JPH0759582A

JPH0759582A - 固定化微生物によるパラヒドロキシ安息香酸の製造方法

Info

Publication number: JPH0759582A
Application number: JP21127593A
Authority: JP
Inventors: Masaharu Ishikura; 倉正治石; Daizo Takeuchi; 内大造武; Tokio Iizuka; 塚時男飯; Kenichi Uehara; 原健一上
Original assignee: Kawasaki Steel Corp
Current assignee: JFE Steel Corp
Priority date: 1993-08-26
Filing date: 1993-08-26
Publication date: 1995-03-07

Abstract

(57)【要約】【目的】固定化微生物を用いて安定して効率よくパラク
レゾールをパラクレゾールに変換させてパラヒドロキシ
安息香酸を製造する方法を提供する。【構成】パラクレゾールからパラヒドロキシ安息香酸を
生成する能力を有する微生物をゲル状担体に固定化し、
エネルギー源とパラクレゾールを含有する水溶液と接触
反応させるパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ゲル状担体に固定化し
たパラヒドロキシ安息香酸の生成能を有する微生物をパ
ラクレゾールとエネルギー源とを含んだ水溶液と、接触
反応させてパラヒドロキシ安息香酸を製造する方法に関
する。さらに、詳しく述べると、予め培養して得られた
エンテロバクター・クロッカエＩＦＯ１３５３５、シュ
ードモナス・プチダＫＳ−０１６０またはシュードモナ
ス・プチダＫＳ−０１８０の菌体を、アルギン酸、カッ
パ−カラギーナン、ポリアクリルアミドなどのゲル状担
体に包括固定化し、その固定化微生物をパラクレゾール
とエネルギー源とを含んだ水溶液と、接触反応させるパ
ラヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物を用いたパラヒドロキシ安息香酸
の製造方法に関しては、エンテロバクター・クロッカエ
ＩＦＯ１３５３５の培養菌体あるいは休止菌体を用いて
製造する方法（特願平４−１４４３３５号）、シュード
モナス・プチダＫＳ−０１６０の培養菌体あるいは休止
菌体を用いて製造する方法（特願平４−１４５７２９
号）およびシュードモナス・プチダＫＳ−０１８０の培
養菌体あるいは休止菌体を用いて製造する方法（特願平
４−１４５７３０号）が、本発明者らにより提案されて
いるが、この方法では、反応液から菌体を分離するのが
困難であり、回分式または連続式で反応を行うことが難
しかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生
物を用いてパラクレゾールからパラヒドロキシ安息香酸
を製造する方法において、反応液から微生物の菌体を容
易に分離し、回分式または連続式で反応を行う方法を提
供するものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、パラクレ
ゾールからパラヒドロキシ安息香酸を生成するエンテロ
バクター・クロッカエＩＦＯ１３５３５、シュードモナ
ス・プチダＫＳ−０１６０またはシュードモナス・プチ
ダＫＳ−０１６０の培養菌体を、アルギン酸、カッパ−
カラギーナン、ポリアクリルアミドの各種ゲルに包括固
定化し、これを球状またはブロック状に成形し、この成
形物を固定化触媒として、空気あるいは酸素が十分に存
在する状態で、パラクレゾールとエネルギー源とを含有
する水溶液を連続的または間欠的に補給しながら固定化
微生物と接触反応させることにより、パラヒドロキシ安
息香酸が得られることを見いだし、本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、パラクレゾールから
パラヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物
をゲル状担体に固定化し、エネルギー源とパラクレゾー
ルとを含有する水溶液と接触反応させるパラヒドロキシ
安息香酸の製造方法を提供する。パラクレゾールからパ
ラヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物
が、エンテロバクター・クロッカエ（Enterobacter clo
acae) ＩＦＯ１３５３５、シュードモナス・プチダ（Ps
eudomonas putida）ＫＳ−０１６０またはシュードモナ
ス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＳ−０１８０から
なる群から選ばれる少なくとも１つの微生物であるのが
好ましい。そして、ゲル状担体が、アルギン酸、カッパ
−カラギーナンまたはポリアクリルアミドからなる群か
ら選ばれる担体であるのが好ましい。また、エネルギー
源とパラクレゾールを含有する水溶液を連続的または間
欠的に補給しながら前記固定化微生物と接触反応させる
のが好ましい。

【０００６】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
で使用する細菌菌株は、シュードモナス属に属する細
菌、および、エンテロバクター属に属する細菌と同定さ
れる菌株であって、パラクレゾールをパラヒドロキシ安
息香酸に変換する能力のある菌株であればよい。特に、
シュードモナス・プチダ種およびエンテロバクター・ク
ロッカエ種に属する細菌が好ましく、さらに、シュード
モナス・プチダＫＳ−０１６０、シュードモナス・プチ
ダＫＳ−０１８０、エンテロバクター・クロッカエＩＦ
Ｏ１３５３５が、変換能および収率が高い点で好まし
い。また、土壌から単離した菌株で、バージーズ・マニ
ュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Be
rgey's Mannual of Systematic Bacteriology)、Vol.
１，１４１〜１９９（シュードモナス属）および４６５
〜４７１（エンテロバクター属）（１９８４）に記載の
基準により、シュードモナス属、あるいは、エンテロバ
クター属の菌株であると同定した菌株であってもよい。
また微工研などの機関から入手したものであってもよ
い。

【０００７】シュードモナス・プチダＫＳ−０１６０株
は、平成４年３月１７日付で、通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所に、Pseudomonas putida ＫＳ−０
１６０という識別のための表示で寄託・保管されてお
り、その寄託番号は、微工研菌寄第１２８７９号（ＦＥ
ＲＭＰ−１２８７９）である。シュードモナス・プチ
ダＫＳ−０１８０株は、平成４年３月１７日付で、通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、Pseudomona
s putida ＫＳ−０１８０という識別のための表示で寄
託・保管されており、その寄託番号は、微工研菌寄第１
２８８０号（ＦＥＲＭＰ−１２８８０）である。シュ
ードモナス・プチダＫＳ−０１６０株およびシュードモ
ナス・プチダＫＳ−０１８０株の単離・同定は、特願平
４−１４５７２９号および特願平４−１４５７３０号に
記載の通りである。

【０００８】本発明では、微生物シュードモナス属に属
する菌株またはエンテロバクター属に属する菌株を用い
て工業的規模でパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香
酸に酸化することができ、反応液から微生物の菌体を容
易に分離することができるので菌体の回収率が高く、ま
た製造物への菌体培養の培地成分からの不純物の混入も
少ないので簡単な精製工程でパラヒドロキシ安息香酸が
得られる。特に、シュードモナス・プチダＫＳ−０１６
０株、シュードモナス・プチダＫＳ−０１８０株および
エンテロバクター・クロッカエＩＦＯ１３５３５株を用
いて、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に酸化
することができる。

【０００９】本発明の製造方法は、増殖した微生物を包
括固定化する工程およびこの固定化された微生物を利用
してパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換す
る工程を包含する。

【００１０】まず、本発明に用いる細菌菌株を増殖させ
る。この菌株が良好に成育できる培地であれば、いかな
る組成の培地も使用できる。この時に用いる培地は、培
地成分として、適当な炭素源、窒素源および無機塩など
を含有し得る。菌体の培養は、エンテロバクター・クロ
ッカエについては、特願平４−１４５７３０号に記載さ
れている方法、シュードモナス・プチダについては、特
願平４−１４５７２９号および特願平４−１４４３３５
に記載の方法で行うことができる。

【００１１】つぎに、得られた菌体を包括固定化する。
本発明に用いられるゲル状担体は、アルギン酸ナトリウ
ム、カッパ−カラギーナン、ポリアクリルアミド等、通
常に使用される担体であれば、いずれでも用いることが
できる。

【００１２】例えば、アルギン酸は、高分子ナトリウム
塩溶液中に菌体を加えておいて、これを塩化カルシウム
水溶液中でゲル化する、またはビーズ状のゲルを得る。
また、カッパ−カラギーナンは、加温高分子溶液中に菌
体を加えておいて、これを冷塩化カリウム水溶液中でゲ
ル化する、または、ビーズ状のゲルを得る。その１例を
挙げると、エンテロバクター・クロッカエＩＦＯ１３５
３５、シュードモナス・プチダＫＳ−０１６０またはシ
ュードモナス・プチダＫＳ−０１８０にアルギン酸ナト
リウム塩水溶液等を加えて、３０〜４０℃付近で、３０
分程度加温して、塩化カルシウム水溶液中で、ゲル化
し、固定化微生物（菌体）を得ることができる。

【００１３】また、ポリアクリルアミドは、構成するモ
ノマー溶液中に菌体を加え、架橋剤、重合促進剤等を添
加して高分子を合成し、この高分子のゲル中に菌体を包
括させる。担体をゲル状にするために、架橋剤、重合開
始剤、重合促進剤を加えてもよい。架橋剤としては、
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−プ
ロピレンビスアクリルアミド、ジアクリルアミドジメチ
ルエステル等が挙げられる。重合開始剤としては、過硫
酸カリウム、過硫酸アンモニウム等が挙げられる。重合
促進剤としては、ジメチルアミノプロピオニトリル、
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン等
が挙げられる。

【００１４】包括固定化方法は、通常公知の微生物菌体
の固定化法によって行うことができる。担体中の菌体の
濃度は、１〜２０重量％であるのが好ましい。１重量％
未満では、反応効率が悪く、また、２０重量％を超える
と、菌体の漏洩が激しくなるため好ましくない。菌体を
ゲル中に包括固定化すると、ゲルを介して菌体にパラク
レゾールやエネルギー源となる物質が接することが自由
にでき、しかも、菌体が担体から離れることもないの
で、パラヒドロキシ安息香酸の生産性が向上する。

【００１５】次に、得られた固定化菌体を用い、パラク
レゾールとエネルギー源とを含んだ水溶液の存在下で、
パラクレゾールを固定化菌体と接触反応させることによ
り、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換す
ることによりパラヒドロキシ安息香酸を製造する。ここ
で使用する固定化された菌体は、パラクレゾールをパラ
ヒドロキシ安息香酸に変換する触媒として作用し、ゲル
状担体の形状は、球状でも、ブロック状でも、膜状ある
いは線状であってもよい。好ましくは、１〜５ｍｍ角の
ブロック状あるいは球状に成形する。

【００１６】パラクレゾールとエネルギー源とを含有す
る水溶液（以下、パラクレゾールの水溶液とする）は、
変換基質であるパラクレゾールと、反応のエネルギー源
となる物質を含み、菌体の変換作用を維持でき、固定化
菌体を崩壊させない水溶液であればいかなる組成の溶液
であってもよい。生理食塩水、緩衝液等を含有してもよ
い。

【００１７】エネルギー源としては、エンテロバクター
・クロッカエＩＦＯ１３５３５、シュードモナス・プチ
ダＫＳ−０１６０、シュードモナス・プチダＫＳ−０１
８０等が利用できる物質であればいかなるのもでもよい
が、生成したパラヒドロキシ安息香酸の精製のために、
グリセリン、エタノール等のアルコール類、グルコー
ス、フルクトースなどの糖類などのように、単一組成の
ものが好ましい。ｐＨを安定させるために、リン酸緩衝
液等を加えることができる。パラクレゾールの水溶液に
リン酸緩衝液を添加する場合、０．０１〜０．２Ｍであ
るのが好ましい。０．０１Ｍ未満では、ｐＨの安定が得
られず、０．２Ｍを超えると、生成物の分離の際、反応
液を酸性とするのに多量の酸を必要とするため効率が悪
い。

【００１８】固定化菌体とパラクレゾールとの接触反応
は、固定化菌体とパラクレゾールとを反応容器に入れ、
空気または酸素の存在下で行われる。パラクレゾールの
水溶液中のパラクレゾールの含有量は、０．０５〜０．
２重量％であるのが好ましい。０．０５重量％未満で
は、反応効率が悪く、０．２重量％を超えると、変換反
応速度が極端に悪くなるので好ましくない。また、エネ
ルギー源は、パラクレゾールの水溶液中０．０５〜１．
０重量％含有するのが好ましい。０．０５重量％未満で
は、Ｐ−ヒドロキシ安息香酸以降の代謝がはやくなるた
め、収率が低下し、１．０重量％を超えると、変換反応
速度が極端に悪くなるので好ましくない。

【００１９】本発明の製造方法は、回分式で間欠的にパ
ラクレゾールの水溶液を注入しても、また連続式で連続
してパラクレゾールの水溶液を注入しても行うことがで
きる。変換は、反応容器に固定化菌体を入れ、パラクレ
ゾールとエネルギー源とを含有する水溶液を加えて、１
８〜３６℃で、反応が終了するまで任意の時間、振盪す
る。振盪は、往復振盪であっても、回転振盪であっても
よく、５０〜３００ｒｐｍであるのが好ましい。回分式
の場合、１回変換が終了すれば、反応溶液を回収し、さ
らにまた新しいパラクレゾールの水溶液（反応溶液）を
加え、すなわち、反応溶液を間欠的に補給して、何度も
繰り返すことが可能である。本発明の方法では、固定化
菌体を使用するので、反応溶液を回収するのは、短時間
に効率よく回収できる点で優れている。また、連続式の
場合、反応器に固定化菌体、およびパラクレゾールとエ
ネルギー源とを含有する水溶液を添加し反応容器の一方
の口からパラクレゾールとエネルギー源とを含む水溶液
をポンプなどで連続的に注入することで反応溶液を補給
し、また他方の口から注入速度と同じ割合で反応液を回
収する。反応容器は、必要に応じて温度調節を行い、反
応に必要な空気または酸素を送り込む。

【００２０】注入速度は、菌体量、変換反応の進み具合
をみて、適宜調整し、特に限定されない。通気量は、
０．０１〜１であるのが好ましい。本発明の方法によれ
ば、変換反応を連続式に行っても、菌体はゲル中に固定
化されているので、菌体が反応液に混ざることがないた
め、従来の休止菌体、培養菌体を用いる方法と比べて簡
単に反応液と変換用菌体の分離を行なうことが可能で、
反応溶液の注入速度が早すぎることで生じる反応液中の
菌体が流されてでてしまったり、菌体が崩壊するような
現象を起こさないので、煩雑な反応条件の設定を行うこ
となく、安定して大量のパラクレゾールをパラヒドロキ
シ安息香酸に変換することができる。

【００２１】変換反応終了後、生成したパラヒドロキシ
安息香酸の培養液からの分離・精製は、一般の有機化合
物の分離・精製と同様に、溶媒抽出、カラムクロマトグ
ラフィー、中和、濃縮、結晶化等の当業者に周知の手段
を適宜組み合わせることにより行なうことができる。例
えば、反応液を濃縮し、ついで濃縮液を酸性にして、パ
ラヒドロキシ安息香酸を沈殿させて固液分離する方法、
あるいは上清を酸性にした後に、ジエチルエーテル、酢
酸エチル、トルエン、クロロホルムなどの有機溶媒ある
いはこれらの混合溶媒によって抽出するこにより分離す
る方法がある。このようにして得られた組成生物を各種
のクロマトグラフィー、再結晶あるいはこれらを組み合
わせることによって精製することができる。

【００２２】本発明の方法により製造されるパラヒドロ
キシ安息香酸は、医薬・メッキ用光沢剤、染料、香料中
間体、農薬などの原料として有用である。

【００２３】

【実施例】以下、本実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。培地として、下記組成の培地（Ｉ）を使用
した。培地（Ｉ）の組成リン酸水素２ナトリウム３．０ｇリン酸水素１カリウム２．０ｇ塩化アンモニウム２．０ｇ硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ炭酸ナトリウム０．１ｇ塩化カルシウム・２水塩０．０１ｇ硫酸鉄・７水塩０．００５ｇフルクトース２．０ｇ酵母エキス１．０ｇイオン交換水１．０ＬｐＨ６．８（ｐＨ調整後、１２０℃、１．２Ｋｇ／ｃｍ²、２０分
間滅菌して使用）

【００２４】（実施例１）上記培地（Ｉ）５０ｍｌにエ
ンテロバクター・クロッカエＩＦＯ１３５３５株の菌株
を１白金耳を接種し、１夜振盪培養した。培養条件は、
培養温度３０℃、ｐＨ６．８、回転速度１８０ｒｐｍで
あった。得られた培養液の１０ｍｌを、培地（Ｉ）２０
０ｍｌを仕込んだ２Ｌ容フラスコに接種して１日間振盪
培養を行った。培養条件は、３０℃、ｐＨ６．８、回転
速度１８０ｒｐｍであった。得られた培養液を遠心分離
（１００００×Ｇ，２０分間）して集菌、洗浄を行っ
た。得られた湿菌体０．９６ｇを１／１５Ｍリン酸緩衝
液２５ｍｌに懸濁した。この懸濁液をアクリルアミドモ
ノマー２．２５ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルア
ミド０．２５ｇを含有する１／１５Ｍリン酸緩衝液に加
え、十分に混合した。得られた懸濁液に５％β−ジメチ
ルアミノプロピオニトリル５ｍｌを加え、さらに１．０
％過硫酸カリウム４ｍｌを加え十分に混合し、２５℃で
３０分間放置して固定化菌体（ゲル状）を得た。調製さ
れた固定化菌体を５ｍｍ角のブロックに切断したもの
を、０．１重量％のグリセリン、０．１重量％のパラク
レゾールを含有する１／１５Ｍリン酸緩衝液５０ｍｌを
仕込んだ３００ｍｌ容フラスコに加え、３０℃で、２４
時間攪拌した。２４時間ごとに、反応液と固定化菌体を
濾過によって分離し、固定化菌体を回収した。回収した
固定化菌体を用いて３回反応を行った。反応条件は、３
０℃、ｐＨ６．８、１８０ｒｐｍであった。濾過により
固定化菌体を取除いた反応液を回収し、減圧下で２０ｍ
ｌに濃縮し、２０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出を行っ
た。有機層を合わせて濃縮乾固し、各々３０時間の反応
で、それぞれ８ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇのパラヒドロ
キシ安息香酸を得た。（純度は、各々９９％、９９％お
よび９９％、収率は、各々１３％、１９％および２０％
であった。）

【００２５】（実施例２）実施例１と同様にしてエンテ
ロバクター・クロッカエＩＦＯ１３５３５株の菌株を培
養して、湿菌体１．０１ｇを得た。これを５ｍｌの生理
食塩水に懸濁し、４０℃程度に保持しながら、４５℃に
温めてある３．５％カッパ−カラギーナン水溶液６０ｍ
ｌに、この菌体懸濁液を加えて十分に混合した。その
後、４℃の雰囲気下で１時間放冷し、冷却した２％塩化
カリウム水溶液を加えて、３０分間放置して固定化菌体
（ゲル状）を得た。得られた固定化菌体を５ｍｍ角のブ
ロックに切断したものを、０．１重量％のグリセリンと
０．１重量％のパラクレゾールを含有する１／１５Ｍリ
ン酸緩衝液５０ｍｌを仕込んだ３００ｍｌ容四つ口フラ
スコに加え、通気攪拌を行った。反応は、０．１重量％
のグリセリンと０．１重量％のパラクレゾールを含有す
る１／１５Ｍリン酸緩衝液を、５ｍｌ／ｈｒで、フラス
コ内に送り込み、同じ速度で反応液を取り出し、４８時
間反応を行った。反応条件は、３０℃、ｐＨ６．８、回
転速度１８０ｒｐｍ、通気量０．６ｖｖｍであった。回
収された反応液を、減圧下で濃縮し、３０ｍｌの酢酸エ
チルで３回抽出を行った。有機層を合わせて濃縮乾固
し、パラヒドロキシ安息香酸を２１２ｍｇ（純度９９
％）得た。

【００２６】（実施例３）上記培地（Ｉ）５０ｍｌにシ
ュードモナス・プチダＫＳ−０１６０株の菌株を１白金
耳を接種し、１夜振盪培養した。培養条件は、培養温度
３０℃、ｐＨ６．８、回転速度１８０ｒｐｍであった。
得られた培養液の１０ｍｌを、培地（Ｉ）２００ｍｌを
仕込んだ２Ｌ容フラスコに接種して１日間振盪培養を行
った。培養条件は、３０℃、ｐＨ６．８、振盪数１８０
ｒｐｍであった。得られた培養液を遠心分離（１０００
０×Ｇ，２０分間）して集菌、洗浄を行った。得られた
湿菌体１．２０ｇを１／１５Ｍリン酸緩衝液２５ｍｌに
懸濁した。この懸濁液をアクリルアミドモノマー２．２
５ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．２５
ｇを含有する１／１５Ｍリン酸緩衝液に加え、十分に混
合した。得られた懸濁液に５％β−ジメチルアミノプロ
ピオニトリル５ｍｌを加え、さらに１．０％過硫酸カリ
ウム４ｍｌを加え十分に混合し、２５℃で３０分間放置
して固定化菌体（ゲル状）を得た。調製された固定化菌
体を５ｍｍ角のブロックに切断したものを、０．１重量
％のグリセリン、０．１重量％のパラクレゾールを含有
する１／１５Ｍリン酸緩衝液５０ｍｌを仕込んだ３００
ｍｌ容フラスコに加え、３０℃で、２４時間攪拌した。
２４時間ごとに、反応液と固定化菌体を濾過によって分
離し、固定化菌体を回収した。回収した固定化菌体を用
いて３回反応を行った。反応条件は、３０℃、ｐＨ６．
８、１８０ｒｐｍであった。濾過により固定化菌体を取
除いた反応液を回収し、減圧下で２０ｍｌに濃縮し、２
０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出を行った。有機層を合わ
せて濃縮乾固し、各々２４時間の反応で、それぞれ１０
ｍｇ、１９ｍｇ、１７ｍｇのパラヒドロキシ安息香酸を
得た。（純度は、各々９９％、９９％および９９％であ
った。）

【００２７】（実施例４）実施例３と同様にしてシュー
ドモナス・プチダＫＳ−０１６０株の菌株を培養して、
湿菌体１．２３ｇを得た。これを５ｍｌの生理食塩水に
懸濁し、４０℃程度に保持しながら、４５℃に温めてあ
る３．５％カッパ−カラギーナン水溶液６０ｍｌに、こ
の菌体懸濁液を加えて十分に混合した。その後、４℃の
雰囲気下で１時間放冷し、冷却した２％塩化カリウム水
溶液を加えて、３０分間放置して固定化菌体（ゲル状）
を得た。調製された固定化菌体を５ｍｍ角のブロックに
切断したものを、０．１重量％のグリセリンと０．１重
量％のパラクレゾールを含有する１／１５Ｍリン酸緩衝
液５０ｍｌを仕込んだ３００ｍｌ容四つ口フラスコに加
え、通気攪拌を行った。反応は、０．１重量％のグリセ
リンと０．１重量％のパラクレゾールを含有する１／１
５Ｍリン酸緩衝液を、１０ｍｌ／ｈｒで、フラスコ内に
送り込み、同じ速度で反応液を取り出し、２４時間反応
を行った。反応条件は、３０℃、ｐＨ６．８、回転速度
１８０ｒｐｍ、通気量０．６ｖｖｍであった。回収され
た反応液を、減圧下で濃縮し、３０ｍｌの酢酸エチルで
３回抽出を行った。有機層を合わせて濃縮乾固し、パラ
ヒドロキシ安息香酸を２２５ｍｇ（純度９９％）得た。

【００２８】（実施例５）上記培地（Ｉ）５０ｍｌにシ
ュードモナス・プチダＫＳ−０１８０株の菌株を１白金
耳を接種し、１夜振盪培養した。培養条件は、培養温度
３０℃、ｐＨ６．８、回転速度１８０ｒｐｍであった。
得られた培養液の１０ｍｌを、培地（Ｉ）２００ｍｌを
仕込んだ２Ｌ容フラスコに接種して１日間振盪培養を行
った。培養条件は、３０℃、ｐＨ６．８、回転速度１８
０ｒｐｍであった。得られた培養液を遠心分離（１００
００×Ｇ，２０分間）し集菌、洗浄を行った。得られた
湿菌体１．０６ｇを１／１５Ｍリン酸緩衝液２５ｍｌに
懸濁した。この懸濁液をアクリルアミドモノマー２．２
５ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．２５
ｇを含有する１／１５Ｍリン酸緩衝液に加え、十分に混
合した。得られた懸濁液に５％β−ジメチルアミノプロ
ピオニトリル５ｍｌを加え、さらに１．０％過硫酸カリ
ウム４ｍｌを加え十分に混合し、２５℃で３０分間放置
して固定化菌体（ゲル状）を得た。調製された固定化菌
体を５ｍｍ角のブロックに切断したものを、０．１重量
％のグリセリン、０．１重量％のパラクレゾールを含有
する１／１５Ｍリン酸緩衝液５０ｍｌを仕込んだ３００
ｍｌ容フラスコに加え、３０℃で、２４時間攪拌した。
２４時間ごとに、反応液と固定化菌体を濾過によって分
離し、固定化菌体を回収した。回収した固定化菌体を用
いて３回反応を行った。反応条件は、３０℃、ｐＨ６．
８、１８０ｒｐｍであった。濾過により固定化菌体を取
除いた反応液を回収し、減圧下で２０ｍｌに濃縮し、２
０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出を行った。有機層を合わ
せて濃縮乾固し、各々２４時間の反応で、それぞれ１１
ｍｇ、２１ｍｇ、２１ｍｇのパラヒドロキシ安息香酸を
得た。（純度は、各々９９％、９９％および９９％であ
った。）

【００２９】（実施例６）実施例５と同様にしてシュー
ドモナス・プチダＫＳ−０１６０株の菌株を培養して、
湿菌体１．００ｇを得た。これを５ｍｌの生理食塩水に
懸濁し、４０℃程度に保持しながら、４５℃に温めてあ
る３．５％カッパ−カラギーナン水溶液６０ｍｌに、こ
の菌体懸濁液を加えて十分に混合した。その後、４℃の
雰囲気下で１時間放冷し、冷却した２％塩化カリウム水
溶液を加えて、３０分間放置して固定化菌体（ゲル状）
を得た。調製された固定化菌体を５ｍｍ角のブロックに
切断したものを、０．１重量％のグリセリンと０．１重
量％のパラクレゾールを含有する１／１５Ｍリン酸緩衝
液５０ｍｌを仕込んだ３００ｍｌ容四つ口フラスコに加
え、通気攪拌を行った。反応は、０．１重量％のグリセ
リンと０．１重量％のパラクレゾールを含有する１／１
５Ｍリン酸緩衝液を、１０ｍｌ／ｈｒで、フラスコ内に
送り込み、同じ速度で反応液を取り出し、２４時間反応
を行った。反応条件は、３０℃、ｐＨ６．８、回転速度
１８０ｒｐｍ、通気量０．６ｖｖｍであった。回収され
た反応液を、減圧下で濃縮し、３０ｍｌの酢酸エチルで
３回抽出を行った。有機層を合わせて濃縮乾固し、パラ
ヒドロキシ安息香酸を２７０ｍｇ（純度９９％）得た。

【００３０】

【発明の効果】本発明の方法により、微生物を用いてパ
ラクレゾールからパラヒドロキシ安息香酸を製造する方
法において、反応液からの微生物菌体の分離を容易に
し、回分式または連続式で反応を行い、パラヒドロキシ
安息香酸を煩雑な操作をしないで安定して製造すること
ができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:40） (72)発明者飯塚時男千葉県千葉市中央区川崎町１番地川崎製鉄株式会社技術研究本部内 (72)発明者上原健一千葉県千葉市中央区川崎町１番地川崎製鉄株式会社技術研究本部内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】パラクレゾールからパラヒドロキシ安息香
酸を生成する能力を有する微生物をゲル状担体に固定化
し、エネルギー源とパラクレゾールとを含有する水溶液
と接触反応させることを特徴とするパラヒドロキシ安息
香酸の製造方法。
【請求項２】前記パラクレゾールからパラヒドロキシ安
息香酸を生成する能力を有する微生物が、エンテロバク
ター・クロッカエ（Enterobacter cloacae) ＩＦＯ１３
５３５、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putid
a）ＫＳ−０１６０またはシュードモナス・プチダ（Pse
udomonas putida）ＫＳ−０１８０からなる群から選ば
れる少なくとも１つの微生物である請求項１に記載のパ
ラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項３】前記ゲル状担体が、アルギン酸、カッパ−
カラギーナンまたはポリアクリルアミドからなる群から
選ばれるいずれかの担体である請求項１または２に記載
のパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項４】前記エネルギー源とパラクレゾールとを含
有する水溶液を連続的または間欠的に補給しながら前記
固定化微生物と接触反応させる請求項１または２に記載
のパラヒドロキシ安息香酸の製造方法。