JPH0346110B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明はＬ−あるいはＤ−リジンのセラミ化
方法に関する。従来、Ｌ−あるいはＤ−リジンを
酵素的にラセミ化する方法は、いくつか知られて
いる。その方法は、シユードモナス属、プロテウ
ス属およびエシエリヒア属細菌の生産するリジン
ラセマーゼ（EC.5.1.1.5）を使用する方法、シユ
ードモナス属細菌の生産するアルギニンラセマー
ゼ（EC・1.1.9）を使用する方法シユードモナス
属細菌の生産するアミノ酸ラセマーゼ
（EC.5.1.1.10）を使用する方法である（朝倉書店、
酵素ハンドブツク、丸尾文治、田宮信雄監修、
1982、P728〜730）。 本発明者らは、この様な従来のＬ−あるいはＤ
−リジンのラセミ化法に対し、より効率の良い方
法を見い出すべく研究した結果、アルカリゲネス
属、エアロモナス属、アースロバクター属、アク
ロモバクター属、アグロバクテリウム属、アシネ
トバクター属、ブレビバクテリウム属、バチルス
属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、
キヤンデイダ属、エンテロバクター属、エルビニ
ア属、フラボバクテリウム属、ジオトリクム属、
ハフニア属、クルイヘラ属、クレブシエラ属、リ
ポミセス属、ミクロコツカス属、ミコプラナ属、
ザルチナ属、セラチア属、サルモネラ属、トリコ
スポロン属、トルロプシス属、ビブリオ属に属す
る微生物が、Ｌ−あるいはＤ−リジンをラセミ化
する事を見い出し、本研究を完成するに至つた。 即ち本発明は、Ｌ−あるいはＤ−リジンをラセ
ミ化せしめる能力を有する微生物を水性媒体中に
てＬ−あるいはＤ−リジンに作用せしめ、Ｌ−リ
ジンをセラミ化せしめることを特徴とする、Ｌ−
あるいはＤ−リジンのラセミ化方法に関する。 本発明の微生物は具体的には以下のものがある

【表】

【表】 等がある。 これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地
を用いて、培養の初めから、あるいは培養の途中
でＬあるいはＤ−リジンを添加して培養すればよ
い。 本微生物の培養のために用いられる培地はＬ
−、Ｄ−、又はDL−リジンを含むほかは通常の
炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培
地である。 更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を
添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じて適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10
日培養を行えば望ましい結果が得られる。 菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、
培養液より分離された菌体、洗浄された菌体な
ど、いづれも使用可能である。菌体処理物として
は凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン、
界面活性剤等と接触せしめた菌体、リゾチームで
処理した菌体、超音波にさらした菌体、機械的に
摩砕した菌体等のほか、これら菌体処理物から得
られた、ＬあるいはＤ−リジンをラセミ化せしめ
る酵素活性を有する酵素蛋白区分、更には、これ
らの菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、そ
の他いずれも使用できる。 水溶性媒体としては、水、バツフアーおよびエ
タノール等の有機溶媒を含むものが使用できる。
更に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄養
素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、および金属
イオン等を水性媒体に添加することもできる。 上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しなが
ら、菌体とＬあるいはＤ−リジンを接触せしめて
作用せしめる場合には、ＬあるいはＤ−リジンを
含み、かつ微生物の生育に必要な炭素源、窒素
源、無機イオンなどの栄養素を含む水性媒体が用
いられる。更にビタミン、アミノ酸等の有機微量
栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合
が多い。 炭素源としては、グリコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。 無機イオンとしては、マグネシウムイオン、燐
酸イオン、カリイオン、鉄イオン、その他が必要
に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ま
しい結果が得られる。 かくして１ないし10日間も培養を行えば、Ｌあ
るいはＤ−リジンは効率よくラセミ化される。 これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、
培養菌体あるいは菌体処理物をＬあるいはＤ−リ
ジンと接触せしめて作用せしめる場合には、Ｌあ
るいはＤ−リジンと培養液、培養菌体あるいは菌
体処理物を溶解またはけん濁した水性媒体を10℃
ないし70℃の適当な温度に調節し、PHを４ないし
８に保ちつつ、暫時静置または撹拌すればよい。
かくして５ないし100時間も経過すれば水性媒体
中に多量のＬあるいはＤ−リジンのラセミ化物が
生成蓄積される。 このようにして得られたＬあるいはＤ−リジン
のラセミ化物を培養液又は水溶液より採取する方
法は、イオン交換樹脂を用いる方法、等電点にて
沈澱せしめる方法等、通常の方法が採用される。 生成したアミノ酸の定量は濾紙上に展開したア
ミノ酸（溶媒：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝２：
１：１）ニンヒドリンで発色させ、発色部位を50
％エタノールで抽出して570ｍμで比色する方法
およびバイオアツセイで測定する方法を用いた。 光学異性体は結晶の比旋光度を測定する事によ
つてＤ、Ｌを定めた。 実施例 １ グルコース0.5ｇ／dl、硫安0.3ｇ／dl、
KH₂PO₄0.1ｇ／dl、K₂HPO₄0.3ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.05ｇ／dl、FeSO₄・7H₂O0.001
ｇ／dl、MnSO₄4H₂O0.001ｇ／dl、酵母エキス
0.5ｇ／dl、ポリベプトン0.5ｇ／dl、マルツエキ
ス0.5ｇ／dl、Ｌ−リジン塩酸塩0.3ｇ／dl、ピリ
ドキシン塩酸塩10mg／dlおよび炭酸カルシウム４
ｇ／dl（別殺菌）（PH7.0）を500ml容フラスコに
50ml入れ、120℃で15分間殺菌した。 これに上記寒天培地で30℃にて24時間培養した
表−１に示す微生物を一白金耳接種し、30℃で24
時間振盪培養した。この培養液より菌体を遠心分
離により採取し、培養液と同量の生理食塩水で一
回洗浄し、菌体を集めた。 この菌体をＤ−リジン塩酸塩１ｇ／dlおよびピ
リドキサール5¹−リン酸20mg／dlを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH8.0）（終末10ml）に５ｇ／dlにな
る様に添加し、30℃に20時間保持反応した。Ｄ−
リジンがラセミ化されて生成したＬ−リジンの量
をバイオアツセイで測定し、この結果を表−１に
示した。

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１に示した培地からＬ−リジン塩酸塩を
除いた培地に実施例１と同様の寒天培地で培養し
たアルカリゲネス メタルカリゲネス AJ
2543FERM−P7054を１白金耳接種し、30℃で12
時間振盪培養したのち、10ｇ／dlのＤ−リジン塩
酸塩（KOHでPH7.0になる様に中和）溶液を５ml
加えて更に10時間培養した。Ｄ−リジンがラセミ
化されて生成したＬ−リジンをバイオアツセイで
測定した結果0.32ｇ／dlのＬ−リジン塩酸塩が生
成していた。 実施例 ３ 実施例１と同様に培養し、洗浄したフラボバク
テリウム フカツム AJ 2478FERM−P7053の
菌体を、Ｄ−リジン塩酸塩あるいはＬ−リジン塩
酸塩１ｇ／dl、ピリドキサール−5¹−リン酸20
mg／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）（終末
500ml）に５ｇ／dlになる様に添加し、30℃に24
時間保持した。 この反応液中のリジン全量（Ｄ体、Ｌ体の和）
を前述の比色法で測定し、Ｌ−リジンはバイオア
ツセイ法で測定した。この結果を表−２に示し
た。

【表】 これらの反応液より菌体を遠心分離で除き、ダ
イヤイオンSK−IB（カチオン交換樹脂）を用い
て常法通り、処理した。この溶離液よりリジンを
塩酸塩として結晶化し、Ｌ−リジンを基質にした
事は、3.4ｇ、Ｄ−リジンを基質にした時は3.1ｇ
のリジン塩酸塩を得た。これらの結晶の旋光度を
測定したところ、いづれの場合も旋光度０で生成
物はラセミ体である事が判明した。 実施例 ４ 実施例３と同様に培養し、洗浄したアクロモバ
クター ブチリ AJ 2438FERM−P7051の菌体
を生理食塩水に20ｇ／dlになる様に懸濁した菌液
５mlに４％アルギン酸ナトリウム溶液５mlを加え
混合したのち、15ｇ／dl塩化カルシウム溶液に、
この混合液を徐々に滴下し、ビーズ状の固定化菌
体を作成した。この固定化物全量をＤ−リジン塩
酸塩１ｇ／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）
20mlに投入し、30℃に５時間、保持反応させた。
この結果Ｄ−リジンはラセミ化され、反応液中に
は0.36ｇ／dlのＬ−リジン塩酸塩が生成してい
た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｌ−あるいはＤ−リジンをラセミ化する能力
   を有するアルカリゲネス属、エアロモナス属、ア
   ースロバクター属、アクロモバクター属、アグロ
   バクテリウム属、アシネトバクター属、ブレビバ
   クテリウム属、バチルス属、コリネバクテリウム
   属、シトロバクター属、キヤンデイダ属、エンテ
   ロバクター属、エルビニア属、フラボバクテリウ
   ム属、ジオトリクム属、ハフニア属、クルイヘラ
   属、クレブシエラ属、リポミセス属、ミクロコツ
   カス属、ミコプラナ属、ザルチナ属、セラチア
   属、サルモネラ属、トリコスポロン属、トルロプ
   シス属およびビブリオ属に属しＬ−あるいはＤ−
   リジンをラセミ化せしめる能力を有する微生物を
   水性媒体中にてＬ−あるいはＤ−リジンに作用せ
   しめ、ＬあるいはＤ−リジンをラセミ化せしめる
   ことを特徴とする、Ｌ−あるいはＤ−リジンのラ
   セミ化方法。