２、Ｌ−イソロイシン２００μｇ／β（ｐＨ７，０）］
　ＳＯ０に懸濁し、ｐＨ調整の為、乾燥滅菌（１５０℃
、５時間加熱）した炭酸カルシウムを５０ｇ／βの濃度
で添加して酵素反応液とした。酵素反応は５００ｔｔ’
三角フラスコを用い、３３℃、回転数２２０ｒｐｍにて
３５時間振盪により行った。

反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｎ＋、１５分間、
４℃）にて除菌した上清液４０ｙｄから、実施例１と同
様にして、Ｌ−プロリンの粗結晶を得た。

一方、対照区として、ビオチン２００１１Ｉｇ／Ｉ２添
加したほかは、上記と同様にしてＬ−プロリンの粗結晶
を得た。

得られたＬ−プロリンの生成量１回収率および対グルコ
ース収率を第４表に示す。

第　　１　　表第２表［発明の効果］本発明によると、Ｌ−プロリンを速い生成速度でしかち
優れた対糖収率で得ることができるＬ−プロリンの製造
方法を提供することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）プレビバクテリウム属に属するＬ−イソロイシン
要求性の菌体またはその固定化物を、Ｌ−イソロイシン
を含有しない水性培地中で反応させてその反応液中にＬ
−プロリンを生成させ、該反応液からＬ−プロリンを採
取することを特徴とするＬ−プロリンの製造方法。
（２）プレビバクテリウム属に属するＬ−イソロイシン
要求性の菌体またはその固定化物を、溶存酸素濃度が０
．５〜８ｐｐｍの水性培地中で反応させてその反応液中
にＬ−プロリンを生成させ、該反応液からＬ−プロリン
を採取することを特徴とするＬ−プロリンの製造方法。
（３）プレビバクテリウム属に属するＬ−イソロイシン
要求性の菌体またはその固定化物を、グルコース重量／
窒素重量が２．０〜４．０の水性培地中で反応させてそ
の反応液中にＬ−プロリンを生成させ、該反応液からＬ
−プロリンを採取することを特徴とするＬ−プロリンの
製造方法。
（４）プレビバクテリウム属に属するＬ−イソロイシン
およびビオチン要求性の菌体またはその固定化物を、ビ
オチンを含有しない水性培地中で反応させてその反応液
中にＬ−プロリンを生成させ、該反応液からＬ−プロリ
ンを採取することを特徴とするＬ−プロリンの製造方法
。