JPH037590A - Ｌ―アラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素法によるＬ−アラニンの製造法に間する
ものである。本発明によれば高収量で効率良くＬ−アラ
ニンを製造することが出来る。

Ｌ−アラニンは周知の如く、医薬、食品又は化学工業原
料として重要なアミノ酸であり、その需要が近年急激に
増加しつつある。

（従来の技術と！！題） Ｌ−アラニンの工業的製造法としては、主にＬ−アスパ
ラギン酸の酵素的脱炭酸により製造する方法（特公昭５
３−２７７９２号）あるいは、フマル酸とアンモニアか
らアスパルターゼ（Ｅ　Ｃ。

４、　３．　１．　１）及びアスパラギン酸β−脱炭酸
酵素（ＥＣ，４，１，１，１２）を作用させて製造する
方法（特開昭５６−３５９９１号公報）が提案されてい
る。しかしながら前者では原料となるし一アスパラギン
酸が比較的高価な為アラニンの製造費が高くつくこと、
又後者では、該両酵素が働く至適条件が異なる為、反応
槽を分離するか、若しくは、該両酵素を同時に作用させ
る場合には比較的低温で反応させるので、反応速度が低
いという問題を有していた。

本発明者らは、先にアスパラギン酸を含有する微生物菌
体又はその処理物とアスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含
有する微生物菌体又はその処理物との存在下、単一の反
応槽でフマル酸又はその塩及びアンモニア又はアンモニ
ウムイオンからＬ−アラニンを製造する方法を提案して
いる（特願昭６３−２３２５７０号）。本発明者らはさ
らにＬ−アラニン生成の反応速度を向上すべく鋭意検討
した結果、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素反応に於て、
反応液に少なくともα−ケト酸を添加することにより反
応温度４０〜５０℃で反応可能なことを見いだし、本発
明を完成するに到った。

（発明の構成及び効果） 本発明は、アスパルターゼを含有する微生物菌体又はそ
の処理物とアスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微
生物菌体又はその処理物の存在下、単一の反応槽でフマ
ール酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウムイオン
とからＬ−アラニンを製造するに際し、反応液中に少な
くともα−ケト酸を含有する水溶液にて反応温度を４０
〜５０℃に維持することを特徴とするＬ−アラニンの製
造法を提供するものである。本発明によれは、α−ケト
酸を含有する反応液にて反応温度を４０〜５０℃に維持
することにより高い反応速度で反応でき、Ｌ−アラニン
を効率良く製造することができる。

なお、本発明に使用するα−ケト酸は、ピルビン酸若し
くはその塩又はα−ケト酪酸若しくはその塩が好ましい
。

本発明に使用されるアスパルターゼを含有する微生物と
しては、該酵素活性を有し、コリネ型細菌に属するもの
であればいずれの菌株をも用いうるが、例えば、ブレビ
バクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
Ｉｌ＋　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３（微工研条
寄　第１４９７号）、ブレビバクテリウム・フラバム（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　
Ｊ　−２３３−ＡＢ−４１（微工研条寄　第１４９８号
）、ブレビバクテリウム−アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖ
　ｉ　ｂａｃｔｅｒｕｓ　　ａｍ＊ｏｎｉａｇｅｎｅｓ
）　Ａ　Ｔ　ＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グル
タミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａ
ｍｉｃｕｍ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３１８３０等をあげること
ができ、これらの菌が好適に用いられる。

一方アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物菌
体としては、該酵素活性を有し、シュードモナス属に属
するものであればいずれの菌株をも用いうるが、例えば
、シュードモナス・ダクネ−（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　ｄａｃｕｎｈａｅ）　ＩＡＭ　１１５２、同ＡＴＣＣ
２１１９２、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）　ＡＴＣＣ２１８１２、同　
ＪＡＭ　１５０６、シュードモナス−フルオレッセンス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆ　Ｉｕ。

ｒｅｓｅｎｓ）　ＩＦｏ　３０８１．　　シュードモナ
ス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒ
ｕ８ｉｎｏｓａ）　ＩＡＭ　１０５４等が挙げられ、こ
れらの菌体が好適に用いられる。

本発明に用いられる上記微生物菌体は面体のまま用いる
こと、も出来るし、その処理物すなわち菌体の破壊物と
しても使用することができる。菌体の破壊は、それ自体
既知の、例えば、超音波処理、圧搾等の方法を用いて行
うことができる。

本発明の方法に使用される上記の微生物菌体の調製に使
用する培地は、特に限定されるものではなく一般の微生
物に使用されるものでよい。

アスパルターゼを含有する微生物菌体の調製に使用する
培地の炭素源は特に限定されるものではないが、例えば
、グルコース、エタノール、酢酸やフマル酸等の有機酸
等を用いることができる。

培地の窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若
しくは混合して用いることができる。無機塩としては、
リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム等が用いられる。この池に菌の生育及びＬ−
アスパラギン酸生成に必要であれば、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチーブリカー　カザミノ酸、
各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用いる。

アスパルターゼを含有する微生物菌体の培養は通気攪拌
、振盪等の好気的条件下で行い、培養温度は２０〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃で行う、培養途中のｐＨは
５〜ｌＯ１好ましくは７〜８付近にて行い、培養中のｐ
Ｈの調整には酸、アルカリを添加して行う。培養時間は
２〜９日間、最適期間は４〜７日間である。

一方、アスバルギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
菌体の調製に使用する培地の炭素源は特に限定されるも
のではないが、例えば、フマル酸、コハク酸、アスパラ
ギン酸等を挙げることができ、それらの中でもフマル酸
が好適に使用される。培地の窒素源としては、アンモニ
ア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、尿素等の無機塩を用いることができるし、また
、ペプトン、酵母エキス、コンスティープリカー　カザ
ミノ酸等の有機栄養源も使用することができる。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。

アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する菌体の培養は
、通気攪拌、凛盪等の好気的条件下で行い、培養温度は
２０〜４０℃、好ましくは２８℃〜３２℃で行う。培養
途中のｐ、　Ｈは５〜１０好ましくは７〜８付近にて行
い、培養中のｐＨの調整には、酸、アルカリを添加して
行う。培養開始時のフマル酸１度は好ましくは０．　１
〜５１量％、更に好ましくは０．５〜２重量％が適する
。培養器間は１０時間〜４日間、最適期間は１〜３日間
である。

このようにして得られる培養物から各々菌体を集めて、
水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素反応
に使用する。

本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌体
又はその処理物の存在下、少なくともフマル酸又はその
塩とアンモニア又はアンモニウムイオンとα−ケト酸を
含有する水溶液にて酵素反応させる。ここで該水溶液に
添加されるＬ−アラニン製造の反応原料となるフマル酸
又はその塩の濃度は、０．　５〜３０重量％、好ましく
は５〜１５重量％である。アンモニア又はアンモニウム
イオンの添加濃度としては、００１〜５モル、好ましく
は０．５〜３．５モルである。

また、反応液に添加するα−ケト酸としてはピルビン酸
若しくはその塩、又はα−ケト酪酸若しくはその塩が好
適に用いられる。添加濃度は、０゜０００１〜０．５重
量％、好ましくは０．００１〜０．　２重量％が使用さ
れる。

上記した水性反応液に添加することができるフマル酸の
塩としては、例えばアンモニウム塩、ナトリウム塩、カ
リウム塩、カルシウム塩等が挙げられ、またピルビン酸
若しくはα−ケト酪酸の塩としては、例えばナトリウム
塩、カリウム塩等が挙げられる。さらにアンモニウムイ
オン源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、等を添加することができる。

該水溶液には、さらにピリドキサール５′リン酸を０．
０００５〜０．０５道量％好ましくは、０．００１〜０
．０１重量％添加して用いることができる。さらに必要
な場合には非イオン性の界面活性剤、例えばポリオキシ
エチレン（９）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒ　ｉ　
ｔｏｎＸ−１００）、ポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート（Ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　２０　）
等を０．０１〜０゜５重量％、好ましくは０．０３〜０
．　２１量％を添加して用いることができる。本発明に
おいて、酵素反応時のｐＨは６．０〜１０，０、好まし
くは、ｐＨ７，０〜８．５であり、反応温度は約４０〜
約５０℃、好ましくは約４２〜約４７℃であり、反応は
通常約５〜約７２時間行われる。

上記のような反応方法によって得られる反応液中に生成
したＬ−アラニンの分離・精製は、公知のイオン交換樹
脂処理等により行うことができる。

実験例 以下の実験例において、Ｌ−アラニンの定性は、ペーパ
ークロマトグラフのＲｆ値と高速液体クロマトグラフの
保持時間及び精製物の比旋光度により確認した。定量は
高速液体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を併用
して行った。また下記の実験例において％と表わしたの
は重量％を意味する。

実験例−１アスパルターゼ含有菌体の調製（１）Ａ）ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３菌体の培養 培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．　４％、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰＯａ０．０５％、Ｍｇ
５Ｏａ・７Ｈ２００，０５％、ＣａＣＲ２・２Ｈ２０２
ｐｐｍ、ＦｅＳＯ４，７Ｈ２０２ｐｐｍ、Ｍｎ５Ｏａ、
４〜６Ｔ−１２０　２ｐｐｍＳ　ＺＩＩＳ０４舎７Ｈ２
０２ｐｐｍ、　ＮａＣＲ・２ｐｐｍ、ビオチン２００μ
ｇ／Ｑ、チアミン・ＨＣｌｌ１００μｇＩＱ、　　カザ
ミノ酸０．　１％、酵母エキスＯ１１％）１００ｍ９を
５００　ｍ　Ｑ容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後ｐ
Ｈ７，０）Ｌ／た後ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２
３３＜ｙ＆工研条寄　第１４９７号）を植菌し、無菌的
にエタノールを２　ｍ　Ｑ加え、３０℃にて２日間振盪
培養を行った。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２．３％、ＫＨ２
ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰ　Ｏ４０，０５％、Ｍｇ５
Ｏａ・７Ｈ２００，０５％、Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏａ−７Ｈ２
０２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４，４〜６Ｈ２０２ｏ　ｐ　ｐ
　ｔｎ、　　ビオチン２００７１ｇ　／　Ｑ、チアミン
・ＨＣｌ２１００μｇ／Ｒ，カザミノ酸０．　３％、酵
母エキス０．　３％）１０００ｔｎＱを２Ｑ容通気撹拌
槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、エタノー
ルの２０ｍＱと前記培養物の２０　ｍ　Ｑを添加して、
回転数１１００Ｏｒｐ、通気１１１ＶＶｍ、温度３３℃
、ｐＨ７，６にて４８時間培養を行った。

なお、エタノールは、培養中培地の濃度が２容量％をこ
えないように、約１〜２時間ごと断続的に添加し、最終
的に１００ｍＱまで添加した。

培養終了後、培養物１００１００Ｏから遠心分離して集
菌した。

Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）項にて調製した微生物菌体内にはアスパルター
ゼの他に副反応酵素フマラーゼが共存する為、原料とな
るフマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じるの
で、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を実施した。

上記Ａ）項にて調製した面体を反応液［Ｌ−アスパラギ
ン酸１００　ｇ、　　アンモニア（２８％アンモニア含
有水溶液）　１４０　ｍ　Ｑ　、　　Ｃａ　Ｃ９２・２
　Ｈ２Ｏ１ｇ、　　ポリオキシエチレンソルビタンモノ
ラウレート０．８ｇ；　蒸留水ＩＱ中に含有コのＩＱに
懸濁後４５℃にて５時間加熱処理を行った。

該処理物は遠心分離により集菌後、該菌体をアスパルタ
ーゼ含有菌体として使用した。

実験例−２アスパルターゼ含有菌体の調製（２）Ａ）ブ
レビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２
面体の培養 実験例−１で用いたアスパルターゼ含有菌体の調製培地
１００ｍ２を５００　ｍ　Ｑ容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後ｐＨ７）Ｉ、、た後、ブレビバクテリウムφ
アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋ａ
ｍｍｏｎｉａ８ｅｎｅｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ６８７２を植
菌し、無菌的に５０％グルコース溶液を２ｍ１１加え、
３０℃で２４ｈｒｌｉとう培養を行った。

次に、同じく実験例１の本培養培地１０００ｍ９を２Ｑ
容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後
、５０％グルコース溶液の４０ｍ９と前記培養物の２０
　ｍ　Ｑを添加して、回転数１゜０００　ｒ　ｐ　ｍ、
　　通気量１　ｖ　ｖ　ｍ、　　温度３３°Ｃ１ｐＨ７
，６にて２４時間培養を行った。

なお、グルコースは、約１〜２時間ごとに５ｇずつ添加
し、最終的に７０ｇまで添加した。培養終了後、培養物
１．ＯＯＯ＋ｎＱから遠心分離して集菌した。

Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）］にて調製した菌体を実験例−１のＢ）項で用
いた反応液ｌＱに懸濁後、４５℃にて２時間加熱処理を
行った。該処理物は遠心分離により集菌後、該菌体をア
スパルターゼ含有菌体として使用した。

実験例−３７スパルタ一ゼ含有菌体の調製（３）Ａ）コ
リネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３０菌
体の培養 実験例−１のアスパルターゼ含有菌体の調製培地１００
ｍＱを５００　ｍ　Ｑ容三角フラスコに分注、滅菌（滅
菌後ｐＨ７）Ｌ／た後、コリネバクテリウム０グルタミ
カム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ、ｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａ
ｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３０を植菌し、無菌的に５
０％グルコースｉ容Ｒ１を２　ｍ　Ｑカロえ、３０℃で
２４　ｋｓ　ｒ振どう培養を行った。

次に、同じく実験例１の本培養培地１０００ｍΩを２Ｑ
容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後
、５０％グルコース溶液の４０ｍΩと前記培養物の２０
ｍ９を添加して、回転数ｌ１０００ｒｐ、通気ｍ　１　
ｖｖｍ、　　温度３３℃、ｐ）（７，６にて２４時間培
養を行った。

なお、グルコースは、約１〜２時間ごとに５ｇずつ添加
し、晟終的に７０ｇ添加した。培養終了後、培養物１０
００　ｍ、　Ｓ！から遠心分離して集菌した。

Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）項にて調製した菌体を実験例−１のＢ）項で用
いた反応液ｌＱに懸濁後、４５℃にて２時間加熱処理を
行った。該処理物は遠心分離により集菌復線菌体をアス
パルターゼ含有面体として使用した。

実験例−４アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体の調
製 Ａ）シュードモナス・ダクネー　＋ＡＭ１１５ＳＢＪｒ
体の培養 培地（フマル酸ナトリウム０．５％、フマル酸アンモニ
ウム１．　０％、酵母エキス０．　５％、リンミー力＋
）　ラムｏ、　　０５％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７１（２
００，０５％、ｐＨ７，０）１００ｒｎＱを５００ｍ２
容三角フラスコに分注、滅菌した後シュードモナス・ダ
クネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄａｃｕｎｈａｅ）
　ｌ　ＡＭ１１５２を植菌し、３０℃にて１日間厖Ｊ培
養を行った（前培養）。次に、上記培地と同様の培地１
２を２９容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（１２０’Ｃｌ２
Ｏ分閘）後１前培養物の２０ｍ１を添加して、回転数１
１０００ｒｐ、　　通気型１ｖｖｍ、温度３０℃、ｐＨ
７，３にて１日間培養を行った。

培Ｉ！終了後、培養物１０００　ｍ　Ｑから遠心分離し
て集関した。

Ｂ）フマラーゼ活性の除去処理 上記Ａ）頃にて調製した微生物菌体内にはアスパラギン
酸β−脱炭酸酵素の他に副反応酵素フマラーゼが共存す
る為、原料とフマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題
が生じるので、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を
実施した。

上記Ａ）項にて調製した菌体を反応液（ピルビン酸ナト
リウム０．１１ｇ、　　ピリドキサール５′−リン酸ｔ
ｏｍｇ；　蒸留水ＩＱ中に含有）の１２に懸濁後、５０
℃にて２時間加熱処理を行った。

該処理物は遠心分離により集菌後、該菌体をアスパラギ
ン酸β−脱炭酸酵素含有菌体として使用した。

実施例−１ 実験例−１のＢ）項と実験例−４のＢ）項にて調製した
菌体の懸濁液２００ｍＱから遠心分離により集菌した各
微生物菌体を合併し、反応液［フマル酸アンモニウム　
１モル、ピルビン酸ナトリウム６ミリモル、ピリドキサ
ール５′−リン酸０．０４ミリモル、ポリオキシエチレ
ン（２０）ソルビタンモノラウレ−１−０，０５％、ｐ
　Ｈ７゜５（２８％アンモニア水にて調整）］の２２０
０ｍに懸濁後、ＩＱ容通気攪拌槽に仕込み、第１表の実
施区の条件にて、撹拌回転数３００ｒｐｍにて２０時間
反応した。

反応終了後、反応液中の生成アラニンを電層した。結果
を第１表に示した。該反応ｉαの１００「ηΩをｐＨ４
，０に調整後、煮沸濾過し、該癌液をアンバーライｌ−
Ｉ　ＲＣ−５０（Ｈ”型）に導通後、水洗し次いで４．
５％アンモニア水で溶出する。

この溶出）αを減圧濃縮後、冷エタノールにて結晶を析
出させた。Ｌ−アラニン回収盪を第１表に示した。さら
に回収アラニンについて比旋光度を測定したところすべ
て［α　］：１４．３°　（Ｃ＝１０．６Ｎ−トＩＣＱ
＞であった。

なお、比較例として反応液にピルビン酸を添加しない場
合のＬ−アラニン生成ｌを第１表にあわせて示した。

実施例−２ 実施例−１の反応液中のピルビン酸ナトリウムをα−ケ
ト酪酸５ミリモルに変えた以外は実施例−１と同様の実
験を行った。結果を第２表に示した。

なお、回収されたＬ−アラニンの比旋光度は［α　］’
、：：＋１４．３’　　（Ｃ＝１０．６Ｎ−ＨＣＩ＋）
であった。

実施例−３ 実験例−２のＢ）項と実験例−４のＢ）項にて調製した
菌体の懸濁液２００ｍ１１から集菌した各微生物菌体を
用い、実施例−１と同様に反応、精製した。結果を第３
表に示した。さらに回収アラニンについて比旋光を測定
したところ［α］′：＝−１−１４．４°　（Ｃ＝１０
．６Ｎ−ＨＣＩりであった。

実施例−４ 実施例−３の反応液中のピルビン酸ナトリウムをα−ケ
ト酪酸ナトリウム５ミリモルに変えた以外は実施例−３
と同様の実験を行った。結果を第４表に示した。

なお、回収されたＬ−アラニンの比旋光度は［α］’：
＝＋１４．４°　（Ｃ＝１０．６Ｎ−ＨＣＱ）であった
。

実施例−５ 実験例−３のＢ）項と実験例−４のＢ）項にて調製した
菌体の懸濁液２００ｍＱから集菌した各微生物菌体を用
い、実施例−１と同様に反応、精製した。結果を第５表
に示した。さらに回収アラニンについて比旋光を測定し
たところ［α］′：＝＋１４．４°　（Ｃ＝１０．６Ｎ
−ＨＣＱ）であった。

実施例−６ 実施例−５の反応液中のピルビン酸ナトリウムをα−ケ
ト酪酸ナトリウム５ミリモルに変えた以外は実施例−５
と同様の実験を行った。結果を第６表に示した。

なお、回収されたＬ−アラニンの比旋光度は［ａｌ、＝
＋ｔａ、３°　（Ｃ＝１０．６Ｎ−ＨＣＦ）であった。

第１表 第２表 第４表 第３表 第５表

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アスパルターゼを含有する微生物菌体又はその処
   理物とアスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
   菌体又はその処理物との存在下、水溶性溶媒中でフマル
   酸又はその塩とアンモニア又はアンモニウムイオンとを
   単一の反応槽で反応させ、該反応液中にＬ−アラニンを
   生成せしめるに際し、該反応液に少なくともα−ケト酸
   を含有させて反応温度が４０〜５０℃で反応させること
   を特徴とするＬ−アラニンの製造法。