JPH01309691A - Ｄ−アラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、工業的に有利なり一アラニンの製造法に関す
る。

Ｄ−アラニンは、非天然型アミノ酸であるが、それ自体
試薬としであるいはベグチドなどの合成原料として有用
な化合物であり近年その需要も増加している。

〈従来の技術〉 従来より、ブレビバクテリウム属に属する微生物により
発酵法によってＤＬ−アラニンを製造する方法は数多く
知られている〔アミノ酸発酵（下巻）第１１９頁、共立
出版（昭和４７年出版）〕。

また、ＤＬ−アラニンを原料とし、Ｌ−アラニンを酵母
に資化させることによるＤ−アラニンを調製する方法も
知られている（＾ｎ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ−Ｎｕｃｌｉｃ　
Ａｃ１ｄ、　１９６７　、第１５号、８９−９４）。

〈発明が解決しようとする課題〉 しかしながら、ＤＬ−アラニンを製造した場合には、Ｄ
−アラニンのみを取得するために何らかの光学分割操作
が不可避であり、また微生物を用いてＤＬ−アラニンか
らし一アラニンのみを資化させてＤ−アラニンを得る方
法では、原料の約半分しか有効利用できないことになる
。

そこで本発明者らは、微生物を用いてＬ−アラニンを選
択的にＤ−アラニンに変換させることにより、さらに安
価で簡便なり一アラニンの製造法を提供することを課題
として鋭意研究した。

く課題を解決するための手段〉 その結果、本発明者らは、ブレビバクテリウム属に属す
る微生物が驚くべきことにＬ−アラニンを効率よくＤ−
アラニンに変換することを見出し、本発明を完成しな、
ところでかかる方法によるＤ−アラニンの生産方法はい
かなる微生物を用いるものもいまだ知られておらず、ま
ったく新規な技術である。

すなわち本発明は、ブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−
アラニンをＤ−アラニンに変換する能力を有する微生物
を用いて、Ｌ−アラニンをＤ−アラニンに変換せしめ、
生成蓄積したＤ−アラニンを採取することを特徴とする
Ｄ−アラニンの製造法に関するものである。なお、Ｌ−
アラニンは純度１００％のものを用いる必要はなく任意
の割合でＤ木を含むものも使用できる。

次に、本発明の詳細な説明する。

本発明で用いられる微生物は、ブレビバクテリウム属に
属し、Ｌ−アラニンをＤ−アラニンに変換する能力を有
する微生物であり、かかる性質を有していれば、他の要
求性、薬剤抵抗性の性質をもつものでも本発明の範囲に
含まれる。

本発明で用いられる株の代表的なものとしては、たとえ
ば、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＤＣ３
Ｒ１７−２（微工研菌寄第９９３０号）が挙げられる。

この株は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＴＣＣ１３８６９（ビオチン要求性）より誘導された
もので、Ｄ−シクロセリンに対して耐性を有する変異株
であり、適当な条件下でＤ−アラニンを発酵生産するこ
とができる。

変異株の誘導は、通常の変異処理法によって比較的容易
にできる。すなわち、Ｄ−シクロセリンに耐性を有する
変異株を得るには、親株を紫外線照射するかあるいは変
異誘発剤（たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ゛−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸など）で
処理したのち、親株が十分に生育できないような量のＤ
−シクロセリンを含む培地で親株に比べて有意に生育可
能な菌株を取得すればよい。

本発明方法で使用する菌を培養する培地としては、通常
微生物の培養に汎用される各種栄養源を使用できる。た
とえば炭素源としてはグルコース、糖蜜、デンプン加水
分解液などの糖類、酢酸などの有機酸、エタノールなど
のアルコール類、安息香酸などの有機化合物、窒素源と
しては、硫安、硝安、塩安、リン安、尿素、アンモニア
、その他を利用でき、無機アンモニウム塩の種類によっ
てはたとえばリン酸塩、炭酸カルシウムなどの無機塩を
必要とする場合もある。

また、上記培地には微生物の生育をよくするためにたと
えば有機窒素源、ビタミン、微量の金属イオンなどを添
加するのが好ましいが通常安価な味液、コーンスチープ
リカーなどの添加によって十分それらの目的を達成する
ことができる。

本発明において、上記微生物の培養は、培地を振盪もし
くは通気撹拌するごとき好気的条件下に実施するのが好
ましい、培養温度は通常２０〜４０℃、とりわけ３０℃
付近にあることが好ましい。また、培地のｐ　Ｈは通常
５〜っであり、好ましくは、中性付近に維持することが
望ましい。

かくして数日間培養したのち、その培養液に直接もしく
は分離菌体を含む反応液にＬ−アラニンもしくはＬ−ア
ラニンを任意の割合で含むり、Ｌ−アラニンを添加し、
さらに数日間培養すれば培地中にＤ−アラニンが生成蓄
積する。

また、培養培地にあらかじめし一アラニンを添加して滅
菌し、微生物を接種して数日間培養しても培地中にＤ−
アラニンが生成蓄積する。

なお、Ｌ−アラニンを任意の割合で含むり、Ｌ−アラニ
ンを用いても同様な結果が得られる。

培養終了後、生成したＤ−アラニンは、たとえばイオン
交換法、吸着法、沈澱法などの公知の単離精製操作を組
合せて用いることにより容易に採取することができる。

〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１（菌株の収得） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９（ビオチン要求性）の菌体に常法によりＮ−メ
チル−Ｎ−一ニドローＮ−ニトロソグアニジン処理（３
００μｇ　／　ｍｌ、３０℃で１０分）したのち、この
細胞をＤ−シクロセリン５０■／ｊ！を添加した寒天培
地（グルコース２％、硫安１％、リン酸第１カリウム０
゜１％、ＶＡ酸マグネシウム・７水和物０．０４％、塩
化ナトリウム０．０５％、尿素０．２５％、硫酸第１鉄
・７水和物１０■／）、硫酸マンガン・４水和物１０■
／ｌビオチン５０μｇ　／　Ｉｔを含む完全合成培地）
に塗布した。次に３０°Ｃで５〜７日培養し、生じた大
きなコロニーを釣菌分離して、Ｄ−シクロセリン耐性株
（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＤＣ３Ｒ
−２６）を取得した。

得られたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＤ
ＣＳＲ−２６をさらに同様の処理を施し、同様の培地で
・培養しＤ−シクロセリン高耐性株（ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムＤＣ３Ｒ／７−２）を取得し
た。

実施例２（分離菌体法） グルコース１０％、硫安３％、リン酸第１カリウム０．
０５％、リン酸第２カリウム０．０５％、硫酸マグネシ
ウム・７水和物０．０２５％、味液２％、炭酸カルシウ
ム３％、ビオチン３０μｇ／ｉを含む培地（ｐＨ７，２
５＞　４０ｍｌを１２エルレンマイヤーフラスコに分注
し、１２０℃、１０分間オートクレーブ滅菌した培養培
地に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＤＣ
３ＲＩ　７−２を１白金耳接種し、３０゛Ｃで５０間培
養した。培養液より菌体を遠心分離し、グルコース４％
、リン酸第１カリウム０．０５％、リン酸第２カリウム
０．０５％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％
、昧酸２％、炭酸カルシウム３％、ビオチン３０μｇ　
／　ｊ２、Ｌ−アラニン４％を含む無アンモニア源反応
液（ｐ　Ｈ７゜２５）４０［１１１に懸濁し、３０℃で
４５時間反応した結果、反応液中に３８．６　ｇ　／　
ｊ！のＤ−アラニンが蓄積した。一方、し−アラニンを
添加しない反応液を同様に反応させた結果、アラニンの
蓄積は０．５ｔ／Ｒ以下であった。

ＤｆｌｋおよびＬ体のアラニンの分析は市販のＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼを用いる酵素法によりおよび住友化学
０Ａ−１０００光学分割用カラムを用いて高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。

実施例３（分離菌体法） 実施例２と同様の方法で培養後分離したブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムＤＣ３Ｒ１７−２の菌体を
グルコース４％、リン酸第１カリヴム０．０５％、リン
酸第２カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム・７水和
物０．０２５％、味液２％、炭酸カルシウム３％、ビオ
チン３０μｇ／ｌ、Ｄ、Ｌ−アラニン４％を含む無アン
モニア源反応液（ｐＨ７，２５）４０ｍｌに懸濁し、３
０℃で４５時間反応した結果、反応液中に３９、７　ｇ
　／　１のＤ−アラニンが蓄積した。

一方、Ｄ、Ｌ−アラニンを添加しない反応液を同様に反
応させた結果、アラニンの蓄積は０゜５ｔ／Ｒ以下であ
った。

Ｄ体およびＬ体のアラニン分析は実施例２と同様に行っ
た。

実施例４ 実施例２と同様の培養培地にブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムＤＣ３Ｒ１７−２を接種し、３０℃で
３日間培養しＤＬ−アラニン２０　ｔ　／　ｊ！を添加
した。さらに６４時間培養した結果、第１図のごとく培
地中に４８．８　ｇ　／℃のＤ−アラニンが生成蓄積し
た。

この培養液２００ｍ１から菌体を遠心分離して除去し得
られる上澄液を脱色炭処理した。この脱色炭処理液を強
力チオン交換樹脂ダイヤイオン５Ｋ−ＩＢ（Ｈ“型）を
充填したカラムに通塔してＤ−アラニンを吸着させ、水
洗後２Ｎアンモニア水で溶出し、Ｄ−アラニンの分画を
濃縮し、得られた濃縮液にエタノールを加え析出する結
晶を口取した。この結晶をエタノールにより再結晶する
ことによりＤ−アラニンの結晶７．２ｇを得た。

光学純度　９９．４％ 比旋光度〔α〕甘せ−１４，２°（Ｃ＝６．ｌＮ−１１
ｃＩ）０体およびＬ体のアラニン分析は実施例２と同様
に行った。

一方、Ｄ、Ｌ−アラニンを添加せずにそのまま培養した
場合、第１図のこと＜３０．９ｇ／Ｊ！のＤ−アラニン
しか生成蓄積せず、Ｄ、Ｌ−アラニン２０　ｇ　／　１
よりＤ−アラニン１７．９ｇ／ｌが生成蓄積できたこと
になる。

〈発明の効果〉 本発明によれば、微生物を用いてし一アラニンをＤ−ア
ラニンに変換することが可能になった。そのためＤＬ−
アラニンの光学分割あるいはＬ−アラニンの資化が不要
となり、安価かつ簡便にＤ−アラニンを取得することが
できるようになり、その工業的価値は大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例４において培養時間と培地中のＤ−アラ
ニン蓄重量との関係を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
   属に属し、Ｌ−アラニンをＤ−アラニンに変換する能力
   を有する微生物を用いて、Ｌ−アラニンをＤ−アラニン
   に変換せしめ、生成蓄積したＤ−アラニンを採取するこ
   とを特徴とするＤ−アラニンの製造法。