JPS6214274B2 - - Google Patents
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Description
本発明は固定化微生物の新規調製法に関する。
従来、固定化微生物を調製する方法としては
種々の方法が知られている。例えば、特開昭53−
6483号にはカラギーナンの如き分子構造内に硫酸
基を10W／Ｗ％以上含有する多糖類の水溶液に微
生物菌体を添加、混合し、該混合物中の前記多糖
類をゲル化させることによつて該多糖類のゲル格
子中に前記微生物菌体を包括させて固定化微生物
を調製する方法が開示されている。又、上記公開
公報には上記方法で得られた固定化微生物をグル
タルアルデヒドで処理することによつて該固定化
微生物の酵素活性を安定化させる方法が開示され
ている。しかしながら、微生物菌体をゲル包括
後、グルタルアルデヒドで処理して固定化微生物
の酵素活性の安定化を図る前記方法は、工業的ス
ケールで実施する場合、必ずしも満足しうるもの
ではなかつた。すなわち、前記多糖類のゲルは剪
断力に対して比較的もろいため、グルタルアルデ
ヒド処理の過程でゲルの保形性がそこなわれやす
く、又均一な処理が困難であるという難点があつ
た。 本発明者らは、このような難点を解決すべく
種々検討を重ねた結果、当該多糖類でゲル包括化
したのちグルタルアルデヒド処理する代りに、微
生物の培養終了液の段階でグルタルアルデヒド処
理すれば、酵素活性が高くかつ安定性も優れた固
定化微生物を極めて容易に調製できることを見い
出し、本発明を完成するに至つた。 即ち、本発明は酵素活性を有する微生物の培養
終了液にグルタルアルデヒドを作用させた後、該
培養終了液から微生物菌体を採取し、次いで該微
生物菌体を、分子構造内に硫酸基を10W／Ｗ％以
上含有する多糖類の水溶液に添加、混合し、該混
合液中の前記多糖類をゲル化させることによつて
該多糖類のゲル格子中に前記微生物菌体を包括さ
せることからなる固定化微生物の新規調製法であ
る。 本発明において用いられる微生物としては、目
的とする酵素活性を有する微生物であればいずれ
も使用することができ、かかる微生物としては、
例えばアスパルターゼ活性を有する大腸菌
ATCC11303、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵
素活性を有するシユードモナス・ダクネ−
IAM1152などが好適にあげられる。又、微生物
の培養終了液としては、上記の如き微生物を炭素
源、窒素源、有機栄養物、無機物などを適宜含有
した通常の培地で培養して得られる培養終了液で
あつてもよく、又培養終了後、微生物の有する副
反応系酵素活性を除去処理して得られる培養終了
液であつてもよい。 更に、本発明に用いられる分子構造内に硫酸基
を10W／Ｗ％以上含有する多糖類としては、例え
ばカラギーナン、フアーセレラン、セルロース硫
酸エステル等が挙げられる。カラギーナンは紅藻
類（Rodophyceae）のGigartinaceaeとSolievi−
anceaeに属する海藻から抽出精製された硫酸基
20〜30W／Ｗ％を含有する多糖類であり、例えば
ゲニユーゲルWG（コペンハーゲンペクチンフア
クトリー社製の商品名）、ゲニユーゲルCWG（同
上）、ゲニユービスコ（同上）などが挙げられ
る。又、フアーセレランは紅藻類
（Rodophyceae）の一種Furcellaria fastigiotaか
ら抽出された硫酸基12〜16W／Ｗ％を含有する多
糖類であり、例えばデンマークのリテツクス社で
製造されているフアーセレランが挙げられる。更
に、セルロース硫酸エステルとしては、例えばケ
ルコSCS（ケルコ社製の商品名）が挙げられる。 本発明方法を実施するに当つては、まず微生物
の培養終了液にグルタルアルデヒドを作用させ
る。この処理は微生物の培養終了液にグルタルア
ルデヒドを添加し、振とう又はかく拌することに
よつて容易に実施することができる。グルタルア
ルデヒドの添加量は、培養終了液中のグルタルア
ルデヒドの最終濃度が0.1ｍＭ〜0.5M、好ましく
は１ｍＭ〜0.1Mになるようにするのが好まし
い。上記グルタルアルデヒド処理は０〜60℃、好
ましくは０〜40℃で実施するのが好ましく、処理
時間は処理温度によつても異なるが、通常１分〜
24時間、好ましくは５分〜５時間程度が好まい。
グルタルアルデヒド処理した後の培養終了液は、
例えば遠心分離することにより微生物菌体を採取
することができる。 次に、上記で得られた微生物菌体を分子構造内
に硫酸基を10W／Ｗ％以上含有する多糖類（以
下、単に多糖類と称する。）の水溶液に添加、混
合する。多糖類水溶液の調製は30〜100℃の温水
に多糖類を添加、混合することにより容易に行う
ことができる。多糖類の添加濃度は0.2〜20W／
Ｗ％、とりわけ１〜10W／Ｗ％程度が好ましい。
かくして得られた多糖類水溶液に前記微生物菌体
を添加、混合して混合液を調製する。該混合液調
製するに当つては、前記微生物菌体を水、生理食
塩水或いは適当なPHの緩衝液（PH３〜10、好まし
くはPH４〜８）にけん濁したものを30〜60℃に保
温した多糖類水溶液と混合することによつて行う
のが好ましい。 次に、上記で得られた混合液中の多糖類をゲル
化させて該多糖類のゲル格子中に前記微生物菌体
を包括させる。ゲル化手段としては、前記混合液
を冷却することによつて容易に実施することがで
きる。例えば、前記混合液を約０〜20℃で約１分
〜５時間放置することにより多糖類がゲル化し、
同時に生成した該多糖類のゲル格子中に前記微生
物菌体が包括される。かくして得られたゲルは適
当な形状に成形することができる。 尚、ゲル化手段としては、混合物を冷却する以
外に混合液をアンモニウムイオン又は原子量24以
上の金属イオン（例えば、カリウムイオン、マグ
ネシウムイオン、カルシウムイオンなど）と接触
させるか、混合液を分子構造内に２個以上の塩基
性官能基を有する化合物（例えば、メチレンジア
ミン、エチレンジアミン、Ｐ−フエニレンジアミ
ンなど）と接触させるか、或いは混合液を水と混
合しうる有機溶媒（例えば、アセトン、メタノー
ル、エタノール、プロパノール、ジオキサン、テ
トラヒドロフランなど）と接触させるなどの方法
も採用することができる。 上記の如き微生物の培養終了液の段階でグルタ
ルアルデヒド処理する本発明方法は、微生物菌体
をゲル包括化した後、グルタルアルデヒド処理す
る特開昭53−6483号の方法に較べて下記の如き利
点を有している。すなわち、上記公知方法は、ゲ
ル包括後グルタルアルデヒド処理する為、ゲルの
保形性がそこなわれやすく、又均一な処理が困難
であるという難点があるのに対し、本発明方法は
微生物の培養終了液の段階でグルタルアルデヒド
処理する為、上記公知方法の如き欠点がなく、極
めて簡単な操作でかつ均一なグルタルアルデヒド
処理ができるという利点がある。又、本発明方法
によれば、上記公知方法に較べてより酵素活性の
高い固定化微生物が得られると共に、得られた固
定化微生物を用いて連続酵素反応を行つた場合、
本発明方法で得られる固定化微生物は公知方法で
得られる固定化微生物に較べて高い酵素活性をよ
り長期間維持するという利点がある。 従つて、本発明方法は固定化微生物の調製法と
して工業的に極めて優れた方法である。 以下実験例及び実施例により本発明をさらに詳
細に説明する。 実験例 １ 後記実施例１で調製したアスパルターゼ活性を
有する固定化大腸菌〔本発明の固定化微生物〕、
グルタルアルデヒド処理することなく調製した固
定化大腸菌〔対照固定化微生物(1)〕及びゲル包括
後グルタルアルデヒド処理して調製した固定化大
腸菌〔対照固定化微生物(2)〕を用い、下記方法に
より連続酵素反応を行ない、酵素活性の安定性及
びＬ−アスパラギン酸の生産を調べた。尚、対照
の固定化微生物は下記の如くして調製した。 〔対照固定化微生物(1)の調製〕 培養終了液をグルタルアルデヒド処理しない以
外は実施例１と同様にして固定化大腸菌を得、こ
れを対照固定化微生物(1)とした。 〔対照固定化微生物(2)の調製〕 上記と同様にして調製した固定化大腸菌〔対照
固定化微生物(1)〕10ｇ（湿重量）を５ｍＭグルタ
ルアルデヒドを含む２％塩化カリウム水溶液100
mlにけん濁し、５℃、15分間振とうした後、２％
塩化カリウム水溶液で洗浄した。かくして得られ
た固定化大腸菌を対照固定化微生物(2)とした。 (イ) 実験方法 固定化大腸菌４ｇをそれぞれ外とう管付カラ
ム（内径1.6cm×長さ10.5cm）に充填し、37℃
にて10-3M塩化マグネシウムを含む1Mフマー
ル酸アンモニウム水溶液（アンモニアでPH8.5
に調整）を40ml／hrの速度で昼夜連続して流し
た。流出液を適時サンプリングし、流出液中の
Ｌ−アスパラギン酸量を定量することにより固
定化微生物のアスパルターゼ活性を測定し、固
定化微生物の初期酵素活性が50％低下するのに
要する日数（半減期）を求め、さらに固定化微
生物の持つＬ−アスパラギン酸の生産性を求め
た。尚、流出液中のＬ−アスパラギン酸の定量
はロイコノストツク・メツセンテロイデスＰ−
60を用いるバイオアツセイ法により行なつた。 (2) 結 果 結果は下記第１表の通りであり、本発明に係
る固定化微生物は、対照の固定化微生物に較べ
て高い酵素活性を維持し、Ｌ−アスパラギン酸
の生産性が極めて優れていることが認められ
た。
種々の方法が知られている。例えば、特開昭53−
6483号にはカラギーナンの如き分子構造内に硫酸
基を10W／Ｗ％以上含有する多糖類の水溶液に微
生物菌体を添加、混合し、該混合物中の前記多糖
類をゲル化させることによつて該多糖類のゲル格
子中に前記微生物菌体を包括させて固定化微生物
を調製する方法が開示されている。又、上記公開
公報には上記方法で得られた固定化微生物をグル
タルアルデヒドで処理することによつて該固定化
微生物の酵素活性を安定化させる方法が開示され
ている。しかしながら、微生物菌体をゲル包括
後、グルタルアルデヒドで処理して固定化微生物
の酵素活性の安定化を図る前記方法は、工業的ス
ケールで実施する場合、必ずしも満足しうるもの
ではなかつた。すなわち、前記多糖類のゲルは剪
断力に対して比較的もろいため、グルタルアルデ
ヒド処理の過程でゲルの保形性がそこなわれやす
く、又均一な処理が困難であるという難点があつ
た。 本発明者らは、このような難点を解決すべく
種々検討を重ねた結果、当該多糖類でゲル包括化
したのちグルタルアルデヒド処理する代りに、微
生物の培養終了液の段階でグルタルアルデヒド処
理すれば、酵素活性が高くかつ安定性も優れた固
定化微生物を極めて容易に調製できることを見い
出し、本発明を完成するに至つた。 即ち、本発明は酵素活性を有する微生物の培養
終了液にグルタルアルデヒドを作用させた後、該
培養終了液から微生物菌体を採取し、次いで該微
生物菌体を、分子構造内に硫酸基を10W／Ｗ％以
上含有する多糖類の水溶液に添加、混合し、該混
合液中の前記多糖類をゲル化させることによつて
該多糖類のゲル格子中に前記微生物菌体を包括さ
せることからなる固定化微生物の新規調製法であ
る。 本発明において用いられる微生物としては、目
的とする酵素活性を有する微生物であればいずれ
も使用することができ、かかる微生物としては、
例えばアスパルターゼ活性を有する大腸菌
ATCC11303、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵
素活性を有するシユードモナス・ダクネ−
IAM1152などが好適にあげられる。又、微生物
の培養終了液としては、上記の如き微生物を炭素
源、窒素源、有機栄養物、無機物などを適宜含有
した通常の培地で培養して得られる培養終了液で
あつてもよく、又培養終了後、微生物の有する副
反応系酵素活性を除去処理して得られる培養終了
液であつてもよい。 更に、本発明に用いられる分子構造内に硫酸基
を10W／Ｗ％以上含有する多糖類としては、例え
ばカラギーナン、フアーセレラン、セルロース硫
酸エステル等が挙げられる。カラギーナンは紅藻
類（Rodophyceae）のGigartinaceaeとSolievi−
anceaeに属する海藻から抽出精製された硫酸基
20〜30W／Ｗ％を含有する多糖類であり、例えば
ゲニユーゲルWG（コペンハーゲンペクチンフア
クトリー社製の商品名）、ゲニユーゲルCWG（同
上）、ゲニユービスコ（同上）などが挙げられ
る。又、フアーセレランは紅藻類
（Rodophyceae）の一種Furcellaria fastigiotaか
ら抽出された硫酸基12〜16W／Ｗ％を含有する多
糖類であり、例えばデンマークのリテツクス社で
製造されているフアーセレランが挙げられる。更
に、セルロース硫酸エステルとしては、例えばケ
ルコSCS（ケルコ社製の商品名）が挙げられる。 本発明方法を実施するに当つては、まず微生物
の培養終了液にグルタルアルデヒドを作用させ
る。この処理は微生物の培養終了液にグルタルア
ルデヒドを添加し、振とう又はかく拌することに
よつて容易に実施することができる。グルタルア
ルデヒドの添加量は、培養終了液中のグルタルア
ルデヒドの最終濃度が0.1ｍＭ〜0.5M、好ましく
は１ｍＭ〜0.1Mになるようにするのが好まし
い。上記グルタルアルデヒド処理は０〜60℃、好
ましくは０〜40℃で実施するのが好ましく、処理
時間は処理温度によつても異なるが、通常１分〜
24時間、好ましくは５分〜５時間程度が好まい。
グルタルアルデヒド処理した後の培養終了液は、
例えば遠心分離することにより微生物菌体を採取
することができる。 次に、上記で得られた微生物菌体を分子構造内
に硫酸基を10W／Ｗ％以上含有する多糖類（以
下、単に多糖類と称する。）の水溶液に添加、混
合する。多糖類水溶液の調製は30〜100℃の温水
に多糖類を添加、混合することにより容易に行う
ことができる。多糖類の添加濃度は0.2〜20W／
Ｗ％、とりわけ１〜10W／Ｗ％程度が好ましい。
かくして得られた多糖類水溶液に前記微生物菌体
を添加、混合して混合液を調製する。該混合液調
製するに当つては、前記微生物菌体を水、生理食
塩水或いは適当なPHの緩衝液（PH３〜10、好まし
くはPH４〜８）にけん濁したものを30〜60℃に保
温した多糖類水溶液と混合することによつて行う
のが好ましい。 次に、上記で得られた混合液中の多糖類をゲル
化させて該多糖類のゲル格子中に前記微生物菌体
を包括させる。ゲル化手段としては、前記混合液
を冷却することによつて容易に実施することがで
きる。例えば、前記混合液を約０〜20℃で約１分
〜５時間放置することにより多糖類がゲル化し、
同時に生成した該多糖類のゲル格子中に前記微生
物菌体が包括される。かくして得られたゲルは適
当な形状に成形することができる。 尚、ゲル化手段としては、混合物を冷却する以
外に混合液をアンモニウムイオン又は原子量24以
上の金属イオン（例えば、カリウムイオン、マグ
ネシウムイオン、カルシウムイオンなど）と接触
させるか、混合液を分子構造内に２個以上の塩基
性官能基を有する化合物（例えば、メチレンジア
ミン、エチレンジアミン、Ｐ−フエニレンジアミ
ンなど）と接触させるか、或いは混合液を水と混
合しうる有機溶媒（例えば、アセトン、メタノー
ル、エタノール、プロパノール、ジオキサン、テ
トラヒドロフランなど）と接触させるなどの方法
も採用することができる。 上記の如き微生物の培養終了液の段階でグルタ
ルアルデヒド処理する本発明方法は、微生物菌体
をゲル包括化した後、グルタルアルデヒド処理す
る特開昭53−6483号の方法に較べて下記の如き利
点を有している。すなわち、上記公知方法は、ゲ
ル包括後グルタルアルデヒド処理する為、ゲルの
保形性がそこなわれやすく、又均一な処理が困難
であるという難点があるのに対し、本発明方法は
微生物の培養終了液の段階でグルタルアルデヒド
処理する為、上記公知方法の如き欠点がなく、極
めて簡単な操作でかつ均一なグルタルアルデヒド
処理ができるという利点がある。又、本発明方法
によれば、上記公知方法に較べてより酵素活性の
高い固定化微生物が得られると共に、得られた固
定化微生物を用いて連続酵素反応を行つた場合、
本発明方法で得られる固定化微生物は公知方法で
得られる固定化微生物に較べて高い酵素活性をよ
り長期間維持するという利点がある。 従つて、本発明方法は固定化微生物の調製法と
して工業的に極めて優れた方法である。 以下実験例及び実施例により本発明をさらに詳
細に説明する。 実験例 １ 後記実施例１で調製したアスパルターゼ活性を
有する固定化大腸菌〔本発明の固定化微生物〕、
グルタルアルデヒド処理することなく調製した固
定化大腸菌〔対照固定化微生物(1)〕及びゲル包括
後グルタルアルデヒド処理して調製した固定化大
腸菌〔対照固定化微生物(2)〕を用い、下記方法に
より連続酵素反応を行ない、酵素活性の安定性及
びＬ−アスパラギン酸の生産を調べた。尚、対照
の固定化微生物は下記の如くして調製した。 〔対照固定化微生物(1)の調製〕 培養終了液をグルタルアルデヒド処理しない以
外は実施例１と同様にして固定化大腸菌を得、こ
れを対照固定化微生物(1)とした。 〔対照固定化微生物(2)の調製〕 上記と同様にして調製した固定化大腸菌〔対照
固定化微生物(1)〕10ｇ（湿重量）を５ｍＭグルタ
ルアルデヒドを含む２％塩化カリウム水溶液100
mlにけん濁し、５℃、15分間振とうした後、２％
塩化カリウム水溶液で洗浄した。かくして得られ
た固定化大腸菌を対照固定化微生物(2)とした。 (イ) 実験方法 固定化大腸菌４ｇをそれぞれ外とう管付カラ
ム（内径1.6cm×長さ10.5cm）に充填し、37℃
にて10-3M塩化マグネシウムを含む1Mフマー
ル酸アンモニウム水溶液（アンモニアでPH8.5
に調整）を40ml／hrの速度で昼夜連続して流し
た。流出液を適時サンプリングし、流出液中の
Ｌ−アスパラギン酸量を定量することにより固
定化微生物のアスパルターゼ活性を測定し、固
定化微生物の初期酵素活性が50％低下するのに
要する日数（半減期）を求め、さらに固定化微
生物の持つＬ−アスパラギン酸の生産性を求め
た。尚、流出液中のＬ−アスパラギン酸の定量
はロイコノストツク・メツセンテロイデスＰ−
60を用いるバイオアツセイ法により行なつた。 (2) 結 果 結果は下記第１表の通りであり、本発明に係
る固定化微生物は、対照の固定化微生物に較べ
て高い酵素活性を維持し、Ｌ−アスパラギン酸
の生産性が極めて優れていることが認められ
た。
【表】
培養終了液をグルタルアルデヒド処理しない以
外は実施例２と同様にして固定化シユードモナ
ス・ダクネーIAM1152を得、これを対照固定化
微生物(1)とした。 〔対照固定化微生物(2)の調製〕 上記と同様にして調製した固定化シユードモナ
ス・ダクネーIAM1152〔対照固定化微生物(1)〕
10ｇ（湿重量）に1.67ML−リジン塩酸塩を含む
0.2Mリン酸緩衝液2.0mlを加え、10℃で10分間放
置した後、この溶液に25％グルタルアルデヒド水
溶液13.3mlを加え、10℃で10分間放置し、２％塩
化カリウム水溶液で洗浄した。かくして得られた
固定化シユードモナス・ダクネーIAM1152を対
照固定化微生物(2)とした。 (1) 実験方法 固定化シユードモナス・ダクネーIAM11524
ｇをそれぞれ外とう管付カラム（内径1.6cm×
長さ10.5cm）に充填し、37℃にて10-4Mピリド
キサールリン酸を含む1ML−アスパラギン酸
アンモニウム水溶液（アンモニアでPH5.5に調
製）を18ml／hrの速度で昼夜連続して流した。
流出液を適時サンプリングし、流出液中のＬ−
アラニン量を定量することにより固定化微生物
のＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を測
定し、固定化微生物の初期酵素活性が50％低下
するのに要する日数（半減期）を求め、さらに
固定化微生物の持つＬ−アラニンの生産性を算
出した。尚、流出液中のＬ−アラニンの定量は
ロイコノストツク・チトロボラムATCC8081を
用いるバイオアツセイにより行なつた。 (2) 結 果 結果は下記第２表の通りであり、本発明に係
る固定化微生物は、対照の固定化微生物に較べ
て高い酵素活性を維持し、Ｌ−アラニンの生産
性が極めて優れていることが認められた。
外は実施例２と同様にして固定化シユードモナ
ス・ダクネーIAM1152を得、これを対照固定化
微生物(1)とした。 〔対照固定化微生物(2)の調製〕 上記と同様にして調製した固定化シユードモナ
ス・ダクネーIAM1152〔対照固定化微生物(1)〕
10ｇ（湿重量）に1.67ML−リジン塩酸塩を含む
0.2Mリン酸緩衝液2.0mlを加え、10℃で10分間放
置した後、この溶液に25％グルタルアルデヒド水
溶液13.3mlを加え、10℃で10分間放置し、２％塩
化カリウム水溶液で洗浄した。かくして得られた
固定化シユードモナス・ダクネーIAM1152を対
照固定化微生物(2)とした。 (1) 実験方法 固定化シユードモナス・ダクネーIAM11524
ｇをそれぞれ外とう管付カラム（内径1.6cm×
長さ10.5cm）に充填し、37℃にて10-4Mピリド
キサールリン酸を含む1ML−アスパラギン酸
アンモニウム水溶液（アンモニアでPH5.5に調
製）を18ml／hrの速度で昼夜連続して流した。
流出液を適時サンプリングし、流出液中のＬ−
アラニン量を定量することにより固定化微生物
のＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を測
定し、固定化微生物の初期酵素活性が50％低下
するのに要する日数（半減期）を求め、さらに
固定化微生物の持つＬ−アラニンの生産性を算
出した。尚、流出液中のＬ−アラニンの定量は
ロイコノストツク・チトロボラムATCC8081を
用いるバイオアツセイにより行なつた。 (2) 結 果 結果は下記第２表の通りであり、本発明に係
る固定化微生物は、対照の固定化微生物に較べ
て高い酵素活性を維持し、Ｌ−アラニンの生産
性が極めて優れていることが認められた。
【表】
【表】
実施例 １
コーンスチープリカー２％、ミースト２％、フ
マール酸1.14％、フマール酸ジアンモニウム0.5
％、第１リン酸カリウム0.2％、硫酸マグネシウ
ム0.05％を含む培地（PH7.0）を500ml容坂口フラ
スコ10本に100ml宛分注し、これに大腸菌
ATCC11303を植菌した。30℃で16時間振とう培
養した後、５℃まで冷却し、最終グルタルアルデ
ヒド濃度が５ｍＭとなるように25％グルタルアル
デヒド水溶液を２ml加え30分間振とうした。この
培養終了液を遠心分離することにより大腸菌菌体
23ｇ（湿重量）を集めた。別に、ゲニユーゲル
WG（コペンハーゲン、ペクチンフアクトリー社
製のカラギーナン）６ｇを45℃の温水129mlに溶
解し、カラギーナン水溶液を調製した。この水溶
液に上記で得た大腸菌菌体23ｇを生理的食塩水23
mlにけん濁したものを40℃にて添加、混合した。
この混合液を４℃にて30分間放置し、生成したゲ
ルを１辺約３mmの立方体に成型した。このゲルを
1Mフマール酸ジアンモニウムを含む基質溶液400
ml中に浸漬し、37℃にて48時間放置した後、ゲル
を２％塩化カリウム水溶液で洗浄することにより
固定化大腸菌180ｇ（湿重量）を得た。かくして
得られた固定化大腸菌のアスパルターゼ活性は
48680μmoles／hr／ｇ微生物菌体であつた。 実施例 ２ グルタミン酸ナトリウム3.2％、ミースト0.5
％、第１リン酸カリウム0.05％、硫酸マグネシウ
ム0.01％を含む培地（PH7.3）を500ml容坂口フラ
スコ10本に120ml宛分注し、これにシユードモナ
ス・ダクネーIAM1152を植菌した。30℃で24時
間振とう培養した後、酢酸26mlを加え、PHを4.75
に調整し、30℃で１時間放置した。これに3N−
水酸化ナトリウム86mlを加え、PH6.0に調整した
後、10℃まで冷却し、最終グルタルアルデヒド濃
度が５ｍＭとなるように25％グルタルアルデヒド
水溶液2.6mlを加え、30分間振とうした。この培
養終了液を遠心分離することによりシユードモナ
ス・ダクネーIAM1152菌体20ｇ（湿重量）を集
めた。別に、ゲニユーゲルWG（コペンハーゲ
ン、ペクチンフアクトリー社製のカラギーナン）
4.03ｇを50℃の温水85mlに溶解しカラギーナン水
溶液を調製した。この溶液に上記で得た菌体20ｇ
を生理的食塩水20mlにけん濁したものを45℃にて
添加、混合した。４℃にて30分間放置した後、生
成したゲルを一辺３mmの立方体に成型し、２％塩
化カリウム水溶液で洗浄することにより固定化シ
ユードモナス・ダクネーIAM1152 130ｇ（湿重
量））を得た。かくして得られた固定化シユード
モナス・ダクネーIAM1152のＬ−アスパラギン
酸β−脱炭酸酵素活性は9050μmoles Ｌ−アラ
ニン／hr／ｇ微生物菌体であつた。
マール酸1.14％、フマール酸ジアンモニウム0.5
％、第１リン酸カリウム0.2％、硫酸マグネシウ
ム0.05％を含む培地（PH7.0）を500ml容坂口フラ
スコ10本に100ml宛分注し、これに大腸菌
ATCC11303を植菌した。30℃で16時間振とう培
養した後、５℃まで冷却し、最終グルタルアルデ
ヒド濃度が５ｍＭとなるように25％グルタルアル
デヒド水溶液を２ml加え30分間振とうした。この
培養終了液を遠心分離することにより大腸菌菌体
23ｇ（湿重量）を集めた。別に、ゲニユーゲル
WG（コペンハーゲン、ペクチンフアクトリー社
製のカラギーナン）６ｇを45℃の温水129mlに溶
解し、カラギーナン水溶液を調製した。この水溶
液に上記で得た大腸菌菌体23ｇを生理的食塩水23
mlにけん濁したものを40℃にて添加、混合した。
この混合液を４℃にて30分間放置し、生成したゲ
ルを１辺約３mmの立方体に成型した。このゲルを
1Mフマール酸ジアンモニウムを含む基質溶液400
ml中に浸漬し、37℃にて48時間放置した後、ゲル
を２％塩化カリウム水溶液で洗浄することにより
固定化大腸菌180ｇ（湿重量）を得た。かくして
得られた固定化大腸菌のアスパルターゼ活性は
48680μmoles／hr／ｇ微生物菌体であつた。 実施例 ２ グルタミン酸ナトリウム3.2％、ミースト0.5
％、第１リン酸カリウム0.05％、硫酸マグネシウ
ム0.01％を含む培地（PH7.3）を500ml容坂口フラ
スコ10本に120ml宛分注し、これにシユードモナ
ス・ダクネーIAM1152を植菌した。30℃で24時
間振とう培養した後、酢酸26mlを加え、PHを4.75
に調整し、30℃で１時間放置した。これに3N−
水酸化ナトリウム86mlを加え、PH6.0に調整した
後、10℃まで冷却し、最終グルタルアルデヒド濃
度が５ｍＭとなるように25％グルタルアルデヒド
水溶液2.6mlを加え、30分間振とうした。この培
養終了液を遠心分離することによりシユードモナ
ス・ダクネーIAM1152菌体20ｇ（湿重量）を集
めた。別に、ゲニユーゲルWG（コペンハーゲ
ン、ペクチンフアクトリー社製のカラギーナン）
4.03ｇを50℃の温水85mlに溶解しカラギーナン水
溶液を調製した。この溶液に上記で得た菌体20ｇ
を生理的食塩水20mlにけん濁したものを45℃にて
添加、混合した。４℃にて30分間放置した後、生
成したゲルを一辺３mmの立方体に成型し、２％塩
化カリウム水溶液で洗浄することにより固定化シ
ユードモナス・ダクネーIAM1152 130ｇ（湿重
量））を得た。かくして得られた固定化シユード
モナス・ダクネーIAM1152のＬ−アスパラギン
酸β−脱炭酸酵素活性は9050μmoles Ｌ−アラ
ニン／hr／ｇ微生物菌体であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酵素活性を有する微生物の培養終了液にグル
タルアルデヒドを作用させた後、該培養終了液か
ら微生物菌体を採取し、次いで該微生物菌体を、
分子構造内に硫酸基を10W／Ｗ％以上含有する多
糖類の水溶液に添加、混合し、該混合液中の前記
多糖類をゲル化させることによつて該多糖類のゲ
ル格子中に前記微生物菌体を包括させることを特
徴とする固定化微生物の調製法。 ２ 微生物がアスパルターゼ活性を有する大腸菌
又はＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有
するシユードモナス・ダクネーである特許請求の
範囲第１項記載の調製法。 ３ 分子構造内に硫酸基を10W／Ｗ％以上含有す
る多糖類がカラギーナン、フアーセレラン又はセ
ルロース硫酸エステルである特許請求の範囲第１
項又は第２項記載の調製法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57045457A JPS58162293A (ja) | 1982-03-19 | 1982-03-19 | 固定化微生物の調製法 |
| US06/471,850 US4526867A (en) | 1982-03-19 | 1983-03-03 | Process for preparing immobilized microorganism |
| GB08306231A GB2116997B (en) | 1982-03-19 | 1983-03-07 | Process for preparing immobilized microorganism |
| SE8301406A SE457961B (sv) | 1982-03-19 | 1983-03-15 | Foerfarande foer framstaellning av immobiliserad mikroorganism |
| DE3309271A DE3309271C2 (de) | 1982-03-19 | 1983-03-15 | Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Mikroorganismen |
| FR8304399A FR2523597B1 (fr) | 1982-03-19 | 1983-03-17 | Procede pour la preparation d'un micro-organisme immobilise |
| CH1510/83A CH660199A5 (de) | 1982-03-19 | 1983-03-18 | Verfahren zur herstellung von immobilisierten mikroorganismen. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57045457A JPS58162293A (ja) | 1982-03-19 | 1982-03-19 | 固定化微生物の調製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58162293A JPS58162293A (ja) | 1983-09-26 |
| JPS6214274B2 true JPS6214274B2 (ja) | 1987-04-01 |
Family
ID=12719879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57045457A Granted JPS58162293A (ja) | 1982-03-19 | 1982-03-19 | 固定化微生物の調製法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4526867A (ja) |
| JP (1) | JPS58162293A (ja) |
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