JPH02171194A

JPH02171194A - 発酵法によるｄ‐アラニンの製造法

Info

Publication number: JPH02171194A
Application number: JP32449588A
Authority: JP
Inventors: Masae Takeuchi; 武内　正江; Toru Yonehara; 徹米原
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1988-12-21
Filing date: 1988-12-21
Publication date: 1990-07-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は、工業的に有利なり一アラニンの製造法に関す
る。

Ｄ−アラニンは、非天然型アミノ酸であるが、それ自体
試薬としであるいはペプチドなどの合成原料として有用
な化合物であり近年その需要も増加している。

〈従来の技術〉従来より、コリネバクテリウム属に属する微生物により
発酵法によってＤＬ−アラニンを製造する方法は数多く
知られている〔アミノ酸発酵（下巻）第１１９頁、共立
出版（昭和４７年出版）〕。また、コリネバクテリウム
・ファシアンスを用いた発酵法によるＤ−アラニン製造
法も知られている（特公昭５１−２１０７６号公報）。

〈発明が解決しようとする課題〉しかしながら、上記コリネバクテリウム・ファシアンス
は、現在ロドコッカス・ロドクロスに分類されており、
いわゆるアミノ酸生産菌として工業的に漬れたコリネバ
クテリウム属に属する微生物を用いたＤ−アラニン選択
発酵はまだ完成されておらず、Ｄ−アラニンのみを収得
するには副生じたし一アラニンを除くために何らかの光
学分割操作が不可避であった。

そこで本発明者らは、発酵法により選択的にＤ−アラニ
ンのみを生成蓄積させることにより光学分割操作を必要
とせず、さらに安価で簡便なり一アラニンの製造法を提
供することを目的として鋭意研究した。

く問題点を解決するための手段および作用〉その結果本
発明者らは、コリネバクテリウム属に属する微生物であ
って、特別な耐性を有する微生物がＤ−アラニンを選択
的に生成蓄積することを見出し本発明を完成した。

すなわち本発明は、Ｄ−アラニン生産能を有し、かつＤ
−シクロセリンに対して耐性を有するコリネバクテリウ
ム属に属する微生物を培養して培養液中にＤ−アラニン
を生成蓄積せしめ、前記培養液中よりＤ−アラニンを採
取することを特徴とする発酵法によるＤ−アラニンの製
造法である。

次に、本発明の詳細な説明する。

本発明で用いられる微生物はＤ−アラニン生産能を有し
、かつＤ−シクロセリンに対して耐性を有するコリネバ
クテリウム属に属する微生物である。かかる性質を有し
ていれば、他の要求性、薬剤抵抗性の性質を持つもので
も本発明の範囲に含まれる。

本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては、た
とえば、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＣ８Ｒ−
１３（微工研菌寄第１０グ肘号）コリネバクテリウム・
アセトアシドフイラムＤｃＳＲｔ−５（微工研条寄第ａ
ｏ　＋ｂ号）が挙げられる。前者は、コリネバクテリウ
ム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２より誘導された菌
株であり、後者はコリネバクテリウム・アセトアシドフ
ィラムＡＴＣＣ１３８７０より誘導された菌株でともに
Ｄ−シクロセリンに対して耐性を有する変異株である。

変異株の誘導は、通常の変異処理法によって比教的容易
にできる。すなわち、Ｄ−シクロセリンに耐性を有する
変異株を得るには、親株を紫外線照射するかあるいは変
異誘発剤（たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ゛−ニトロ−Ｎ−
ニトロングアニジン、エチルメタンスルホン酸など）で
処理したのち、親株が十分に生育できないような量のＤ
−シクロセリンを含む培地で親株に比べて有意に生育可
能な菌株を取得すればよい。

本発明におけるＤ−シクロセリン耐性株とは、その親株
より強い耐性を有する菌株のことであり、好ましくは親
株の６４時間後の相対生育度が６０％以下になるような
り一シクロセリン濃度を含む培地で培養した場合の相対
生育度が７０％以上を示すようなものをいう、ここで生
育度は、培養液の６６０　ｎｍにおける吸光度を測定し
、各菌株のＤ−シクロセリンを添加していない培養液の
吸光度を１００％として表わした場合の相対吸光度で示
すものとする。

本発明方法で使用する培養液培地としては、通常微生物
の培養に汎用される各種栄養源を使用できる。たとえば
炭素源としてはグルコース、糖蜜、デンプン加水分解液
などの糖類、酢酸などの有りｌ酸、エタノールなどのア
ルコール類、安息香酸などの有機化合物、窒素源として
は、硫安、硝安、塩安、リン安、尿素、アンモニア、そ
の他を利用でき、無機アンモニウム塩の種類によっては
たとえばリン酸塩、炭酸カルシウムなどの無機塩を必要
とする場合もある。また、上記培地には微生物の生育を
よくし、Ｄ−アラニンを著量蓄積させるためにたとえば
有機窒素源、ビタミン、微量の金属イオンなどを添加す
るのが好ましいが通常安価な味液、コーンスチープリカ
ーなどの添加によって十分それらの目的を達成すること
ができる。

本発明において、上記微生物の培養は、培地を振盪もし
くは通気撹拌するごとき好気的条件下に実施するのが好
ましい、培養温度は通常２０〜４０℃、とりわけ３０℃
付近にあることが好ましい。また、培地のＰＨは通常５
〜９であり、好ましくは、中性付近に維持することが高
収率を得るために望ましい、かくして数日間培養すれば
培地中にｉｔのＤ−アラニンが生成蓄積する。培養終了
後、生成したＤ−アラニンは、たとえばイオン交換法、
吸着法、沈澱法などの公知の単ＭＷＩ製操作を組合せて
用いることにより容易に採取することができる。

〈実施例〉以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例ＩＡ、（Ｄ−シクロセリン耐性株コリネバクテリウム・グ
ルタミカムＤＣ８Ｒ−１３の分離）コリネバクゾリウム
・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（ビオチン要求性）
の菌体に常法によりＮ−メチル−Ｎ−一二トローＮ−二
トロングアニジン処理＜３００μｇ／山ｉ、３０℃で１
０分）したのち、この細胞をＤ−シクロセリン５０■／
ｉを添加した寒天培地（グルコース２％、硫安１％、リ
ン酸第１カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水和
物０．０４％、塩化ナトリウム０．０５％、尿素０゜２
５％、硫酸第１鉄・７水和物１０＃／１、硫酸マンガン
・４水和物１０ｍｔ／ｉ、ビオチン５０μｇ　／　１を
含む完全合成培地）に塗布した０次に３０℃で５〜７日
培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離して、Ｄ−シ
クロセリン耐性株（コリネバクテリウム・グルタミカム
ＤＣ３Ｒ−１３）を収得した。

コリネバクテリウム・アセトアシドフイラムＤＣ３ＲＩ
−５も同様な方法で、コリネバクテリウム・アセトアシ
ドフィラムＡＴＣＣ１３８７０から分離した。

Ｂ−１（Ｄ−シクロセリン耐性株コリネバクテリウム・
グルタミカムＤＣ３Ｒ−１３の耐性度）第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３０℃
で１６時間振盪培養し、生育した菌体を集菌し生理食塩
水でよく洗浄した。

この菌体懸濁液をＤ−シクロセリンを各々０．１０．５
０■／ｉの濃度で含む敢少培地（培地組成ニゲルコース
２％、硫安１％、リン酸第１カリウム０．１％、硫酸マ
グネシウム・７水和物０．０４　％、塩化ナトリウム０
．０５％、尿素０．２５％、硫酸第１鉄・７水和物１Ｏ
Ｎ／ｌ硫酸マンガン・４水和物１０＃／１、ビオチン５
０μｇ　／　１を含む完全合成培地）５ｍｌに植菌して
３０℃で６４時間培養し、各菌株の生育度を調べた。そ
の結果は第１表に示すとおりである。

本発明方法で使用するＤ−シクロセリン耐性株（ＤＣ３
Ｒ−１３）では、親株のコリネバクテリウム・グルタミ
カムＡＴＣＣ１３０３２と比較して、Ｄ−シクロセリン
によって生成が阻害されず、Ｄ−シクロセリンに対する
耐性を獲得していることが明らかである。

第　　　１　　　表育成は各菌株のＤ−シクロセリンを添加していない培養
液の吸光度を１００％として換算した。

Ｂ−２（Ｄ−シクロセリン耐性株コリネバクテリウム・
アセトアシドフィラムＤＣ３Ｒ−１５の耐性度）Ｂ−１と同様の方法でコリネバクテリウム・アセトアシ
ドフィラムＡＴＣＣ１３８７０とＤＣＳＲＩ−５につい
て、Ｄ−シクロセリン添加培地での生育度を調べたとこ
ろ、第２表に示すとおりになった。これにより本発明方
法で使用するＤ−シクロセリン耐性株（ＤＣＳＲＩ−５
）では親株と比較してＤ−シクロセリンによって生育が
阻害されず、Ｄ−シクロセリンに対する耐性を獲得して
いることが明らかである。

（注）培養液の６６０　ｎｉにおける吸光度（富士デジ
タル濁度計）を（）内に記した。相対生第表（注）培養液の６６０ｎ１６における吸光度（富士デジ
タル濁度計）を（）内に記した。相対生育度は各菌株の
Ｄ−シクロセリンを添加していない培ＩＩ液の吸光度を
１００％として換算した。

実施例２グルコース１０％、硫安２６０％、リン酸第１カリウム
０．０５％、リン酸第２カリウム０．０５％、硫酸マグ
ネシウム・７水和物０．０２５％、ビオチン６０μｇ　
／　Ｊ　、塩化ナトリウム１．０％、［ｆｉ第１鉄・７
水和物１０　＃／　１　、Ｈ酸マンガン■・４水和物２
０■／ｌ大豆粕２％、炭酸カルシウム３％を含む培地（
ｐＨ６，５＞４０ｍ１を１１エルレンマイヤーフラスコ
に分注し、１２０°Ｃ１１０分間オートクレーブ滅菌し
て発酵培地とした。あらかじめコリネバクテリウム・グ
ルタミカムＤＣ３Ｒ−１３およびその親株であるコリネ
バクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をそれ
ぞれ液体ブイヨン培地に植菌し、３０℃で１６時間振盪
培養せる前項！？液を前記発酵培地に対し１％接種した
。３０℃で５日間振盪した結果、下記第３表あごとく培
養液中にＤ−アラニンが生成した。発酵液中の総アラニ
ン量はアミノ酸分析計により、またＤ−アラニンの分析
は市販のＤ−アミノ酸オキシダーゼを用いる酵素法によ
り、および住友化学０Ａ−１０００光学分割用カラムを
用いて高′Ｓ液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測
定した。

第　　　３　　　表 ※※アラニンの出来高が少量のため正確な分析不可。

コリネバクテリウム・グルタミカムＤＣ３Ｒ−１３の培
養液１ぶから、国体を遠心分離して除去し得られる上澄
液を脱色炭処理した。この脱色炭処理液を強力チオン交
換樹脂ダイヤイオン５Ｋ−ＩＢ（Ｈ＋型）を充填したカ
ラムに通塔してＤ−アラニンを吸着させ、水洗後２Ｎア
ンモニア水で溶出し、Ｄ−アラニンの分画を濃縮し、得
られた濃縮液にエタノールを加え析出する結晶を口取し
た。この結晶をエタノールにより再結晶することにより
Ｄ−アラニンの結晶１．８ｇを得た。

比旋光度〔α〕甘せ　−１４，２°（Ｃ＝６．　ＩＮ−
ＨＣＩ）実施例３実施例２と同様の方法でコリネバクテリウム・アセトア
シドフィラムＤＣ３ＲＩ−５およびその親株であるコリ
ネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３８
７０を発酵したところ、下記第４表のごとく培養液中に
Ｄ−アラニンが生成した。

第　　　４　　　表〈発明の効果〉本発明によれば、発酵法により選択的にＤ−アラニンの
みを生成蓄積させることが可能になった。そのため、培
養液の光学分割が不要となリ、安価かつ簡便にＤ−アラ
ニンを収得することができるようになりその工業的価値
は大きい。

Claims

【特許請求の範囲】

Ｄ−アラニン生産能を有し、かつＤ−シクロセリンに対
して耐性を有するコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物を培養して、培養
液中にＤ−アラニンを生成蓄積せしめ、前記培養液より
Ｄ−アラニンを採取することを特徴とする発酵法による
Ｄ−アラニンの製造法。