JPH0249598A - 微生物を用いるｄ−アラニンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−アラニンを分解する微生物を用いてＤＬ−
アラニンからＤ−アラニンを製造する方法に関する。

〔従来技術〕

Ｄ−アラニンはペプチド系の抗生物質や人工甘味料など
の化学合成原料として重要なアミノ酸である。

従来、トルロプシス属、キャンディダ属、クリプトコツ
カス属およびサツカロミセス属の微生物ヲ用いてＤＬ−
アラニンからＤ−アラニンとピルビン酸を生産、単離精
製する方法が知られている（特公昭４２−２０６８３；
発酵と代謝１５．８９（１９６７）　）。

〔解決しようとする課題〕

しかしながら、上記の方法は、反応終了液中のＤ−アラ
ニン濃度が１０ｇ＃を以下と極めて低いという欠点があ
り、工業的に使用しうる効率的なり一アラニンの製法の
開発が望まれていた。

〔発明の構成及び効果〕

本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ＤＬ−アラニンの
うち、Ｌ−アラニンのみを、ピルビン酸を経ることなく
、選択的に分解し得る微生物を見出し本発明を完成する
に至った。

即ち、本発明は、キャンディダ属、サツカロミコプシス
属、シゾサツカロミセス属、デバリオミセス属又はピキ
ア属に属し、Ｌ−アラニンの分解活性を有する微生物を
ＤＬ−アラニンに作用させることによって、Ｌ−アラニ
ンを選択的に分解せしめることを特徴とするＤ−アラニ
ンの製法である。

本発明に使用される微生物としては、キャンディダ属、
サツカロミコプシス属、シゾサツカロミセス属、デバリ
オミセス属、ピキア属に属し、Ｌアラニンの分解活性を
有する微生物であればよく、具体的には、例えば、キャ
ンディダ・マルトーサ（Ｃ：ａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏ
ｓａ　）　ＪＣＭ　１５０４、サツカロミコプシス・リ
ポリティカ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｏ　ｓｉｓ旦Ｌｈ
旦９）　ＩＰｏ　１５４Ｂ、シゾサツカロミセス・リク
エファシエンス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅ
ｓ　Ｉｉ　ｕｅＬ匹違狙０−ＩＦＯ０３５８、デバリオ
ミセス・ハンゼニイＤｅｂａｒ　ｏｍ　ｃｅｓ　ｈａｎ
ｓｅｎｉｉ）　　ＩＦＯ００１５、ピキア・バストリス
−仕力」違り腫互いＬ堕）　ＩＰｏ　０９４８　　等を
好適に用いることができ、これらは理化学研究所微生物
系統保存施設（ＪＣＭ）及び財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）から容易に入手することができる。

微生物を培養する培地としては、上記微生物が生育増殖
し得るものであればいずれの培地でもよい。例えば、炭
素源として、ブドウ糖、蔗糖、糖蜜の如き糖類、フマル
酸やクエン酸の如き有機酸又はグリセロールの如きアル
コール類等を４〜１５％、窒素源として、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウムの如き無機アンモニウム塩又は
尿素、或いはペプトン、コーン・ステイープ・リカー、
酵母エキス、カゼイン加水分解物などを０．３〜２．０
％の範囲で含有する培地を好適に用いることができる。

更に必要に応じて、燐酸塩、マグネシウム塩、カリウム
塩、カルシウム塩等の無機塩、鉄、マンガン、銅、亜鉛
等の金属イオンが適当量培地に存在してもよい。又、合
成培地を用いる場合には、必要に応じて、例えば、ビオ
チンやチアミン等のビタミン類或いはカルニチン等の生
育促進物質を添加してもよい。これらの培地はｐＨを５
〜７に調整して用いることが好ましい。

微生物の培養は上記培地に微生物を接種し、室温〜加温
下、振盪培養成いは通気攪拌の如き好気的条件下で培養
することによって好適に実施することができる。

Ｌ−アラニンの分解反応１よ、微生物菌体を含む基質溶
液を室温〜加温下で１〜４日間通気攪拌することにより
実施できる。反応に際しては培養液をそのまま用いるこ
ともでき□るが、微生物菌株の洗浄菌体を用いることも
できる。基質であるＤＬ−アラニンは１０〜３０％の濃
度で反応に供することができるが、とりわけ１０〜２０
％の濃度で供するのが好ましい。又、ＤＬ−アラニンは
反応開始時に全量を添加してもよいが、分割して添加す
れば、より短時間で反応を完結させることができるので
好ましい。分解反応に際しては、リン酸カリウムや硫酸
マグネシウムを０．０５〜０．５％、また必要に応じて
反応を促進する金属イオン類やビタミン類を添加しても
よい。反応液のｐＨは５〜７が好ましく、とりわけ５．
８〜６．２が好ましい。

Ｄ−アラニンの単離は、反応終了液から菌体をろ去し、
得られたろ液をイオン交換樹脂で処理するなどの常法に
よって容易に実施することができる。

以下に実施例をあげて本発明を更に詳細に説明する。

なお、Ｄ−アラニンの定量はＤ−アミノ酸オキシダーゼ
を用いる酵素法〔メソソヅ・オプ・エンザイマテインク
・アナリシス、第３版、第８巻。

３３６〜３４０頁（バーグメイヤーら編、　ＶＣ１１パ
ブリッシャーズ、　１９８５）　］によって、・］又し
−アラニの定量はＬ−アラニン・デヒドロゲナーゼを用
いる酵素法〔メソッヅ・オブ・エンザイマティック・ア
ナリシス、第３版、第８巻、３４１〜３４４頁（バーグ
メイヤーらＢ、　ｖｃｎパプリッシャーズ：１９８５）
〕によって行った。

実施例１ 第１表に示す菌株を酵母用斜面培地で一夜培養したのち
、前培養培地にそれぞれ１白金耳を接種する。次いで、
３０℃で往復振盪培養機（振幅７ｃｍ、１２０回転／分
）を用いて２０時間培養する。′か（して得られた前培
養液１６−を本培養培地１．６１に接種し、３．０１容
ジャーファーメンタ−で３０℃、通気量１．６１　／分
、攪拌数約９００回転／分の条件下で、２０時間培養し
た後、集菌・洗浄し、得られた菌体を１．Ｏｌの水に懸
濁し、ＤＬ−アラニン８０ｇ１リン酸２カリウム９．８
ｇ、リン酸１カリウム１．４ｇ及び硫酸マグネシウム７
水和物４ｇを添加後、液量を１．６βとする。次にこの
反応液をジャーファーメンタ−中、５Ｎ硫酸でｐＨｓ、
ｓ〜６，２に調整しつつ、３０℃、通気量１．Ｅｌ／分
、撹拌数約９００回転／分の条件下で通気攪拌する。反
応開始後１０時間でＤＬ−アラニン８０ｇを添加し、更
に３８時間反応させる。反応終了液中のＤ−アラニン量
は第１表の通りであった。また、反応終了液中には、Ｌ
−アラニンはほとんど認められなかった。

なお、上記で使用した培地の組成は以下の通りである。

酵母用斜面培地； 本培養培地組成； 第１表 前培養培地； 下記組成の溶液１００ｄを５０〇−容振とうフラスコに
注入し、滅菌したもの 実施例２ 実施例１と同様にしてピキア・パストリスＩＦＯ０９４
８を培養し、水で洗浄して洗浄菌体を調製する。ついで
、菌体を１．０１の水に懸濁し、ＤＬ−アラニン　１１
０　ｇ　、リン酸１カリウム９．８ｇ、リン酸２カリウ
ム１．４ｇおよび硫酸マグネシウム７水和物４ｇ及びｄ
−ビオチン０．６４■を添加して液量を１．６１！とじ
、実施例１と同条件でｐＨを５．８〜６．２に調整しつ
つ、通気攪拌する。反応開始１５時間後にＤＬ−アラニ
ン１１０ｇを添加し、さらに３３時間、通気攪拌を続け
る。反応終了液中のＤ−アラニン量は６３．１ｇ／　Ｉ
ｌであり、Ｌ−アラニンは殆ど認められなかった。

上記のＤ−アラニン１０１ｇを含む反応終了液１．６ｍ
２をろ過によって菌体等の不溶物をろ去し、次いで、ろ
液を陽イオン交換樹脂（Ｈ”型）を充填したカラムに導
通し、水洗後吸着したＤ−アラニンを５％アンモニア水
で溶出する。溶出液を減圧下に濃縮した後、冷却し、析
出した結晶をろ取することによって、Ｄ−アラニンの結
晶８３．５　ｇを得た。この結晶の比旋光度（Ｃ＝１０
．　６Ｎ　ＨＣＩ　）は−１４，７°であった。また、
Ｌ−アラニンの混在量をＬ−アラニン・デヒドロゲナー
ゼを用いる酵素法によって測定したが、Ｌ−アラニンは
検出できなかった。

実施例３ 実施例１と同様にしてキャンディダ・マルトーサＪＣＭ
　１５０４の前培養液を得る。この前培養液１６−を本
培養培地１．６１に接種し、３．０７！容ジャーファー
メンタ−で３０℃、通気量１．６β／分、攪拌数９００
回転／分の条件下で、２０時間培養した後、得られた培
養液５００−にＤＬ−アラニン１６０ｇ、リン酸１カリ
ウム９．８ｇ、リン酸２カリウム１．４ｇ１硫酸マグネ
シウム７水和物４ｇ及びｄ−ビオチン０．６４■を添加
し液量を１．６１とする。ｐＨを５．８〜６．２に調整
しつつ、３０℃、通気量１．６１！分、撹拌数１２００
回転／分の条件下で通気攪拌する。２４時間後にＤＬ−
アラニン１６０ｇを添加し、さらに２４時間通気攪拌を
続ける。反応終了液中のＤ二アラニン量は　９２．７ｇ
／ｊ！、又Ｌ−アラニン量は０．１’ｇ／Ｉｔ以下であ
った。この反応終了液１．６１から実施例２と同様に処
理することによってＤ−アラニンの結晶１２３．１　ｇ
を得た。この結晶の比旋光度は−１４，６”であり、Ｌ
−アラニンは認められなかった。

なお、上記で使用された本培養培地の組成はグルコース
：４．０χ、リン酸１カリウム：０．５χ、硫酸アンモ
ニウム：０．３χ、硫酸マグネシウム７水和物：　Ｏ，
ＯＳχ、塩化カリウム：　０．０５χ、塩化カルシウム
２水和物：　ｏ、ｏｉχ、ｄ−ビオチン：０．４■／ｌ
硫酸銅５水和物：　　０．０５■／β、ヨウ化カリウム
：　　０．２１■／１、硫酸マンガン４〜５水和物：　
　０．６８■／ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水和物：
　０．４８■／１１ホウ酸：　０．０４６■／ｌ、硫酸
亜鉛７水和物：　５．０３　ａｔ／ｊ１、塩化第二鉄６
水和物：　５．６４■／ｌ、（ｐＨｓ　６．０　）であ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. キャンディダ属、サッカロミコプシス属、シゾサッカロ
   ミセス属、デバリオミセス属又はピキア属に属し、Ｌ−
   アラニンの分解活性を有する微生物をＤＬ−アラニンに
   作用させることによって、Ｌ−アラニンを選択的に分解
   せしめることを特徴とするＤ−アラニンの製法。