JPH0191790A - 発酵法によるl−フェニルアラニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるl−フェニルアラニンの製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は発酵法によるL−フェニルアラニンの製造法に
閃する。
閃する。
〈従来の技術〉
従来、シトロバクタ−属の微生物を用いるL−フェニル
アラニンの製造法としては、桂皮酸とアンモニアを原料
とする酵素法(特開昭61−271998号公報)など
が知られている。
アラニンの製造法としては、桂皮酸とアンモニアを原料
とする酵素法(特開昭61−271998号公報)など
が知られている。
〈発明が解決しようとする問題点〉
しかしながら、従来の方法は、高価な前駆体を使用する
ものであり、経済的に極めて不利な方法であった。
ものであり、経済的に極めて不利な方法であった。
〈問題点を解決するための手段および作用〉そこで、本
発明者らは、前記問題点を解決すべく鋭意研究の結果、
発酵法によってL−フェニルアラニンが著量蓄積するこ
とを見い出し、本発明に到達した。
発明者らは、前記問題点を解決すべく鋭意研究の結果、
発酵法によってL−フェニルアラニンが著量蓄積するこ
とを見い出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明はシトロバクタ−属に属し、かつレー
フェニルアラニン生産能を有する微生物を、液体培地中
で好気的に培養してL−フェニルアラニンを培養液中に
生成・蓄積せしめ、該培養液よりL−フェニルアラニン
を採取することを特徴とする発酵法によるし−フェニル
アラニンの製造法である。
フェニルアラニン生産能を有する微生物を、液体培地中
で好気的に培養してL−フェニルアラニンを培養液中に
生成・蓄積せしめ、該培養液よりL−フェニルアラニン
を採取することを特徴とする発酵法によるし−フェニル
アラニンの製造法である。
シトロバクタ−属に属する微生物が発酵法によりL−フ
ェニルアラニンを著量に生成・蓄積せしめ得ることはこ
れまで全く知られていない。
ェニルアラニンを著量に生成・蓄積せしめ得ることはこ
れまで全く知られていない。
次に本発明の詳細な説明する。
本発明で用いられる微生物はシトロバクタ−属に属し、
かつし−フェニルアラニン生産能を有する微生物であれ
ば特に限定されない、好ましくは、シトロバクタ−属に
属し、フェニルアラニン代謝拮抗物質に耐性を有する変
異株を用いる。フェニルアラニン代謝拮抗物質としては
、例えば、O−フルオロフェニルアラニン、β−チエニ
ルアラニンなどが挙げられる。
かつし−フェニルアラニン生産能を有する微生物であれ
ば特に限定されない、好ましくは、シトロバクタ−属に
属し、フェニルアラニン代謝拮抗物質に耐性を有する変
異株を用いる。フェニルアラニン代謝拮抗物質としては
、例えば、O−フルオロフェニルアラニン、β−チエニ
ルアラニンなどが挙げられる。
本発明で用いられる微生物の代表的なものとしては例え
ば以下のものがある。シトロバクタ−・フロインディー
(Citrobacter freundii)OF
PR72(微工研菌寄第9537号)。
ば以下のものがある。シトロバクタ−・フロインディー
(Citrobacter freundii)OF
PR72(微工研菌寄第9537号)。
この菌株はシトロバクタ−・フロインディーIF013
545より誘導された変異株で0−フルオロフェニルア
ラニンに耐性な変異株である。
545より誘導された変異株で0−フルオロフェニルア
ラニンに耐性な変異株である。
変異株の誘導は通常の変異株処理法によって比較的容易
に行うことができる。
に行うことができる。
すなわち、フェニルアラニン代謝拮抗物質に耐性を有す
る変異株は、親株を紫外線照射するか、あるいは変異誘
発剤(例えばN−メチル−N゛−ニトロ−N−ニトロソ
グアニジン、エチルメタンスルホン酸など)で処理した
のち、親株が生育できないような量のフェニルアラニン
代謝拮抗物質を含む培地で生育できるような菌株を採取
すればよい。ここで、フェニルアラニン代謝拮抗物質に
耐性を有する変異株とは、その親株より強い耐性を有す
る菌株のことであり、好ましくは、親株の24時間後の
相対生育度が40%以下になるようなフェニルアラニン
代謝拮抗物質を含む培地で培養した場合の相対生育度が
50%以上を示すようなものをいう。
る変異株は、親株を紫外線照射するか、あるいは変異誘
発剤(例えばN−メチル−N゛−ニトロ−N−ニトロソ
グアニジン、エチルメタンスルホン酸など)で処理した
のち、親株が生育できないような量のフェニルアラニン
代謝拮抗物質を含む培地で生育できるような菌株を採取
すればよい。ここで、フェニルアラニン代謝拮抗物質に
耐性を有する変異株とは、その親株より強い耐性を有す
る菌株のことであり、好ましくは、親株の24時間後の
相対生育度が40%以下になるようなフェニルアラニン
代謝拮抗物質を含む培地で培養した場合の相対生育度が
50%以上を示すようなものをいう。
本発明におけるL−フェニルアラニン生産用の液体培地
は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその
他の有機微量成分を含有する通常の液体培地である。炭
素源としては、グルコース、フラクトースやでん粉およ
びセルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、フマール
酸、クエン酸、コハク酸などのごとき有機酸、グリセロ
ールのごとごとアルコール■などを2〜15%、窒素源
として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩
、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを0.5〜
4.0%、これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸第1鉄7水和物、塩化マンガン4水和物など
が少量添加される。
は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその
他の有機微量成分を含有する通常の液体培地である。炭
素源としては、グルコース、フラクトースやでん粉およ
びセルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、フマール
酸、クエン酸、コハク酸などのごとき有機酸、グリセロ
ールのごとごとアルコール■などを2〜15%、窒素源
として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩
、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを0.5〜
4.0%、これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸第1鉄7水和物、塩化マンガン4水和物など
が少量添加される。
培養は好気的条件で行う。培養の間、液体培地のpHは
5から9に、温度は24〜37℃に調節し、48〜12
0時間振盪または通気培養すれば好ましい結果が得られ
る。
5から9に、温度は24〜37℃に調節し、48〜12
0時間振盪または通気培養すれば好ましい結果が得られ
る。
培養液からフェニルアラニンを採取する方法は常法に従
って行えばよく、培養液から菌体を分離除去したのち、
濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる方法
などにより採取される。
って行えばよく、培養液から菌体を分離除去したのち、
濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる方法
などにより採取される。
〈実施例〉
以下実施例により、本発明を具体的に説明する。
実験例1
(O−フルオロフェニルアラニン耐性変異株の取得)
シトロバクタ−・70インデイ−IFO13545の菌
体に通常の方法でN−メチル−N−一二トローN−二ト
ロソグアニジン処理(150μg / ml、37℃、
15分)したのち、この細胞を5−フルオロ−D、L−
フェニルアラニン0.1g/jを添加した寒天平板培地
(グルコース0.2%、硫安0.1%、リン酸第−カリ
ウム0.2%、リン酸第二カリウム0.7%、硫酸マグ
ネシウム7水和物0.01%、クエン酸ナトリウム0.
05%を含む合成培地)に塗布した0次に37℃で4〜
6日間培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離して、
O−フルオロフェニルアラニン耐性変異株シトロバクタ
−・フロインディー0FPR72(微工研菌寄第953
7号)を取得した。
体に通常の方法でN−メチル−N−一二トローN−二ト
ロソグアニジン処理(150μg / ml、37℃、
15分)したのち、この細胞を5−フルオロ−D、L−
フェニルアラニン0.1g/jを添加した寒天平板培地
(グルコース0.2%、硫安0.1%、リン酸第−カリ
ウム0.2%、リン酸第二カリウム0.7%、硫酸マグ
ネシウム7水和物0.01%、クエン酸ナトリウム0.
05%を含む合成培地)に塗布した0次に37℃で4〜
6日間培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離して、
O−フルオロフェニルアラニン耐性変異株シトロバクタ
−・フロインディー0FPR72(微工研菌寄第953
7号)を取得した。
実験例2
(O−フルオロフェニルアラニン耐性変異株の耐性度)
下記第1表に示す各菌株を液体り培地(トルグトン1%
、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウム0.5%、をp
87.5)用いて30℃で6時間振盪培養し、生育した
菌体を集菌し生理食塩水でよく洗浄した。この菌体懸濁
液を、0−フルオロフェニルアラニン0.0.5.5m
Mの濃度でそれぞれ含む最少培地(培地組成ニゲルコー
ス0.2%、硫安0.1%、リン酸第1カリウム0.2
%、リン酸第2カリウム0.7%、硫酸マグネシウム7
水和物0.01%、クエン酸ナトリウム0.05%)5
m目こ植菌して、30℃で14時間培養し、各菌株の生
育度を調べた。その結果は第1表に示すとおりである。
、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウム0.5%、をp
87.5)用いて30℃で6時間振盪培養し、生育した
菌体を集菌し生理食塩水でよく洗浄した。この菌体懸濁
液を、0−フルオロフェニルアラニン0.0.5.5m
Mの濃度でそれぞれ含む最少培地(培地組成ニゲルコー
ス0.2%、硫安0.1%、リン酸第1カリウム0.2
%、リン酸第2カリウム0.7%、硫酸マグネシウム7
水和物0.01%、クエン酸ナトリウム0.05%)5
m目こ植菌して、30℃で14時間培養し、各菌株の生
育度を調べた。その結果は第1表に示すとおりである。
本発明方法で使用する5−フルオロフェニルアラニン耐
性変異株シトロバクタ−・フロインディー0FPR72
は、親株のシトロバクタ−・フロインディーIF013
545と比較して、0−フルオロフェニルアラニンによ
って生育が阻害されず、0−フルオロフェニルアラニン
に対する耐性を獲得していることが明らがである。
性変異株シトロバクタ−・フロインディー0FPR72
は、親株のシトロバクタ−・フロインディーIF013
545と比較して、0−フルオロフェニルアラニンによ
って生育が阻害されず、0−フルオロフェニルアラニン
に対する耐性を獲得していることが明らがである。
第 1 表
※)培養液の660nmにおける濁度を測定し、各菌株
のO−フルオロフェニルアラニンを添加していない培養
液の濁度を100%として表わした。
のO−フルオロフェニルアラニンを添加していない培養
液の濁度を100%として表わした。
実施例1
下記の組成の発酵用培地40m1をIJ!容三角フラス
コに入れ、115℃で15分蒸気滅菌した。これに第2
表に示す各菌株−白金耳植菌し、30℃で96時間回転
振盪培養した。
コに入れ、115℃で15分蒸気滅菌した。これに第2
表に示す各菌株−白金耳植菌し、30℃で96時間回転
振盪培養した。
発酵用培地組成
グルコース 10%
(NH4)2304 2.5%KH2PO40
,04% Mg5O,・7 H200,04% Fe 304 ・7H201oppl MnCj 4−4H207111111CaCO34% 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した液中のL
−フェニルアラニン濃度をロイコノストック・メセンテ
ロイデスATCC8042を用いる微生物定量法で定量
したところ第2表に示すような結果を得た。
,04% Mg5O,・7 H200,04% Fe 304 ・7H201oppl MnCj 4−4H207111111CaCO34% 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した液中のL
−フェニルアラニン濃度をロイコノストック・メセンテ
ロイデスATCC8042を用いる微生物定量法で定量
したところ第2表に示すような結果を得た。
第 2 表
また、発酵終了後の液を強酸性陽イオン交換樹脂″ダ°
イヤイオン”5K−104(H+型)(三菱化成社製)
におとし、L−フェニルアラニンを吸着させ、該樹脂を
水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出した溶出液を濃縮
し、活性炭処理して脱色し冷却後、培養液11あたり0
.93「のし−フェニルアラニンの結晶を得た。
イヤイオン”5K−104(H+型)(三菱化成社製)
におとし、L−フェニルアラニンを吸着させ、該樹脂を
水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出した溶出液を濃縮
し、活性炭処理して脱色し冷却後、培養液11あたり0
.93「のし−フェニルアラニンの結晶を得た。
〈発明の効果〉
本発明の方法によれば、高価な前駆体を使用することな
く、かつL−フェニルアラニンを著量蓄積せしめること
ができるため、工業的に極めて有利である。
く、かつL−フェニルアラニンを著量蓄積せしめること
ができるため、工業的に極めて有利である。
Claims (2)
- (1)シトロバクター(Citrobacter)属に
属し、かつL−フェニルアラニン生産能を有する微生物
を、液体培地中で好気的に培養してL−フェニルアラニ
ンを培養液中に生成・蓄積せしめ、該培養液よりL−フ
ェニルアラニンを採取することを特徴とする発酵法によ
るL−フェニルアラニンの製造法。 - (2)微生物がフェニルアラニン代謝拮抗物質に耐性を
有する変異株である特許請求の範囲第1項記載の発酵法
によるL−フェニルアラニンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25048187A JPH0191790A (ja) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | 発酵法によるl−フェニルアラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25048187A JPH0191790A (ja) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | 発酵法によるl−フェニルアラニンの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0191790A true JPH0191790A (ja) | 1989-04-11 |
Family
ID=17208497
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25048187A Pending JPH0191790A (ja) | 1987-10-02 | 1987-10-02 | 発酵法によるl−フェニルアラニンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0191790A (ja) |
-
1987
- 1987-10-02 JP JP25048187A patent/JPH0191790A/ja active Pending
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