JPS5918994B2 - Ｄ−Ｎ−カルバミル（ｐ−ヒドロキシフエニル）グリシンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ｒ 本発明は５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダ
ントインを生化学的に加水分解することにより、Ｄ−Ｎ
−カルバミル（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンに変
換せしめる方法に関し、半合成ペニシリンならびに生合
成セファロスポリノ製造用の１ 中間原料を、極めて有
利に製造することを目的とする。

本発明は次の式で表わされる。

［ＤＬ、ＤまたはＬ体〕 即ち、本発明は式［１１で表わされる５−（ｐ−ヒドロ
キシフェニル）ヒダントイン環、シュードモナス属（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）に属しヒダントイン環を不斉
的に開裂加水分解する能力を有する微生物の培養液、菌
体または菌体処理物を作用せしめることによる式［ＩＩ
Ｉ］で表わされる、Ｄ−Ｎ−カルバミル（ｐ−ヒドロキ
シフェニル）グリシンの製造法である。

半合成ペニシリンおよび半合成セファロスポリンは近年
最もよく知られている抗生物質であるが、それらの重要
な中間原料としてＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン
が用いられている。

このＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンは化学合成に
よって得られるＤＬ体を光学分割しで製造されるが、公
知の光学分割法として化学的方法と生化学的方法がある
。

ＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンの化学的分割法
に関して（気ジアステレオアイソマー塩を形成させて分
離する方法が多数発表されている。

例えばＬ−エフェドリンやＤ−Ｎ−メチルエフェドリン
との塩を形成させる方法、ＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニ
ルグリシンのＮ・０−ジアセチ＃化物と、デヒドロアビ
エチルアミン、キニン、シンコニジン、またはα−フェ
ネチルアミンなどの光学活性物質との塩を形成させる方
法などがある。

これらの方法では、分割剤が高価であったり、誘導体の
形で行うために分割後脱アセチル化などの工程を必要と
するなどの欠点がある。

またｐ−ヒドロキシフェニルクリシン・ｐ−トルエンス
ルホン酸塩のラセミ体の溶解度が光学活性体塩の溶解度
より大きいことを利用した選択晶出法も見られるが、多
量の光学活性体塩を予め添加する必要があり、また１回
の分別操作で得られる収量が少いなどの欠点がある。

生化学的分割法としては、例えばＤＬ−Ｎ−アシル−（
ｐ−メトキシフェニル）グリシンをアミノアシラーゼに
よって不斉加水分解してＤ−Ｎ−アシル−（ｐ−メトキ
シフェニル）グリシンを分離し、それを加水分解してＤ
−ｐ−メトキシフェニルグリシンを得る方法などが知ら
れている。

このＤ−ｐ−メトキシフェニルグリシンは、加水分解ニ
ヨって、Ｄ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンに変換す
ることができる。

これらの生化学的光学分割法では、高価なアシラーゼ酵
素を必要とすること、誘導体として分割後、脱アシルま
たは脱メチル等を行わなければならないなどの欠点があ
る。

更にまた、以上に述べた化学的方法と生化学的方法に共
通する欠点は、光学分割して所望の光学活性体を分離し
たのちに、残った光学異性体の回収やラセミ化の工程が
必要なことであり、工業的に実施する場合に経済的不利
をまぬがれないものである。

本発明者等は微生物酵素系を利用する研究を鋭意行った
結果、従来の技術的および経済的な問題点を一挙に解決
する全く新規な方法を見出すに至った。

即ち、ＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンの合成中
間体として有用な５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダ
ントインに、シュードモナス属に属し、且つ特定能力を
有する微生物の酵素系を作用させて、ヒダントイン環を
不斉的に開裂加水分解することにより、Ｄ−Ｎ−カルバ
ミル（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンかえられるこ
とを見出した。

しかもｐＨを６〜１１、好ましくは７〜１０に保持しつ
つ上記反応を行わせると、ヒダントイン環のラセミ化反
応が促進される結果、驚くべき高収率で目的とする生成
物かえられることも見出された。

生成したＤ−Ｎ−カルバミル（ｐ−ヒドロキシフェニル
）グリシンは、過半す方法により、Ｄ−ｐ−ヒドロキシ
フェニルグリシンに変換しうるのである。

本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。

本明細書中でいう「ヒダントイン環を不斉的に開裂加水
分解する能力」とは、５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）
ヒダントインのヒダントイン環ヲ力ロ水分解して、実質
的にＮ−カルバミル（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシ
ンの９体のみを生成すせる能力である。

従来、本発明のように微生物の酵素系を利用して、ヒダ
ントイン環を不斉的に開裂加水分解し、９体のＮ−カル
バミル（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンを生成せし
める方法は全く知られておらず、従って本発明の方法は
極めて開拓的であり、しかも実用性に富むものである。

本発明の方法によって得られるＤ−Ｎ−カルバミル（ｐ
−ヒドロキシフェニル）グリシンは、そのま又でも抗生
物質の中間原料として使用できると思われるが、亜硝酸
等の試剤で処理することにより容易にＤ−ｐ−ヒドロキ
シフェニルグリシンに変換可能である。

それ故本発明は、Ｄ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン
の製造に対して、極めて有利な方法を提供するものであ
る。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明で原料として用いられる５−（ｐ−ヒドロキシフ
ェニル）ヒダントインは、Ｄ体、Ｌ体もしくはＤＬ体の
いずれであっても構わないが、通常は化学合成で得られ
るＤＬ体を使用するのが適当である。

これらのヒダントイン誘導体は、α−アミノ酸の一般的
な合成法として周知のヒダントイン法によって、ｐ−ヒ
ドロキシベンズアルデヒドを原料として容易に合成する
ことができる。

原料がＤ体の場合には、本発明で用いられる微生物酵素
系の作用から当然Ｄ−Ｎ−カルバミル（ｐ−ヒドロキシ
フェニル）グリシンを得ることができる。

また原料がＬ体の場合であってもラセミ化反応を伴うこ
とによって上記の目的物を生成させることができるので
ある。

本発明で使用される微生物は、シュードモナス属に属し
ヒダントイン環を不斉的に開裂加水分解する能力を有す
るもので、特に次に示す条件で検定を行って４０時間で
４モル％以上の変換率を与える微生物が採用される。

検定方法としては、先ず生菌体（乾物換算１０〜１００
ｍ９）を濃度０，５〜１．０％の基質水溶液あるいは懸
濁液１０ｒｒＬｌに加えて、ｐＨ６〜１１、濃度３０〜
３７℃に保って反応させ、生成したＮ−カルバミル−（
ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンの生成量を定量する
。

次いで変換率が４モル％以上と認められた菌株について
は、上記の実験規模を１０〜２０倍にして再度５−（ｐ
−ヒドロキシフェニル）ヒダントインの開裂加水分解を
行わせ、生成したＮ〜カルバミル誘導体を陰イオン交換
樹脂吸着法等の常法によって単離して、光学純度が９５
％以上でＤ体のＮ−力ルバミル誘導体であると認められ
た菌株を採用する。

上記の検定の結果、ヒダントイン環を不斉的に開裂加水
分解する能力が高く実用性の優れた菌株を具体的に例示
すれば、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐ ｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ） Ｉ Ｆ ０
３４４５、シュードモナス・クロロラフイス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ） Ｉ
Ｆ ０３９０４）シュードモナス・デスモリティ力（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ ） Ｉ
Ｆ ０ １２５７０、シュードモナス・ストリアタ（
Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ５ｔｒｉａｔａ ）ＩＦ０
１２９９６などがある。

本発明の方法は微生物の酵素系を利用するものであるが
、この酵素系は微生物を通常の方法で培養することによ
り調製することができる。

培養は通常液体栄養培地で行われるが、固体表面培養に
よっても行うことができる。

培地には通常資化し得る炭素源、窒素源、各微生物の生
育に必須の無機塩、栄養素を含有させるが、更に各種ア
ミノ酸のヒダントイン誘導体例えばＤＬ−メチオニンの
ヒダントイン、即ち、ＤＬ−５−（２−メチルチオエチ
ル）ヒダントインなどを少量添加して、必要な酵素系を
適応的に増強させることが望ましい。

培養液の温度は２０〜８５℃、ｐＨは４〜１１の範囲が
用いられ、通気攪拌により微生物の生育を促進すること
もできる。

５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントインの加水分
解反応においては、前記のようにして得た微生物の培養
液、菌体または菌体処理物を酵素系として使用する。

微生物の培養液をそのまＮ用いても強力な反応を起すこ
とができるか、更に望ましくは培養液から分離した菌体
な使用する。

菌体は生菌体のま又で用い得ることは勿論であるが、貯
蔵および取扱いの便宜から、凍結乾燥菌体のような乾燥
菌体として用いることもできる。

更に、菌体磨砕物または菌体抽出物のような菌体処理物
も、微生物酵素系として本反応に利用することができる
。

反応基質である５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダン
トインの反応液中での濃度は、０．５％から５０％程度
の高濃度まで用いることができる。

ヒダントイン誘導体の水に対する溶解度は一般に低いの
で、実用的な濃度では懸濁液の形になる場合が多いが、
反応の進行と共に、ヒダントイン誘導体は水性媒体中に
溶解して行くので、本反応にとって何ら支障にはならな
い。

加水分解反応は、通常水性媒体中で行われるが、そのｐ
Ｈは６〜１１の範囲が用いられる。

ｐＨが６以下および１１以上で（ζ好ましくない副反応
を生じるので実用的価値には乏しい。

実用上、更に好ましいｐＨの範囲は７〜１０であり、高
い収率で目的物を得ることができる。

その理由は、この条件ではヒダントイン環のラセミ化反
応が有効に促進される結果、ＤＬ体のヒダントイン誘導
体から９体のＮ−カルバミル誘導体への変換率が飛躍的
に増大するからである。

微生物の菌株を選択すれば、８０モル％以上の高り変換
率を得ることは容易である。

媒体の最適ｐＨは、使用菌株によって異っているが、概
ね７〜１０の範囲に含まれている。

加水分解反応の進行に伴って、水性媒体中ＫＤ−Ｎ−カ
ルバミル＜ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンの量が増
してくるので、ｐＨは反応開始時より次第に酸性側に移
行する。

従って反応中に適時中和剤を添加して、最適ｐＨに保持
することカ望ましい。

中和剤としては、アンモニア、苛性カリ、苛性ソーダ、
炭酸ソーダなどが過半である。

なお加水分解反応の水性媒体には目的に応じて有機溶媒
を混合して使用することも可能である。

加水分解の反応温度は、通常２０〜８５℃の範囲が用い
られるが、使用する菌株の酵素系に適した温度が採用さ
れる。

なお、反応基質に微生物酵素系を作用せしめる方法とし
て、通常は別に調整した微生物の培養液、菌体または菌
体処理物を水性媒体中で反応基質と混合する方法が用い
られるが、微生物の培養の途中で反応基質を液体培地に
添加して加水分解反応を行わせることも可能である。

この場合には、微生物の生育と応応基質の加水分解反応
が併行して進行することになる。

加水分解反応によって生成したＤ−Ｎ−カルバミル（ｐ
−ヒドロキシフェニル）グリシンヲ反応液から単離する
には、公知の方法を利用すればよい。

例えば、反応後に菌体等の不溶物を遠心分離等で除去し
たのち、反応液の水分を除き、次いで有機溶媒中でジシ
クロヘキシルアミンと塩を形成させることにより、白色
沈澱として分離することができる。

更にまた一般的な方法としては、菌体等を除いた反応液
を、塩基性陰イオン交換樹脂に通して目的物を吸着せし
め、これを希塩酸等で溶出し、溶出液を中和後減圧濃縮
してＤ−Ｎ−カルバミル（ｐ−ヒドロキシフェニル）グ
リシンの結晶を取得することができる。

次に参考として、本発明が、Ｄ−ｐ−ヒドロキシフェニ
ルグリシンの製造に関して、いかに効果的な方法を提供
するものであるかについて説明を加える。

先ず本発明の利点は、ＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグ
リシンの合成中間体であるＤＬ−５−（ｐ−ヒドロキシ
フェニル）ヒダントインを用いて光学分割できることで
ある。

従って、これまでにみられるような、ＤＬ−ｐ−ヒドロ
キシフェニルグリシンをアシル化物やエステル化物など
の誘導体に変換したのち分割する多くの方法に比べると
、製造工程がかなり短縮されることになる。

次に一回の反応によって、かなりの高収率で９体が得ら
れることも大きな長所で、選択晶出法のように操作を繰
返す必要はない。

また従来知られているすべての方法で避けることのでき
なかった５体のラセミ化工程は、本発明の方法を好まし
くはｐＨ７〜１０の水性媒体中で実施すれば全く不要と
なり、非常に効率的である。

更にまた従来の化学的分割法で用いられる光学活性の分
割剤や、生化学的分割法で用いられるアシラーゼ酵素の
ように、高価な副原料を要しないことも大きな利点であ
る。

本発明の方法で得られるＤ−Ｎ−カルバミル（ｐ−ヒド
ロキシフェニル）グリシンは、亜硝酸等の試剤を用いて
Ｎ−カルバミル基を加水分解し、Ｄ−ｐ−ヒドロキシフ
ェニルグリシンに変換することができる。

Ｎ−カルバミル基の加水分解反応に際しては、微生物反
応ののちに単離したＤ−Ｎ−カルバミル（ｐ−ヒドロキ
シフェニル）クリシンを用いてもよいし、あるいは微生
物反応後生放物を単離することなく、単に菌体等の不溶
物を除いた液に試剤を加えて反応を行わせることもでき
る。

以上の説明から、本発明がＤ−ｐ−ヒドロキシフェニル
グリシンの製造法に対して、極めて有利な方法を提供す
るものであることが理解されたであろう。

以下実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの例のみに限定されるものではない。

実施例 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、５００１ｒ
ｌｌの肩付振盪フラスコに１００ｍ１分注後、１ｚ０℃
で１０分間蒸気殺菌を行った。

培地組成 肉エキス ０．５ ％ 酵母エキス ０．５ ％ ポリペプトン １．０ ％ ＮａＣ１０，１５％ ｐＨ７，０％ これに別殺菌したＤＬ−５−（２−メチルチオエチル）
ヒダントインを無菌的に各３００ヤ加え、培養培地とし
た。

これと別に、ＤＬ−５−（２−メチルチオエテル）ヒダ
ントインを０．３％含有するブイヨン寒天スラント上に
、シュードモナス・ストリアタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ５ｔｒｉａｔａ ） Ｉ Ｆ ０１２９９６を保存
スラントから移植し、３３℃で２４時間培養した。

この菌体を前記培養培地に接種して、３３℃で２４時間
振盪下に培養を行った。

この培養液から菌体を遠心分離し、５０Ｉ７１１の生理
的食塩水で洗滌したのち再び遠心分離して集菌し、３３
ｒｎ１．の生理的食塩水に懸濁して菌体懸濁液を得た。

基質として５〜（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントイ
ンを用い、下記の反応液組成により微生物反応を行った
。

反応液組成 （１） ＤＬ−５−（１）−ヒドロキシフエ ５００
ｍ９ニル）ヒダントイン （２１ｐＨ９，５の１ ／ １０Ｍ ＮＨ４Ｃｌ
６７ｒｄ−ＮＩＰ４０Ｈ緩衝液 （３）前記菌体懸濁液 ３３ｍ１上
記反応液を３００ｒＩｌｌ容三角フラスコに分注して混
合し、３１℃で緩く振盪しながら４００時間反応せた。

この間２Ｎ−ＫＯＨを用いて反応液のＰＨを９．５に保
持させた。

反応後、遠心分離して得た上清の一部を採取して、５％
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドの２Ｎ塩酸水溶液
で発色させ、４２０ｍμの吸収を測定してＮ−カルバミ
ル（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンを比色定量した
。

その結果、反応液中に生成したＮ−カルバミル（ｐ−ヒ
ドロキシフェニル）クリシンノ量は４．５ ｙｎＩ？／
ｒｕｌ（変換率８２モル％）であった。

これに対し、前記菌体懸濁液を使用しないとき＋ｉ、Ｎ
−カルバミル（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンの生
成は全（認められなかった。

次いで上清を凍結乾燥して残渣をエタノール抽出し、沢
過により不溶物を除去した。

このエタノール溶液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル
とエタノールが２：１の組成の混合溶媒とし、そこへジ
シクロヘキシルアミン（ＤＣＨＡ）を約１．５当量加え
た。

このようにしてＮ−カルバミル（ｐ−ヒドロキシフェニ
ル）グリシン・ジシクロヘキシルアミン塩が白色沈澱と
して得られた（取得量６５５〜）。

これを採取したのち水性溶媒中でｔ１消量の亜硝酸ソー
ダを加え、塩酸酸性にして室温で１時間反応させた。

次いでこの反応液をＩＲ−１２０ＢのＨ型カラムに通し
てｐ−ヒドロキシフェニルグリシンを吸着させた。

１．５Ｎ−ＮＥ（、ＯＨで溶出したのち、減圧濃縮して
ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンを結晶状に単離した。

この結晶に関する赤外吸収スペクトルとシリカゲル薄層
クロマトグラフィー（展開溶媒はｎ−ブタノール：酢酸
：水−４：１：１）によるＲｆ値は共に標準品と一致し
、元素分析値も理論値に合致した。

比旋光度の測定結果は〔α〕２０−−１６１．８° （
Ｃ＝０．５、ＩＮ−ＨＣＩ） で、文献値（Ｃα３２
４＝−１５９，１０（Ｃ＝１、ＩＮ−ＨＣＩ）、特開昭
４９−５６９４６）ともはｙ一致し、このものが高純度
のＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンであることが確
認された。

このことから微生物反応で生成したＮ−カルバミル−ｐ
−ヒドロキシフェニルグリシンも０体であったことが
判明した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントインに、
   シュードモナス属に属しヒダントイン環を不斉的に開裂
   加水分解する能力を有する微生物の培養液、菌体または
   菌体処理物を作用せしめることを特徴とする、Ｄ−Ｎ−
   力ルバミル（ｐ−ヒドロキシフェニル）グリシンの製造
   法。 ２ ５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン※ン
   がＤＬ体である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ ５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントインが９
   体である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ４ ５−（ｐ−ヒドロキシフェニル）ヒダントインがＬ
   体である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ５ 反応を水性媒体中で行なう特許請求の範囲第一 １
   項記載の製造法。 ６ 水性媒体のｐＨを６〜１１に保持する特許請求の範
   囲第５項記載の製造法。 ７ 水性媒体のｐＨを７〜１０に保持する特許請求の範
   囲第５項記載の製造法。 ・ ８ 微生物の菌体が生菌体または乾燥菌体である特
   許請求の範囲第１項記載の製造法。 ９ 微生物の菌体処理物が菌体磨砕物または菌体処理物
   である特許請求の範囲第１項記載の製造法。