JPH055475B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明はＬ−あるいはＤ−リジンもしくはア
ルギニンのラセミ化方法に関する。従来、Ｌ−あ
るいはＤ−リジンもしくはアルギニンを酵素的に
ラセミ化する方法は、いくつか知られている。そ
の方法は、シユードモナス属、プロテウス属およ
びエシエリヒア属細菌の生産するリジンラセマー
ゼ（EC.5.1.1.5）を使用する方法、シユードモナ
ス属細菌の生産するアルギニンラセマーゼ
（EC.1.1.9）を使用する方法シユードモナス属細
菌の生産するアミノ酸ラセマーゼ（EC.5.1.1.10）
を使用する方法である（朝倉書店、酵素ハンドブ
ツク、丸尾文治、田宮信雄監修、1982，P728〜
730）。 また本発明者らはリジンをラセミ化する更に優
れた微生物を検索し、フラボバクテリウムに属す
る菌株を見い出した（特願昭58−74615）が、従
来公知の方法と同時に、30℃近辺の中温での反応
である為、リジンを分解する微生物の混入があ
り、基質であるリジンが損失する欠点を有してい
た。 本発明者らは、この様な従来のＬ−あるいはＤ
−リジンのセラミ化法に対し、より効率の良い方
法を見い出すべく研究した結果、フラボバクテリ
ウム属に属する微生物がリジンもしくはアルギニ
ンを分解する微生物が混入増殖する恐れのない高
温条件下でＬ−あるいはＤ−リジンもしくはアル
ギニンのラセミ化する事を見い出し、本研究を完
成するに至つた。 即ち本発明は、Ｌ−あるいはＤ−リジンもしく
はアルギニンをラセミ化せしめる能力を有するフ
ラボバクテリウム属に属する微生物を高温条件下
で水性媒体中にてＬ−あるいはＤ−リジンもしく
はアルギニンに作用せしめ、Ｌ−リジンもしくは
アルギニンのラセミ化せしめることを特徴とす
る、Ｌ−あるいはＤ−リジンもしくはアルギニン
のラセミ化方法に関する。 本発明の微生物は具体的には以下のものがあ
る。フラボバクテリウム フカツム
AJ2478FERM−P7053 本微生物の培養のために用いられる培地は通常
の炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の
培地である。更にビタミン、アミノ酸等の有機微
量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場
合が多い。 炭素源としては、グルコース、シユクロース等
の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、そ
の他が適宜使用される。窒素源としては、アンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その
他が用いられる。無機イオンとしては、マグネシ
ウムイオン、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオ
ン、その他が必要に応じ適宜使用される。 培養は好気的条件下に、PH４ないし８、温度25
ないし40℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし10
日培養を行えば望ましい結果が得られる。 菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、
培養液より分離された菌体、洗浄された菌体な
ど、いづれも使用可能である。菌体処理物として
は凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン、
界面活性剤等と接触せしめた菌体、リゾチームで
処理した菌体、超音波にさらした菌体、機械的に
摩砕した菌体等のほか、これら菌体処理物から得
られた、Ｌ−あるいはＤ−リジンもしくはアルギ
ニンをラセミ化せしめる酵素活性を有する酵素蛋
白区分、更には、これらの菌体の固定化物、菌体
処理物の不溶化物、その他いずれも使用できる。 水溶性媒体としては、水、バツフアーおよびエ
タノール等の有機溶媒を含むものが使用できる。
更に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄養
素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、および金属
イオン等を水性媒体に添加することもできる。 Ｌ−あるいはＤ−リジンもしくはアルギニンと
接触せしめて作用せしめる時には、ＬあるいはＤ
−リジンもしくはアルギニンと培養液、培養菌体
あるいは菌体処理物を溶解またはけん濁した水性
媒体を45℃から75℃の適当な温度に調節し、PHを
４ないし11に保ちつつ、暫時静置または攪拌すれ
ばよい。かくして５ないし100時間も経過すれば
水性媒体中に多量のＬあるいはＤ−リジンのラセ
ミ化物が生成蓄積される。 このようにして得られたＬあるいはＤ−リジン
もしくはアルギニンのラセミ化物を培養液又は水
溶液より採取する方法は、イオン交換樹脂を用い
る方法、等電点にて沈澱せしめる方法等、通常の
方法が採用される。 生成したアミノ酸の定量は濾紙上に展開したア
ミノ酸（溶媒：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝２：
１：１）ニンヒドリンで発色させ、発色部位を50
％エタノールで抽出して570mμで比色する方法お
よびバイオアツセイで測定する方法を用いた。 光学異性体は結晶の比旋光度を測定する事によ
つてＤ，Ｌを定めた。 （実施例 １） グルコース0.5ｇ／dl、硫安0.3ｇ／dl，KH₂
PO₄0.1ｇ／dl，K₂HPO₄0.3ｇ／dl，MgSO₄・
7H₂O0.05ｇ／dl，FeSO₄・7H₂O0.001ｇ／dl，
MnSO₄・4H₂O0.001ｇ／dl、酵母エキス0.5ｇ／
dl、ポリベプトン0.5ｇ／dl、マルツエキス0.5
ｇ／dl、ピリドキシン塩酸塩10mg／dlおよび炭酸
カルシウム４ｇ／dl（別殺菌）（PH7.0）を500ml
容フラスコに50ml入れ、120℃で15分間殺菌した。 これに上記寒天培地で30℃にて24時間培養した
フラボバクテリウムフラツムFERM−P7053を一
白金耳接種し、30℃で24時間振盪培養した。この
培養液より菌体を遠心分離により採取し、培養液
と同量の生理食塩水で一回洗浄し、菌体を集め
た。 この菌体をＤ−リジン塩酸塩３ｇ／dlもしくは
Ｄ−アルギニン塩酸塩１ｇ／dlおよびピリドキサ
ール5′−リン酸20mg／dlを含む0.1Mリン酸緩衝
液（PH8.0）（終末10ml）に１ｇ／dlになる様に添
加し、50℃に１時間保持反応した。尚30℃での結
果を比較の為に併記した。Ｄ−リジンもしくはＤ
−アルギニンがラセミ化されて生成したＬ−リジ
ンもしくはＬ−アルギニンの量をバイオアツセイ
で測定し、この結果を表−１に示した。 同様にして、Ｌ−リジン塩酸塩もしくはＬ−ア
ルギニン塩酸塩を基質として反応を行い、反応液
中の残存リジンもしくはアルギニンの全量（Ｄ
体、Ｌ体の和）を比色法により測定し、これから
バイオアツセイ法で測定したＬ−リジンもしくは
Ｌ−アルギニンの量を差し引くことにより、ラセ
ミ化により生成したＤ−リジンもしくはＤ−アル
ギニンの量を求めた。その結果を表−1′に示し
た。

【表】

【表】 （実施例 ２） 実施例１と同様に培養して洗浄した実施例１の
菌体をＤ−リジン塩酸塩10ｇ／dlおよびピルドキ
サル−5′−リン酸20mg／dlを含む0.1Mリン酸緩
衝液（PH8.0）（終末10ml）に１ｇ／dlになる様に
添加し、表−２に示す各温度で１時間保持反応し
た。Ｄ−リジンがラセミ化されて生成したＬ−リ
ジンの量をバイオアツセイで測定し、この結果を
表−２に示した。

【表】 （実施例 ３） 実施例１と同様に培養し、洗浄したフラボバク
テリウム フカツム AJ2478FERM−P7053の
菌体を、Ｄ−リジン塩酸塩あるいはＬ−リジン塩
酸塩10ｇ／dl、ピリドキサール−5′−リン酸20
mg／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）（終末
100ml）に５ｇ／dlになる様に添加し、50℃に24
時間保持した。 この反応液中のリジン全量（Ｄ体、Ｌ体の和）
を前述の比色法で測定し、Ｌ−リジンはバイオア
ツセイ法で測定した。この結果を表−３に示し
た。

【表】 これらの反応液により菌体を遠心分離で除き、
ダイヤイオンSK−IB（カオチン交換樹脂）を用
いて常法通り、処理した。この培養液よりリジン
を塩酸塩として結晶化し、Ｌ−リジンを基質にし
た時は、2.8ｇ，Ｄ−リジンを基質にした時は2.7
ｇのリジン塩酸塩を得た。これらの結晶の旋光度
を測定したところ、いづれの場合も旋光度０で生
成物はラセミ体である事が判明した。 （実施例 ４） 実施例１と同様に培養し、洗浄した実施例１の
菌体を生理食塩水に20ｇ／dlになる様に懸濁した
菌液５mlに４％アルギン酸ナトリウム溶液５mlを
加え混合したのち、15ｇ／dl塩化カルシウム溶液
に、この混合液を徐々に滴下し、ビーズ状の固定
化菌体を作成した。この固定化物全量をＤ−リジ
ン塩酸塩10ｇ／dlを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）20mlに投入し、50℃に48時間保持反応させ
た。この結果Ｄ−リジンはラセミ化され、反応液
中には4.98ｇ／dlのＬ−リジン塩酸塩が生成して
いた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｌ−あるいはＤ−リジンもしくはアルギニン
   をラセミ化する能力を有するフラボバクテリウム
   属に属する微生物を45℃から75℃の高温下水性媒
   体中にてＬ−あるいはＤ−リジンもしくはアルギ
   ニンに作用せしめ、Ｌ−あるいはＤ−リジンもし
   くはアルギニンをラセミ化せしめることを特徴と
   する、Ｌ−あるいはＤ−リジンもしくはアルギニ
   ンのラセミ化方法。