JPH01257486A - 発酵法によるｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業−１−の利用分野 本発明は発酵法によるＬ−アルギニンの製造法に関する
。Ｌ−アルギニンは医薬品、食品等として有用なアミノ
酸である。

従来の技術 従来、Ｌ−アルギニンは発酵法または蛋白質からの抽出
法により製造されている。発酵法で生産する方法とし°
Ｃは、アルギーンアナログに耐性の菌株を使用する方法
〔′ｒグリ力ルチュラル・アンド・バイオ嘗１シカＪし
・ケミストリイ　（八にｒｉｃｕｌＬｕｒａｌ＆旧ｏ１
ｏ１＜１ｃａｌ　（二ｈｅｓｉｓＬｒｙ）　３（ｉ　、
　１Ｇ７５（１９７２）　、ジャーナル・オブ・ジェネ
ラル・アンドパｒブライドΦミク０バイオτ１シイ（Ｊ
ｎｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　＆＾ｐｐｌｉｅ
＋ｉ　ＭｉｃｒｏｂｉｌｏＨＹ）　１９　、　：１３９
（１９７コ）および特公昭４Ｂ−３３９１号公報〕、：
１リネパクテリウ１１屈に属し、ピリミジン゛ｒすｒ１
グ耐性を有する微生物を用いる方法（特発ＩＩｔｔ５７
−！’１０４７９号公報）、■、−アルギニン生合成系
に関与する遺伝子とベクターＯＮ＾との組み換え体１）
Ｎ八を保有させた菌株を用いる方法（特開昭（ｉｏ−６
（ｉ９ｇ９号公報）などが知られている。

又、ブレビバクテリウム屈の５−２−アミノエチルシス
テイン耐性株による！、−リジンの製法が知られている
〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・アンド・アプライド
・ミクロバイオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌｏｒ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌ　＆＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ）
　　１６　、３７３（１９７Ｇ）］。

発明が解決しようとする課題 １．−・アルギニンを、より収率よく安価に製造する方
法が求められている。

本発明は＝１リネ型グルタミン酸生産菌であって、シス
テインまたはシステインアナログに耐性を有し、かつＬ
−アルギニン生産能を有する微生物を培地にＪｌｌｉ養
し、培養物中に１４−アルギニンを生成ＮＩＲＩさせ、
該ｊ８養物より７．−’ｆルギー、ンを採取°４゜るこ
とを特徴とする発酵法による【、−アルギニンの製造法
に関する。

本発明に使用°４”る微生物としては、コリネ型グルタ
ミン酸生産菌であって、システインまたはシスティンア
ナログに耐性を有し、かつＬ−アルギニン生産能を有す
るものであればいずれも用いられる。

コリネ型グルタミン酸生産菌としては、コリネバクテリ
ウム屑（種として、コリネバクテリウム・グルタミクム
、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネ
バクテリウム・リリウム等）、プレピバクデリウ！、証
１（種として、プレビパクデリウ！・°・フラバ！・、
ブレビバクゾリウム・ラクトフアーメンタノ・、ブレビ
バクテリウム・デイバリカラム等）等に属する菌株があ
げられる。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミ
クム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｓ　　ｇｌｕｔａ
ｓｉｃｕｍ　）　ｔｌ　−７０９０（Ｆ［！）ＩＭ　Ｄ
Ｉ’−１８２３）　（以下、１１−７０９６と称す）、
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃＬａｒｉｕｓ　　ａｃｅＬｏａｃｉｄｏｐｂ
ｉｌｕ＋５）ＩＩ　−？　０９２　（ＦＢＲｌｉ　０Ｐ
−１８２０）　（以下、１１−７０９２と称す）、Ｈ−
７０９３（同ＲＭ’［ＩＰ−１８２１）　（以下、１１
−７１１９３と称す）　、Ｈ−？　ｌ　ｌ　７　（Ｐ［
！Ｒ１ｌ　０１１−１８２２）　（以下、ｌｌ−７１１
７と称す）等があげられる。これらの菌株は昭和６３年
３月２８０付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）にそれぞれ国際寄託されている。

本発明でいうシスティンアナログとは最小培地寒天平板
上に該アナログを添加し、コリネ型グルタミン酸生産菌
を培養した時に、該生産菌の生育を阻害するが、この阻
害がシスティンが存在することにより解除されるような
ものをいう。例えば、Ｓ−エチルシスティン、Ｓ−メチ
ルシスティン、５−２−アミノエチルシステイン、ホモ
システイン、システイン酸、ホモシステイン酸、γリル
グリシン等が挙げられる。

以下に前記具体的な菌株の採取方法を説明する。

（１）ＩＩ−７０９６の取得方法 コリネバクテリウム・・グルタミクムにマー１０６７１
（Ｆｌ！ＭＭ　ｌ”−３６１（ｉ）　（以下、にマ１１
１ｒｉ７１と称ず）（１）−３ｅｒζ１）４Ｐｇ”　、
　Ａｒｇｌｌｘ”　、（ｉＡＵ　”）をＮ−／　チＪレ
−Ｎ’−二）ｔ＋−Ｎ−二）ｎ７グ°ｒ−′、ジ：／　
２５１１ａｇ／ｄで３０℃、３０分処理した後、該処理
株を親株が生育阻害を示す濃度（１０ｍｇ／ａｄ）のＳ
−エチルシスティンを含む最小ＪΔ地寒天平板上（グル
コースｌｏｇ／ｊ、塩化°ｒンｓｔ：ニウＬｋｇ／ｌ、
尿嵩２　ｇ／ｌ、　に１ｌＩＰ０４　１　ｇ　／　１、
　に、１１Ｐ口＊３ｇ／ｌ　、１１ｇｃｊ＊’２１１ａ
０　　０．４ｇ／ｌ、ｌ’ｅｓＯ＊”７１１ｉ０　　１
０ｍｇ／　１、賛ｎｓＯ＊”４１１ｓＯｔｏ　　ｗｇ／
ｄｉ、　　ＺｎＳＯ４”７１１ｓＯ１ｍｇ／　１　　。

ＣｕＳＯｓ”５Ｈ＊Ｏｔｓｇ／ｊ、（Ｎ１１Ｊａｉｌｏ
ｔＯｓ、’４１１＊０１１１ｇ／　１、ビオチン５０尾
／１、寒天２０■／１、ｐＨ？、２　）に塗布し、３０
℃で７〜１０日間培養して生育する変異株を取得した。

このようにして取（）シた変異株の内、Ｌ−’ｒアルギ
ニン生産能殴れた株としてＩＩ　−７０９ｆｉ　（１）
−３ｅｒ’、　ｌ）−八１８″、＾ｒｇｌｌｘ”、６＾
ｕ１、Ｓ［ＩＣ”）を取得した。

Ｄ−３ｅｒ’　：　Ｄ−セリン感受性、ト＾ｒＨ”　：
　ｆ）−アルギニン耐Ｌ　　Ａｒｇｌｌｘ”　：　’］
’ルギニンハイドロキサメート耐性、６＾ｕ”：６−ア
ずウラシル耐性、ｓｔ＋ｃ”　：　ｓ−エチルシスティ
ン耐性（２）ＩＩ−７０り　２．Ｉｌ−？　０９　；ｌ
及びｌｌ−７１１７の取得方法 前記（−）項の取得方法において、親株としてＰＩ！Ｒ
１１Ｐ−３６１６の代わりにコリネバクテリウム、・ア
セトアシドフィラム夏（−４３１３（Ａｒｇｌｌｘ”。

２ＴＡ”、６ＡＵ−（ＭＰＡ＋Ｃ［ｌＺ　Ａｒｇ）”］
　　（以下、ｌｌ−４３１３と称す）を用い、かつＳ−
エチルシステインの代わりにＳ−メチルシスティン、５
−２−丁ミノエチルシステインまたはシスティンを用い
る以外は（１）項と同様に行い、 ｌｌ−７０９２（（＾ｒｇｌｂ＠、２ＴＡ＠、６＾Ｕ−
（ＭＦ＾＋ＣｎＺ　Ａｒｇ）”、５ｌｌＣ，＠〕、１１
−７０９３［（＾ｒｇｌｌｘ”、　２ＴＡ″、　６＾Ｕ
″、　（Ｍ１５八ｉｔ’：１１７＾「に）１、ＡｌＩＣ
町または１１−７　１　１　７　　［（＾ｒｇｌｌｘ″
、　２ＴＡ”、　　ＧへＩ＋”、　（Ｍｌｉ＾ｊｃｌＩ
Ｚ＾「８）１、ＣＹＳ町を１１だ。

２ＴＡ”　：　２−−チアゾールアラ！−ン耐性、（Ｉ
ＪＦＡ）ＣＩＩＺ＾「ル）１：モノフル」１１酢酸存在
下でのＮ−カルボベンゾキシｒルギニン耐性、ＳＭＩ：
”　：　Ｓ−メチルシステイン耐性、＾ｌｉｅ”：Ｓ−
２−γミノエチルシスティン耐性、１：Ｙｓ”：システ
イン耐性 づぎに前記親株及び皮異様をシステイン又はシステイン
“ｆデｔ１グを含む最小培地寒天甲板」−で３０℃、２
４時間培養したときの生育度を第１表に示す。

本発明の方法において用いられる菌の培養に際しては、
一般にアミノ酸の発酵生産に用いられる７５地が使用さ
れる。

ずなわら菌が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を
含有する合成培地または天然培地が適宜用いられる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュク【
１−ス、糖蜜、澱粉、澱粉加水分解物等の糖類、酢酸、
フマール酸、クエン酸等の有機酸、エタノール、メタノ
ール、グリセ１１−ル等のアルコール類等が用いられる
。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸°ｒアンモニウ
ムの無機塩類、フマール酸アンモニウノ・等の有機酸の
アンモニウム・塩、エチルアミン等のアミン類、原書等
の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンｅスディープ・リカー、カゼイン加水分解物、大豆
粕又はその加水分解物、アミノ酸発酵、核酸発酵等の発
酵菌体およびその消化物等が用いられる。

無機塩類としては、燐／ｉ１２第一カリウト、燐酸第二
カリウノ・、燐酸マグネシウム、硫酸マグネシラ！・、
塩化す）　ＩＪウド、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、酸ｌ
１ｉ１２′ＩＡ１炭酸カルシウム等が用いられる。

その他必要により培地にビオチン、チアミン、ニコチン
酸、β−γラニン等のビタミン類、グ・ルタミン酸等の
アミノＰＩＩ類を添加することがある。

培養は振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条
件下２０〜４０℃、好ましくは２５〜３８℃の温度で行
われる。培地のｐｌ＋は５〜９好ましくは中性付近に保
持する。培地の１１１１調整は炭酸力ルシウ！・、無機
または有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐ１１緩
衝液等によって行う。

培養期間は通常１〜７日間で、培養物中にＬ−アルギニ
ンが生成蓄積する。

培養終了後、培養液から菌体などの沈澱物を除去し、イ
オン交換処理法、濃縮法、塩析法、等電点沈澱法等を併
用することにより、培養液から１、−アルギニンを回収
°４゛ることかできる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例！ ｌｌ−７０９６及びＫＹ−１０（ｉｌｌをそれぞれグル
コース２０ｇ／Ｊ！、ペプトンｌＯｇ／ｌ、酵母エキＸ
１１１ｇ／Ｊ！及びＮａＣ１５ｇ／ｌの組成よりなる種
陪地（ｐＨ７，２）　ｌｉ　ｍｆｆ−（’：１１）℃、
２４時間培養シタ。１町）られた種ｊΔ養液２ｍｌを後
記生産培地２０−を含む３０〇−容三角フラスコ１に植
菌した後、３０℃で７２時間振ｒＲＪΔ養した。

その結果、１１−７０　り　（ｉ及びＫＹ−１（１（ｉ
７１の培養液中のし一アルギニン生成量はそれぞれ２４
．５ｍｇ／−及び２２．０ｍｇ／　ｍｅ　テ／）　−）
　だ。

生産培地の組成 廃糖蜜１５０ｇ／ｊ！　（グルコース換算）、硫安３０
ｇ／ｌ、尿ｍ３ｇ／ｌ、に１Ｉａｌ’Ｏｎ　０．５ｇ　
／　１　、に！＋１１１０゜０．５　　ｇ／ｌ、　　Ｍ
ｇ５Ｏｎ　・２Ｈ＊ロ　　０．２５ｇ　／　１　、　　
ＣａＣＯａ３０ｇ／ｌ　　（ρ１１７．２） Ｈ−７０９６の培養終了液から遠心分離によりえた」；
清液１１を強酸性陽イオン交換樹脂〔ダウエックス５０
　ｘ　８　（Ｎ　ａ　型）　、ダウケミカル社製〕のカ
ラ！・に通し、アンモニア水で１６−アルギニンを溶出
分離した後、精製、濃縮及び品出°４°ることにより、
１９、（ｉｇの！、−’ｒアルギニン結晶を１−）た。

実施例２ １１−４３１：ｌ　　、　　厘１−７（１り２　　、　
　ｌｌ−７（１９３及びｌｌ−７１１７をソレソレグ７
１／：Ｊ−ｘ５０ｇ／ｌ、ペプトンｌｕｇ／ｌ、酵母エ
キスＩＯｇ／Ｊ、硫安５−　ｇ／ｌ、　Ｋ１１ｌ＋’０
４　５ｇ　／　１　、　Ｍｇ５Ｏ１・　２１１ａＯ（１
’、５ｇ　７１　、　　　　　　。

ビオチン５ｈｇ／ｍｌ及びＮａＣｊ　５ｇ　／　１　（
７）、Ｉｌ成Ｊ、　リなる種培地（ｐＨ？、２）　　６
ａｄで３０℃、２４時間培養した。

１！）られた各種培養液２１を後記生産培地２０ｍ１を
含む３００１容三角フラスコに植菌した後、：ＩＩＩｔ
で７２時間振盪培養した。

生産１Δ地の組成 廃糖蜜８０ｇ／ｊ（グルコース換算）、に１１２ｅ口。

０．５ｇ／ｌ、に１１１１”０４０．５ｇ　／　１、硫
安４５ｇ／ｌ、尿素２ｇ　／１　、　ＣａＣ０ａ　３０
ｇ　／　１　（ｐＨ７、２）培養液中のし一アルギニン
生成量を第２表に示す。

第　　　２　　　表 １１−７０９２　　２４．１） ｔｌ−７０！３３　　２３．５ ＩＩ−７１１？　　　２３．２ ■菖　−４：１１：ｌ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２１．０本発明方法により【、−アルギニンを収
率よ＜１！シることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネ型グルタミン酸生産菌であって、システインまた
   はシステインアナログに耐性を有し、かつＬ−アルギニ
   ン生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ
   −アルギニンを生成蓄積させ、該培養物よりＬ−アルギ
   ニンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−アル
   ギニンの製造法。