JPH0279989A

JPH0279989A - Ｌ−アラニンの製造法

Info

Publication number: JPH0279989A
Application number: JP63232570A
Authority: JP
Inventors: Masato Terasawa; 真人寺沢; Shoichi Nara; 昭一奈良; Masayuki Inui; 将行乾; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1988-09-19
Filing date: 1988-09-19
Publication date: 1990-03-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、酵素法によるＬ−アラニンの製造法に関する
ものである０本発明によれば高収量で効率良くＬ−アラ
ニンを製造することが出来る。

Ｌ−アラニンは周知の如く、医薬、食品又は化学工業原
料として重要なアミノ酸であり、その需要が近年急激に
増加しつつある。

（従来の技術と課題）Ｌ−アラニンの工業的製造法としては、主にＬ−アスパ
ラギン酸の酵素的脱炭酸により製造する方法（特公昭５
３−２７７９２号公報）あるいは、フマル酸とアンモニ
アからアスパルターゼ及びアスパラギン酸膜炭酸酵素を
作用させて製造する方法（特開昭５６−３５９９１号公
報）が提案されている。しかしながら前者では原料とな
るし一アスパラギン酸が比較的高価な為アラニンの製造
費が高くつくこと、又後者では、該両酵素が働く反応液
のｐＨが大きく異なる為、反応槽を分離するか、若しく
は、該両酵素を同時に作用させる場合にはｐａｌ中性域
で反応させるので、該酵素を含有する微生物菌体又はそ
の処理物を使用するに当たっては、微生物菌体内に共存
するＬ−アラニンをラセミ化する酵素をあらかじめ失効
させる処理が必要となる（特開昭５７−１３２８８２号
公報、特開昭６２−８７０８８号公報）など煩雑な問題
が残されていた。

本発明者らは、先に、フマル酸とアンモニアからのＬ−
アスパラギン酸の酵素的製造法を提案（特公昭６１−２
９７１８号公報）しているが、該方法に使用したアスパ
ルターゼを含有するブレビバクテリウム属に属する微生
物は、高アルカリ域（ｐＨ９〜１０）で高活性を示すこ
とを特徴としている。そこで、この点に着目してアスパ
ルターゼを含有する微生物菌体又はその処理物とアスパ
ラギン酸β−税炭酸酵素を含有する微生物又はその処理
物との存在下、フマル酸又はその塩及びアンモニア又は
アンモニウムイオンからＬ−アラニンを効率良く製造す
る方法の検討を実施した。その結果、反応液のｐＨを９
〜ｌＯに維持することにより、Ｌ−アラニンのラセミ化
が起こらない状態で高収量でＬ−アラニンを生成出来る
ことを見出し、本発明に到達しするに至った。

（発明の構成及び効果）本発明は、アスパルターゼを含有する微生物菌体又はそ
の処理物とアスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微
生物菌体又はその処理物の存在下、フマル酸又はその塩
とアンモニア又はアンモニウムイオンとからＬ−アラニ
ンを製造するに際し、反応液のｐｔｉを９〜ｌＯに維持
することを特徴とするＬ−アラニンの製造法を提供する
ものである０本発明によれば、反応液中のｐＨを９〜１
゜に維持することによりラセマーゼ活性を発現させるこ
となく、すなわちＤ−アラニンを生成することなく、Ｌ
−アラニンのみを効率良く製造出来る。

（発明の詳細な説明）本発明に使用される微生物は、アスパルターゼを含有す
る微生物としては、ビオチン要求性のコリネ型細菌に属
するものであればよく、例えば本発明に使用される微生
物としては、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）　ＭＪ−２３
３（微工研条寄　第１４９７号）、ブレビバクテリウム
・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｓ　　ｆｌａ
ｖｕｗ）　Ｍ　Ｊ　−２３３−Ａ　Ｂ　−４１（微工研
条寄第１４９８号）等であり、これらの菌が好適に用い
られる。

一方アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有するシュード
モナス属に属する微生物としては、特に制限されるもの
ではないが、例えば、シュードモナス０ダクネー（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄａｃｕｎｈａｅｌｌＡＭ　１１
５２、同ＡＴＣＣ２１１９２、シェードモナス・プチダ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）＾ＴＣＣ２
１８１２、同ＩＭＦ　１５０６、シュードモナス・フル
オレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。

ｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＰｏ　３０８１％
シェードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　ＩＭＦ　１０５４等が
好適に用いられる。

本発明に用いられる上記微生物菌体は菌体のまま用いる
ことも出来るし、その処理物すなわち菌体の破壊物ある
いは固定化物としても使用することが出来る。固定化手
法としては、菌体をアクリルアミド等の重合性モノマー
を用いたり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の適
当な担体に不溶化させる等がある。

本発明の方法に使用される上記の微生物国体の調製に使
用する培地は、特に限定されるものではなく一般の微生
物に使用されるものでよい。

アスパルターゼを含有する微生物菌体の調製に使用する
培地の炭素源は特に限定されるものではないが、その中
でもエタノールが好適に使用される。

培地の窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若
しくは混合して用いることが出来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、ｍ酸マグネシウム等が用いられる。この他に
菌の生育及びし−アスパラギン酸生成に必要であれば、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカ
ー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
し用いる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行う、培
養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近にて行
い、培養中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加して行
う。

培養開始時のエタノール濃度は好ましくは１〜５容量％
、更に好ましくは２〜３容量％が適する、培養期間は２
〜９日間、最適期間は４〜７日間である。

一方、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物
菌体の調製に使用する培地の炭素源は特に限定されるも
のではないが、その中でもフマル酸が好適に使用される
。培地の窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無
機塩を用いることが出来るし、また、ペプトン、酵母エ
キス、コンスティープリカー、カザミノ酸等の有機栄養
源も使用することが出来る。無機塩としては、リン酸−
水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウ
ム等が用いられる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３２℃で行う
、培養途中のｐＨは５〜１０好ましくは７〜８付近にて
行い、培養中のｐＨの調整には、酸、アルカリを添加し
て行う、培養開始時のフマル酸濃度は好ましくは０．１
〜５重量％、更に好ましくは０．５〜２重量％が適する
。培養期間は１０時間〜４日間、最適期間は１〜３日間
である。

このようにして得られた培養物から各々菌体を集めて、
水又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素反応
に使用する。

本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌体
又はその処理物の存在下、少なくともフマル酸又はその
塩とアンモニア又はアンモニウムイオンを含有する水溶
液にて酵素反応させる。ここで該水溶液に添加されるフ
マル酸又はその塩の濃度は、０．５〜３０重ｉｉ％、好
ましくは５〜１５重量％である。アンモニア又はアンモ
ニウムイオンの添加濃度としては、０．１〜５モル、好
ましくは０．５〜３．５モルである。

該水溶液には、さらにビリドキシサール５′リン酸を０
．０００５〜０．０５重量％、好ましくは、０．００１
〜０．０１重量％添加して用いることが出来る。さらに
必要な場合には非イオン性の界面活性剤、例えばトリト
ンＸ−１００、トウイーン２０等を０．Ｏ１〜０．５重
量％、好ましくは０．０３〜０．２重量％を添加して用
いることが出来る０本発明において、酵素反応時のｐＨ
は９．０〜１０．０．好ましくは、ｐＨ９，２〜９．５
であり、反応温度は約２０〜約５０℃、好ましくは約３
０〜約４０℃であり、反応は通常約１０〜約７２時間行
われる。

上記のような反応方法によって得ら１れる反応液中に生
成したＬ−アラニンの分離・精製は、公知のイオン交換
樹脂処理等により行うことが出来る一実」１例− 以下の実験例において、Ｌ−アラニンの定性は、ペーパ
ークロマトグラフのＲｆ　１ｍｌと高速液体クロマトグ
ラフの保持時間及び精製物の比旋光度により確認した。

定量は、高速液体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ
）とを併用して行った。また下記の実験例において％と
表したのは重量％を意味する。

実験例−１アスパルターゼ含有画体の調製培地（尿素０
．４％、硫酸アンモニウム１．４％、　ＫＨｚ　　ＰＯ
４０，０５％、　Ｋ２　　ＨＰ　０４　０　。

０５％、Ｍｇ　Ｓ０４　・　７Ｈ２００，０５％、Ｃａ
Ｃｌ４．　　・　２Ｈ２０２ｐｐｍ、　　Ｆｅ５０゜Ｉ
Ｈ＊　　０　　２ｐｐｍＳ　Ｍｎ５Ｏ＋　　・　４−６
Ｈ２０２ｐｐｍ、Ｚｎ５Ｏ，・　７Ｈ２０２ｐ９ｍ。

ＮａＣ１・２ｐｐｍ、ビオチン２００　　ｐｇ／ｌ、チ
アミン・Ｈ（１１００μｇ／ｌ、カザミノ酸　０．１％
、酵母エキス　０．１％）１００ｍｌを５００ｍｆｆ１
容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）Ｌ、
た後ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３（
微工研条寄　第１４９７号）を植菌し、無菌的にエタノ
ールを２ｍｌ加え、３０℃にて２日間振盪培養を行った
。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２．３％、ＫＨｚ
　ＰＯ４０，０５％、Ｋｘ　ＨＰ　０４　００５％、Ｍ
ｇ５Ｏ，・７Ｈ＊ＯＯ，０５％、Ｆｌ！３０４　　・７
Ｈ＊　０　２０ｐｐｍ、Ｍｎ５Ｏ。

・４〜６　Ｈ２０２０ｐ　ｐ　ｍ、ビオチン２００μｇ
／ｌ、チアミン・ＨＣｊ　　１１００ｐ／ｌ、カザミノ
酸０．３％、酵母エキス０．３％　）１０００ｍｊ！を
２１℃容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分
間）後、エタノールの２０ｍｌと前記前培養物の２０ｍ
１を添加して、回転数１１００Ｏｒｐ、通気量１ｖｖｍ
、温度３３℃ｐＨ７，６にて４８時間培養を行った。

尚、エタノールは、培養中培地の濃度が２容量％を越え
ないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。

培養終了後、培養物１０１００Ｏから遠心分離して集菌
した。

実験例−２７スパルタ一ゼ含有菌体の前処理（フマラー
ゼ活性の除去処理）実験例−１にて調製した微生物菌体内にはアスパルター
ゼの他に副反応酵素フマラーゼが共存する為、原料とな
るフマル酸が一部リンゴ酸に変換される問題が生じるの
で、あらかじめフマラーゼ活性の除去処理を実施した。

実験例−１にて調製した菌体を反応液（し−アスパラギ
ンａ　１００　ｇ　、アンモニア（２８％アンモニア含
有水溶液）　　１４０ｍｊ！、　Ｃａ　Ｃ］２　−２Ｈ
＊０１ｇ、）ウィーン２０　０．８ｇ；蒸留水Ｈｚ中に
含有）の１１に懸濁後、４５℃にて５時間加熱処理を行
った。該処理物は遠心分離により集菌後、該菌体をアス
パルターゼ含有菌体として使用した。

実験例−３アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体の調
製培地（フマル酸ナトリウム０．５％、フマル酸アンモニ
ウム１゜０％、酵母エキス０．５％、リン酸１カリウム
０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５９４、Ｉ）
Ｈ７，Ｏ）１００ｍｆｆｉを５０ＱｍＪ容三角フラスコ
に分注、滅菌した後シュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄａｃｕｎｈａｅ）１４Ｍ１１５２
を植菌し、３０℃にて１日間振盪培養を行った（前培養
）８次に、上記培地と同様の培地ｌｌを２１容通気攪拌
槽に仕込み、滅菌（１２０℃２０分間）後、前培養物の
２０ｍ１を添加して、回転数１１００Ｏｒｐ、通気量１
ｖｖｍ、温度３０℃、ｐＨ７，３にて１日間培養を行っ
た。

培養終了後、培養物１０１００Ｏから遠心分離して集菌
後、該菌体をアスパラアギン酸β−幾炭酸酵素含有菌体
として使用した。

実施例−１実験例−２と実験例−３にて調製した各微生物菌体を反
応液（フマル酸アンモニウム　１モル、ピリドキサール
５′−リン酸　０．０４ミリモルトウィーン２００．０
５％、ｐＨ９，２（２８％アンモニア水にて調整）〕の
１１に懸重Ｌ２１容通気攪拌槽に仕込み、３０℃、攪拌
回転数３００ｒｐｍにて４５時間反応した。なお、反応
液中のｐ）（は５Ｎ−硫酸にてｐＨ９，２に維持した０
反応終了後、反応液中の生成アラニンを定量したところ
８８ｍｇ／ｍｌの濃度であった。該反応終了液の５００
ｍ１をｐＨ４，０に調整後、煮沸濾過し、該濾液をアン
バーライトＩＲＣ−５０（Ｈ＋型）に導通後、水洗し次
いで４．５％アンモニア水で溶出する。この溶出液を減
圧濃縮後、冷エタノールにて結晶を析出させた。Ｌ−ア
ラニン２５．２ｇを得た。比旋光度（α）：’＝　　＋
１４　、３°　　（Ｃ＝１０　、　　６Ｎ−ＨＣ１）　
　。

なお、反応液のｐＨを８．５に維持した場合同様の操作
を行い得られたアラニン結晶の比旋光度を測定したとこ
ろ（α）ｒ＝　　＋３．Ｏｏ　＜Ｃ−１Ｏ１６Ｎ−ＨＣ
ｊ）であり生成したアラニンの約４０％がＤ−アラニン
であった。

実施例−２アスパルターゼ含有菌体としてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｓ　　ｆｌａｖｕ
ｓ＋）　Ｍ　Ｊ−２３３−ＡＢ−４１（微工研条寄　第
１４９８号）を用いた他は実験例−１及び実験例−２と
同様の操作にてｉｌＩ製した実験例−２の菌体と実験例
−３で調製した菌体とを用いて実施例−１と同様の操作
を行った。その結果、反応終了液中のしアラニン生成量
は８７　ｍ　ｇ　／　ｍ　１であった。さらに反応終了
液５０９ｍｊから回収されたＬ−アラニンは２４．８ｇ
であり、比旋光度〔α〕ｒ−＋１４．３°（Ｃ＝１０．
６Ｎ−Ｈ（１）であった第　　１表参考例−１アスパルターゼ活性に及ぼすｐｌ（の影響アスパルターゼ含有菌体（実験例−１，２で調製したブ
レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３、および
同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１）の５ｇ湿菌体を反応液（
フマル酸　１０ｇ、ＣａＣｊ＊　　Ｈ２Ｈ２００，１ｇ
、　トウイーン２０　　ｏ、ｏｓｇ：水１００ｍＪ中に
含有（２８％アンモニア水にてｐＨを下表の実験区に調
整））１００ｍｊに添加後、３０℃にて１時間反応させ
、反応終了液中のし一アスパラギン酸量を定量し、アス
パルターゼ活性とした。

結果を第１表に、ｐＨ９，０の場合の活性値を１００と
する相対活性で示した。

参考例−２アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性に及ぼす
ｐＨの影響アスパラギン酸β−脱炭酸酵素含有菌体（実験例−３に
て調製）の５ｇ湿菌体を反応液〔Ｌ−アスパラギンＭ１
０ｇ、ピリドキサール５′リン酸１ｍｇ、）ウィーン２
０　０．０８ｇ：水１００ｍ１中に含有（２８％アンモ
ニア水にてｐＨを下表の実験区に調整））１００ｍｆに
添加後、３０℃にて１時間反応させ、反応終了液中のア
ラニン置を定置し、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性
とした。結果を第２表に、ｐＨ９，０の場合の活性値を
１００とする相対活性で示した。

第　　２表

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アスパルターゼを含有する微生物又はその処理物
とアスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物又は
その処理物との存在下、フマル酸又はその塩とアンモニ
ア又はアンモニウムイオンとを反応させ、該反応液中に
Ｌ−アラニンを生成せしめるに際し、反応液のｐＨを９
〜１０に維持することを特徴とするＬ−アラニンの製造
法。