JPS6225039B2 - - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、L−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
活性を有する固定化微生物を用いてL−アラニン
を単独で、あるいはL−アラニンとD−アスパラ
ギン酸とを同時に製造する方法に関する。 L−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素はL−アス
パラギン酸のみに作用してL−アラニンと炭酸ガ
スとを生成する反応を触媒する酵素である。 従来、上記L−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
を利用するL−アラニンの製造法としては、L−
アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生
物を基質であるL−アスパラギン酸またはその塩
含有培地に培養する方法や該微生物の生産した酵
素を基質に作用させる方法等多数知られている。
しかしながらL−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
は至適PH域が酸性側にあるため、従来公知の方法
において、基質としてL−アスパラギン酸アンモ
ニウムを用いるとき反応の進行にともなつて副生
するアンモニウムイオンによつて反応液の液性が
アルカリ性側に移行し、その結果酵素活性が低下
し、更に反応速度も低下してくるという当該酵素
の性質上避けられない問題があり、現在までにか
かる点について充分満足のいく解決策は報告され
ていない。 上記に対し、本発明者等は種々研究を重ねた結
果、分子構造内に硫酸基を10w/w%以上有する
多糖類(以下、単に多糖類という)の水溶液にL
−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微
生物を添加混合したのち、該混合液をゲル化し、
生成したゲルにジアミノ脂肪族カルボン酸および
脂肪族ジアルデヒドを順次作用させれば、連続酵
素反応に際して酵素活性が一層安定であり、また
基質としてL−アスパラギン酸アンモニウムを用
いた場合にも反応速度の低下が少なくその半減期
も大巾に延長された固定化微生物を調製し得るこ
とを見出した。 かかる知見に基づく本発明によれば、L−アラ
ニンは、上記により調製した固定化微生物にL−
アスパラギン酸またはその塩を作用させることに
より製造することが出来、またL−アラニンおよ
びD−アスパラギン酸は、上記固定化微生物に
DL−アスパラギン酸またはその塩を作用させ、
ついで必要とあれば反応生成物からL−アラニン
とD−アスパラギン酸とを分離採取することによ
り製造することが出来る。 本発明において多糖類としては、分子構造内に
硫酸基を10w/w%以上有するものがあげられ
る。かかる多糖類の具体例としては、例えばカラ
ギーナン、フアーセレラン、セルロース硫酸エス
テル等が好適にあげられる。カラギーナンは紅藻
類(Rodophy ceae)のGigartina ceaeと
Solierrian ceaeに属する海藻から抽出精製された
硫酸基20〜30w/w%を含有する多糖類であり、
例えばゲニユーゲルWG(コペンハーゲンペクチ
ンフアクトリー社製の商品名)、ゲニユーゲル
CWG(同上)、ゲニユビスコJ(同上)等があげ
られる。またフアーセレランは紅藻類の一種、
Fur cellaria fastigiotaから抽出精製された硫酸
基12〜16w/w%を含有する多糖類であり、例え
ばデンマークのリテツクス社で製造されているフ
アーセレランがあげられる。更にセルロース硫酸
エステルとしては、例えばケルコSCS(ケルコ社
製の商品名)があげられる。 一方、本発明では、L−アスパラギン酸β−脱
炭酸酵素活性を有する微生物であればいずれも用
いることが出来、かかる微生物としては、例えば
シユードモナス・ダクネーIAM1152、アセトバ
クター・ランセンスOUT8300、アクロモバクタ
ー・ペスチフアーIAM1446、同ATCC23584、ア
ルカリゲネス・フエーカリスATCC25094号等が
好適にあげられる。 本発明方法において使用する固定化微生物の調
製にあたり、まず多糖類の水溶液に微生物を添加
混合した混合液のゲル化は、例えば該混合液を冷
却する方法あるいは前記特開昭53−6483号および
同54−11292号公報に記載された方法等の公知の
方法によつて実施することが出来る。例えば冷却
によりゲル化させる場合は、30〜90℃の温水に多
糖類をその濃度が約0.05〜20w/w%、好ましく
は0.4〜10w/w%となるように溶解して多糖類
の水溶液を得、この水溶液に微生物を水、生理的
食塩水または緩衝液(例えばPH約5〜9のリン酸
緩衝液等)にけん濁したものを添加混合し、つい
でこの混合液を約0〜10℃で約0.5〜4時間放置
することにより実施される。また例えば特開昭53
−6483号および同54−11292号方法による場合
は、上記により得た混合液をアンモニウムイオン
もしくは原子量24以上の金属イオン(例えばアル
カリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アル
ミニウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン等)
と接触させるか、分子構造内に2個以上の塩基性
官能基を有する化合物(例えばアルキレンジアミ
ン、芳香族ジアミン、アミノ酸ハイドロキサメイ
ト等)と接触させるか、あるいは水と混合し得る
有機溶媒(例えば低級アルカノン、低級アルカノ
ール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチ
ルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレ
ングリコール等)と接触させることにより実施さ
れる。 上記により得られたゲルにジアミノ脂肪族カル
ボン酸を作用させるには、まずジアミノ脂肪族カ
ルボン酸を適当な溶媒に溶解し、この溶液に上記
ゲルを浸漬させて実施するとよい。適当な溶媒と
しては、例えば水、リン酸緩衝液(PH約5〜9)
等が適当である。ジアミノ脂肪族カルボン酸とし
ては、例えばα,β−ジアミノプロピオン酸、
α,γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、リジン、β
−リジン等があげられるが、とりわけオルニチ
ン、リジン等の炭素数4乃至6個を有するα,ω
−ジアミノ脂肪族カルボン酸が好適に用いられ
る。これら化合物は光学活性体であつても、光学
的に不活性なラセミ体であつてもよく、また例え
ば塩酸塩等の鉱酸塩であつてもよい。また該化合
物の溶液にゲルを浸漬させるに際してその濃度は
約0.1〜3モル濃度、とりわけ0.2〜2モル濃度が
好ましく、他方の浸漬させるゲルは立方体状(1
辺約3mm程度)、球状(径約3mm程度)、繊維状
(径約1mm程度)、膜状あるいは板状等の適当な形
状に成型すれば浸漬処理を効率よく実施すること
が出来るので好ましい。作用温度は、通常0〜30
℃、とりわけ10℃付近が適当である。続いて上記
浸漬処理したゲルに脂肪族ジアルデヒドを作用さ
せるには、該脂肪族ジアルデヒドの溶液にゲルを
浸漬することにより実施するとよい。使用される
溶媒としては上記同様に水、リン酸緩衝液等が適
宜使用される。脂肪族ジアルデヒドとしては、例
えばグルタルアルデヒド、グルオキサール等の炭
素数2乃至5個を有するものがあげられ、とりわ
けグルタルアルデヒドが好適に使用される。また
脂肪族ジアルデヒドの濃度は約0.05〜5モル濃
度、とりわけ0.1〜2.5モル濃度が好ましい。作用
温度は30℃以下、とりわけ0〜15℃付近が、また
PHは4〜11、とりわけ5〜10付近がそれぞれ好ま
しい。 またジアミノ脂肪族カルボン酸または脂肪族ジ
アルデヒドの溶液に対する浸漬処理は、上記の如
く段階的に行なうことを出来るが、例えばジアミ
ノ脂肪族カルボン酸の溶液にゲルを浸漬し、つい
でこの溶液に脂肪族ジアルデヒドの溶液を加える
如き同一条件で連続操作により一挙に行なうこと
も出来る。 かくして得られた固定化微生物はL−アスパラ
ギン酸またはその塩を作用させるとL−アラニン
が得られ、またDL−アスパラギン酸またはその
塩を作用させるとL−アラニンとD−アスパラギ
ン酸が得られる。ここでL−アスパラギン酸また
はDL−アスパラギン酸の塩としては、例えばそ
れらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、アンモニウム塩等が好ましい。 酵素反応は、0〜50℃の広い温度範囲で実施す
ることが出来るが、固定化微生物の酵素の安定性
を考慮して30〜40℃で実施するのが好ましい。
尚、上記酵素反応に際しては基質溶液にピリドキ
サールリン酸、ケト酸(例えばピルビン酸、α−
ケトグルタール酸等)等を適宜添加することによ
り該酵素反応を一層促進させることが出来、また
更にコバルトイオン、ニツケルイオン等の2価金
属イオンを添加すると固定化微生物の酵素活性の
安定性を高めることが出来る。また、この酵素反
応は使用する固定化微生物が水に不溶性であるた
め、バツチ法によるのみならずカラム法によつて
連続的に実施することが出来る。 例えばカラム法による場合、該固定化微生物を
カラムに充填し、このカラムにL−アスパラギン
酸、DL−アスパラギン酸またはそれらの塩を有
する溶液を適当な速度で導通すればL−アラニン
のみ、あるいはL−アラニンとD−アスパラギン
酸とを含む流出液が得られる。なおこの場合、酵
素反応により生成する炭酸ガスのカラム内への滞
留を避けるため基質溶液はカラム下部より上部に
向けて流すのが好ましい。またバツチ法による場
合、該固定化微生物は上記基質溶液にけん濁し、
かく拌する如き方法によりL−アラニンのみある
いはL−アラニンとD−アスパラギン酸とを含む
反応液が得られる。この場合には反応終了液から
固定化微生物をろ過あるいは遠心分離する如き方
法により取得すれば再びこれを反覆使用すること
が出来る。 これらの方法において、基質としてDL−アス
パラギン酸またはその塩を用いる場合L−アラニ
ンとD−アスパラギン酸とを含む溶液が得られる
が、これらの両者は例えば直接晶析法、イオン交
換樹脂処理等の公知の単離精製操作を適宜組合せ
ることにより容易に分離採取することが出来る。 本発明方法を実施するにあたつては反応進行率
は固定化微生物の量、温度、反応時間、基質の流
速その他により影響される。例えばカラム法によ
る場合は使用する固定化微生物の量に従い基質溶
液の導通速度を、またバツチ法による場合はその
反応時間を適当に調整することにより反応進行率
を100%にまで高める至適条件を見出すことも容
易である。 実施例 1 (1) 固定化微生物の調製: グルタミン酸ナトリウム3.2%、ミースト0.5
%、第一リン酸カリウム0.05%、硫酸マグネシウ
ム0.01%を含む培地(PH7.3)を500ml容坂口フラ
スコ10本に120ml宛分注し、これらにシユードモ
ナス・ダクネーIAM1152を植菌する。30℃で24
時間振とう培養したのち、遠心分離することによ
り、シユードモナス・ダクネー菌体20g(湿重
量)を集めた。 別に、ゲニユールゲルWG(商品名、コペンハ
ーゲンペクチンフアクトリー社製のカラギーナ
ン、以下同)4.03gを50℃の温水85mlに溶解し、
カラギーナン水溶液を調製した。この溶液に、上
記で得たシユードモナス・ダクネーの菌体20gを
生理的食塩水20mlにけん濁したものを45℃にて添
加混合した。4℃にて30分間放置したのち、生成
したゲルを一辺約3mmの立方体に成型した。この
ゲルに16.7ML−リジン塩酸塩を含む0.2Mリン酸
緩衝液260mlを加え、10℃で10分間放置した。こ
の溶液に25%グルタルアルデヒド水溶液173mlを
加え、10℃で10分間放置した、接触処理後ゲルを
ロ取し、2%塩化カリウム水溶液で洗浄すること
により、L−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性
を有する固定化シユードモナス・ダクネー130g
(湿重量)を得た。 (2) L−アラニンの調製: 上記(1)で得た固定化シユードモナス・ダクネー
40gを外とう管付カラム(内径1.6cm×長さ19
cm)に充填し、37℃にて10-4Mピリドキサールリ
ン酸を含む1ML−アスパラギン酸アンモニウム
溶液(アンモニアにてPH5.5に調整)500mlをカラ
ム下部より上方に向つて15ml/hrの流速で導通し
た。流出液500mlを全量150mlになるまで濃縮し、
エタノール150mlを加えた。析出晶をロ取し、冷
メタノール30mlで洗浄することにより、L−アラ
ニン40.2gを得た。 m.p. 297℃(分解) 〔α〕23 D+14.4℃(C=6.46,1N−HC1) 実施例 2 実施例1(1)と同様にして得た固定化微生物40g
を外とう管付カラム(内径1.6cm×長さ19cm)に
充填し、37℃にて10-4Mピリドキサールリン酸を
含む1MDL−アスパラギン酸アンモニウム水溶液
(アンモニアでPH5.5に調整)500mlをカラム下端
より上方に向つて20ml/hrの流速で導通した。流
出液500mlを100mlにまで濃縮し、PH3.0に調整す
る。析出晶をロ取し、冷水で洗浄することによ
り、D−アスパラギン酸30.4gを得た。 〔α〕25 D−24.9°(C=2,5N−HC1) D−アスパラギン酸をロ取したロ液をアンバー
ライトIR4B(OH-型)樹脂カラムに導通する。
流出液を減圧濃縮し、エタノールを加えることに
より、L−アラニン18.4gを得た。 m.p. 297℃(分解) 〔α〕23 D+14.4゜(C=6.46,1N−HC1) 実施例 3 (1) 固定化微生物の調製: 実施例1(1)と同様にして得た一辺約3mmの立方
体ゲル約130gに、1.25ML−オルニチン塩酸塩を
含む0.2Mリン酸緩衝液260mlを加え、10℃で10分
間放置した、この溶液に25%グルタルアルデヒド
水溶液65mlを加え、10℃で30分間放置した。接触
処理後ゲルをロ取し、2%塩化カリウム水溶液で
洗浄することにより、L−アスパラギン酸β−脱
炭酸酵素活性を有する固定化シユードモナス・ダ
クネー130g(湿重量)を得た。 (2) L−アラニンの調製: 上記(1)で得た固定化シユードモナス・ダクネー
40gを外とう管付カラム(内径1.6cm×長さ19
cm)に充填し、37℃にて10-4Mピリドキサールリ
ン酸を含む1ML−アスパラギン酸アンモニウム
溶液(アンモニアにてPH5.5に調整)500mlをカラ
ム下部より上方に向つて15ml/hrの流速で導通し
た。流出液500mlを全量150mlになるまで濃縮し、
エタノール150mlを加えた。析出晶をロ取し、冷
メタノール3mlで洗浄することにより、L−アラ
ニン40.1gを得た。 m.p. 297℃(分解) 〔α〕23 D+14.4(C=6.46,1N−HC1) 実験例 1 実施例1(1)で調製した固定化微生物と対照の固
定化微生物を用いて連続酵素反応を実施し、それ
ら固定化微生物の酵素活性が半減するまでの期間
を調べた。尚、対照の固定化微生物は下記により
調製した。 (対照の固定微生物(1)の調製) ゲニユールゲルWG1.0gを50℃の温水20mlに溶
解した。この溶液にシユードモナス・ダクネー
IAM1152の菌体5gを生理的食塩水5mlにけん
濁したものを37℃にて添加混合する。この混合液
に1Mヘキサメチレンジアミン水溶液(PH7.0)1
mlを添加混合し、4℃にて30分間放置した。生成
したゲルを約3mmの立方体に成型し、これに1%
グルタルアルデヒドを含む2%塩化アンモニウム
水溶液50mlを加えて0℃で15分間硬化処理した。
このゲルをロ取し1%塩化アンモニウム水溶液で
洗浄することにより、対照の固定化シユードモナ
ス・ダクネー31g(湿重量)を得た。 (対照の固定化微生物(2)の調製) ゲニユーゲルWG1.0gを50℃の温水20mlに溶解
した、この溶解にシユードモナス・ダクネー
IAM1152の菌体5gを生理的食塩水5mlにけん
濁したものを37℃で添加混合した。この混合液を
4℃で30分間放置し、生成したゲルを1辺3mmの
立方体に成型することにより、対照の固定化シユ
ードモナス・ダクネー31g(湿重量)を得た。 (実験方法) 固定化シユードモナス・ダクネー4gを外とう
管付カラム(内径1.6cm×長さ10.5cm)に充填
し、37℃にて10-4Mピリドキサールリン酸を含む
1ML−アスパラギン酸アンモニウム水溶液(ア
ンモニアでPH5.5に調整)を18ml/hrの速度で昼
夜連続してカラムの下端から上方に向つて流し、
流出液中のL−アラニンの生成率を求め、また固
定化微生物の初期酵素活性が50%低下するのに要
する日数を測定した。 尚、流出液中のL−アラニンの定量はロイコノ
ストツク・チトロボラムATCC8081を用いるバイ
オアツセイにより行ない、酵素活性が50%低下す
るのに要する日数は下記式により算出した(以下
同)。 kd=2.303/tlogno/n t1/2=0.693/kd 〔但し kd;劣化速度定数(1/日) t;反応時間(日) no;初期酵素活性 n;t日後の酵素活性 t1/2;半減期(日)〕 (結果) 第1表および第1図に示す通りであり、本発明
方法で使用する固定化微生物は、高い酵素活性を
維持し、酵素活性の半減期も大巾に延長されるも
のであることが認められた。
活性を有する固定化微生物を用いてL−アラニン
を単独で、あるいはL−アラニンとD−アスパラ
ギン酸とを同時に製造する方法に関する。 L−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素はL−アス
パラギン酸のみに作用してL−アラニンと炭酸ガ
スとを生成する反応を触媒する酵素である。 従来、上記L−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
を利用するL−アラニンの製造法としては、L−
アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生
物を基質であるL−アスパラギン酸またはその塩
含有培地に培養する方法や該微生物の生産した酵
素を基質に作用させる方法等多数知られている。
しかしながらL−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素
は至適PH域が酸性側にあるため、従来公知の方法
において、基質としてL−アスパラギン酸アンモ
ニウムを用いるとき反応の進行にともなつて副生
するアンモニウムイオンによつて反応液の液性が
アルカリ性側に移行し、その結果酵素活性が低下
し、更に反応速度も低下してくるという当該酵素
の性質上避けられない問題があり、現在までにか
かる点について充分満足のいく解決策は報告され
ていない。 上記に対し、本発明者等は種々研究を重ねた結
果、分子構造内に硫酸基を10w/w%以上有する
多糖類(以下、単に多糖類という)の水溶液にL
−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微
生物を添加混合したのち、該混合液をゲル化し、
生成したゲルにジアミノ脂肪族カルボン酸および
脂肪族ジアルデヒドを順次作用させれば、連続酵
素反応に際して酵素活性が一層安定であり、また
基質としてL−アスパラギン酸アンモニウムを用
いた場合にも反応速度の低下が少なくその半減期
も大巾に延長された固定化微生物を調製し得るこ
とを見出した。 かかる知見に基づく本発明によれば、L−アラ
ニンは、上記により調製した固定化微生物にL−
アスパラギン酸またはその塩を作用させることに
より製造することが出来、またL−アラニンおよ
びD−アスパラギン酸は、上記固定化微生物に
DL−アスパラギン酸またはその塩を作用させ、
ついで必要とあれば反応生成物からL−アラニン
とD−アスパラギン酸とを分離採取することによ
り製造することが出来る。 本発明において多糖類としては、分子構造内に
硫酸基を10w/w%以上有するものがあげられ
る。かかる多糖類の具体例としては、例えばカラ
ギーナン、フアーセレラン、セルロース硫酸エス
テル等が好適にあげられる。カラギーナンは紅藻
類(Rodophy ceae)のGigartina ceaeと
Solierrian ceaeに属する海藻から抽出精製された
硫酸基20〜30w/w%を含有する多糖類であり、
例えばゲニユーゲルWG(コペンハーゲンペクチ
ンフアクトリー社製の商品名)、ゲニユーゲル
CWG(同上)、ゲニユビスコJ(同上)等があげ
られる。またフアーセレランは紅藻類の一種、
Fur cellaria fastigiotaから抽出精製された硫酸
基12〜16w/w%を含有する多糖類であり、例え
ばデンマークのリテツクス社で製造されているフ
アーセレランがあげられる。更にセルロース硫酸
エステルとしては、例えばケルコSCS(ケルコ社
製の商品名)があげられる。 一方、本発明では、L−アスパラギン酸β−脱
炭酸酵素活性を有する微生物であればいずれも用
いることが出来、かかる微生物としては、例えば
シユードモナス・ダクネーIAM1152、アセトバ
クター・ランセンスOUT8300、アクロモバクタ
ー・ペスチフアーIAM1446、同ATCC23584、ア
ルカリゲネス・フエーカリスATCC25094号等が
好適にあげられる。 本発明方法において使用する固定化微生物の調
製にあたり、まず多糖類の水溶液に微生物を添加
混合した混合液のゲル化は、例えば該混合液を冷
却する方法あるいは前記特開昭53−6483号および
同54−11292号公報に記載された方法等の公知の
方法によつて実施することが出来る。例えば冷却
によりゲル化させる場合は、30〜90℃の温水に多
糖類をその濃度が約0.05〜20w/w%、好ましく
は0.4〜10w/w%となるように溶解して多糖類
の水溶液を得、この水溶液に微生物を水、生理的
食塩水または緩衝液(例えばPH約5〜9のリン酸
緩衝液等)にけん濁したものを添加混合し、つい
でこの混合液を約0〜10℃で約0.5〜4時間放置
することにより実施される。また例えば特開昭53
−6483号および同54−11292号方法による場合
は、上記により得た混合液をアンモニウムイオン
もしくは原子量24以上の金属イオン(例えばアル
カリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アル
ミニウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン等)
と接触させるか、分子構造内に2個以上の塩基性
官能基を有する化合物(例えばアルキレンジアミ
ン、芳香族ジアミン、アミノ酸ハイドロキサメイ
ト等)と接触させるか、あるいは水と混合し得る
有機溶媒(例えば低級アルカノン、低級アルカノ
ール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチ
ルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレ
ングリコール等)と接触させることにより実施さ
れる。 上記により得られたゲルにジアミノ脂肪族カル
ボン酸を作用させるには、まずジアミノ脂肪族カ
ルボン酸を適当な溶媒に溶解し、この溶液に上記
ゲルを浸漬させて実施するとよい。適当な溶媒と
しては、例えば水、リン酸緩衝液(PH約5〜9)
等が適当である。ジアミノ脂肪族カルボン酸とし
ては、例えばα,β−ジアミノプロピオン酸、
α,γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、リジン、β
−リジン等があげられるが、とりわけオルニチ
ン、リジン等の炭素数4乃至6個を有するα,ω
−ジアミノ脂肪族カルボン酸が好適に用いられ
る。これら化合物は光学活性体であつても、光学
的に不活性なラセミ体であつてもよく、また例え
ば塩酸塩等の鉱酸塩であつてもよい。また該化合
物の溶液にゲルを浸漬させるに際してその濃度は
約0.1〜3モル濃度、とりわけ0.2〜2モル濃度が
好ましく、他方の浸漬させるゲルは立方体状(1
辺約3mm程度)、球状(径約3mm程度)、繊維状
(径約1mm程度)、膜状あるいは板状等の適当な形
状に成型すれば浸漬処理を効率よく実施すること
が出来るので好ましい。作用温度は、通常0〜30
℃、とりわけ10℃付近が適当である。続いて上記
浸漬処理したゲルに脂肪族ジアルデヒドを作用さ
せるには、該脂肪族ジアルデヒドの溶液にゲルを
浸漬することにより実施するとよい。使用される
溶媒としては上記同様に水、リン酸緩衝液等が適
宜使用される。脂肪族ジアルデヒドとしては、例
えばグルタルアルデヒド、グルオキサール等の炭
素数2乃至5個を有するものがあげられ、とりわ
けグルタルアルデヒドが好適に使用される。また
脂肪族ジアルデヒドの濃度は約0.05〜5モル濃
度、とりわけ0.1〜2.5モル濃度が好ましい。作用
温度は30℃以下、とりわけ0〜15℃付近が、また
PHは4〜11、とりわけ5〜10付近がそれぞれ好ま
しい。 またジアミノ脂肪族カルボン酸または脂肪族ジ
アルデヒドの溶液に対する浸漬処理は、上記の如
く段階的に行なうことを出来るが、例えばジアミ
ノ脂肪族カルボン酸の溶液にゲルを浸漬し、つい
でこの溶液に脂肪族ジアルデヒドの溶液を加える
如き同一条件で連続操作により一挙に行なうこと
も出来る。 かくして得られた固定化微生物はL−アスパラ
ギン酸またはその塩を作用させるとL−アラニン
が得られ、またDL−アスパラギン酸またはその
塩を作用させるとL−アラニンとD−アスパラギ
ン酸が得られる。ここでL−アスパラギン酸また
はDL−アスパラギン酸の塩としては、例えばそ
れらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、アンモニウム塩等が好ましい。 酵素反応は、0〜50℃の広い温度範囲で実施す
ることが出来るが、固定化微生物の酵素の安定性
を考慮して30〜40℃で実施するのが好ましい。
尚、上記酵素反応に際しては基質溶液にピリドキ
サールリン酸、ケト酸(例えばピルビン酸、α−
ケトグルタール酸等)等を適宜添加することによ
り該酵素反応を一層促進させることが出来、また
更にコバルトイオン、ニツケルイオン等の2価金
属イオンを添加すると固定化微生物の酵素活性の
安定性を高めることが出来る。また、この酵素反
応は使用する固定化微生物が水に不溶性であるた
め、バツチ法によるのみならずカラム法によつて
連続的に実施することが出来る。 例えばカラム法による場合、該固定化微生物を
カラムに充填し、このカラムにL−アスパラギン
酸、DL−アスパラギン酸またはそれらの塩を有
する溶液を適当な速度で導通すればL−アラニン
のみ、あるいはL−アラニンとD−アスパラギン
酸とを含む流出液が得られる。なおこの場合、酵
素反応により生成する炭酸ガスのカラム内への滞
留を避けるため基質溶液はカラム下部より上部に
向けて流すのが好ましい。またバツチ法による場
合、該固定化微生物は上記基質溶液にけん濁し、
かく拌する如き方法によりL−アラニンのみある
いはL−アラニンとD−アスパラギン酸とを含む
反応液が得られる。この場合には反応終了液から
固定化微生物をろ過あるいは遠心分離する如き方
法により取得すれば再びこれを反覆使用すること
が出来る。 これらの方法において、基質としてDL−アス
パラギン酸またはその塩を用いる場合L−アラニ
ンとD−アスパラギン酸とを含む溶液が得られる
が、これらの両者は例えば直接晶析法、イオン交
換樹脂処理等の公知の単離精製操作を適宜組合せ
ることにより容易に分離採取することが出来る。 本発明方法を実施するにあたつては反応進行率
は固定化微生物の量、温度、反応時間、基質の流
速その他により影響される。例えばカラム法によ
る場合は使用する固定化微生物の量に従い基質溶
液の導通速度を、またバツチ法による場合はその
反応時間を適当に調整することにより反応進行率
を100%にまで高める至適条件を見出すことも容
易である。 実施例 1 (1) 固定化微生物の調製: グルタミン酸ナトリウム3.2%、ミースト0.5
%、第一リン酸カリウム0.05%、硫酸マグネシウ
ム0.01%を含む培地(PH7.3)を500ml容坂口フラ
スコ10本に120ml宛分注し、これらにシユードモ
ナス・ダクネーIAM1152を植菌する。30℃で24
時間振とう培養したのち、遠心分離することによ
り、シユードモナス・ダクネー菌体20g(湿重
量)を集めた。 別に、ゲニユールゲルWG(商品名、コペンハ
ーゲンペクチンフアクトリー社製のカラギーナ
ン、以下同)4.03gを50℃の温水85mlに溶解し、
カラギーナン水溶液を調製した。この溶液に、上
記で得たシユードモナス・ダクネーの菌体20gを
生理的食塩水20mlにけん濁したものを45℃にて添
加混合した。4℃にて30分間放置したのち、生成
したゲルを一辺約3mmの立方体に成型した。この
ゲルに16.7ML−リジン塩酸塩を含む0.2Mリン酸
緩衝液260mlを加え、10℃で10分間放置した。こ
の溶液に25%グルタルアルデヒド水溶液173mlを
加え、10℃で10分間放置した、接触処理後ゲルを
ロ取し、2%塩化カリウム水溶液で洗浄すること
により、L−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性
を有する固定化シユードモナス・ダクネー130g
(湿重量)を得た。 (2) L−アラニンの調製: 上記(1)で得た固定化シユードモナス・ダクネー
40gを外とう管付カラム(内径1.6cm×長さ19
cm)に充填し、37℃にて10-4Mピリドキサールリ
ン酸を含む1ML−アスパラギン酸アンモニウム
溶液(アンモニアにてPH5.5に調整)500mlをカラ
ム下部より上方に向つて15ml/hrの流速で導通し
た。流出液500mlを全量150mlになるまで濃縮し、
エタノール150mlを加えた。析出晶をロ取し、冷
メタノール30mlで洗浄することにより、L−アラ
ニン40.2gを得た。 m.p. 297℃(分解) 〔α〕23 D+14.4℃(C=6.46,1N−HC1) 実施例 2 実施例1(1)と同様にして得た固定化微生物40g
を外とう管付カラム(内径1.6cm×長さ19cm)に
充填し、37℃にて10-4Mピリドキサールリン酸を
含む1MDL−アスパラギン酸アンモニウム水溶液
(アンモニアでPH5.5に調整)500mlをカラム下端
より上方に向つて20ml/hrの流速で導通した。流
出液500mlを100mlにまで濃縮し、PH3.0に調整す
る。析出晶をロ取し、冷水で洗浄することによ
り、D−アスパラギン酸30.4gを得た。 〔α〕25 D−24.9°(C=2,5N−HC1) D−アスパラギン酸をロ取したロ液をアンバー
ライトIR4B(OH-型)樹脂カラムに導通する。
流出液を減圧濃縮し、エタノールを加えることに
より、L−アラニン18.4gを得た。 m.p. 297℃(分解) 〔α〕23 D+14.4゜(C=6.46,1N−HC1) 実施例 3 (1) 固定化微生物の調製: 実施例1(1)と同様にして得た一辺約3mmの立方
体ゲル約130gに、1.25ML−オルニチン塩酸塩を
含む0.2Mリン酸緩衝液260mlを加え、10℃で10分
間放置した、この溶液に25%グルタルアルデヒド
水溶液65mlを加え、10℃で30分間放置した。接触
処理後ゲルをロ取し、2%塩化カリウム水溶液で
洗浄することにより、L−アスパラギン酸β−脱
炭酸酵素活性を有する固定化シユードモナス・ダ
クネー130g(湿重量)を得た。 (2) L−アラニンの調製: 上記(1)で得た固定化シユードモナス・ダクネー
40gを外とう管付カラム(内径1.6cm×長さ19
cm)に充填し、37℃にて10-4Mピリドキサールリ
ン酸を含む1ML−アスパラギン酸アンモニウム
溶液(アンモニアにてPH5.5に調整)500mlをカラ
ム下部より上方に向つて15ml/hrの流速で導通し
た。流出液500mlを全量150mlになるまで濃縮し、
エタノール150mlを加えた。析出晶をロ取し、冷
メタノール3mlで洗浄することにより、L−アラ
ニン40.1gを得た。 m.p. 297℃(分解) 〔α〕23 D+14.4(C=6.46,1N−HC1) 実験例 1 実施例1(1)で調製した固定化微生物と対照の固
定化微生物を用いて連続酵素反応を実施し、それ
ら固定化微生物の酵素活性が半減するまでの期間
を調べた。尚、対照の固定化微生物は下記により
調製した。 (対照の固定微生物(1)の調製) ゲニユールゲルWG1.0gを50℃の温水20mlに溶
解した。この溶液にシユードモナス・ダクネー
IAM1152の菌体5gを生理的食塩水5mlにけん
濁したものを37℃にて添加混合する。この混合液
に1Mヘキサメチレンジアミン水溶液(PH7.0)1
mlを添加混合し、4℃にて30分間放置した。生成
したゲルを約3mmの立方体に成型し、これに1%
グルタルアルデヒドを含む2%塩化アンモニウム
水溶液50mlを加えて0℃で15分間硬化処理した。
このゲルをロ取し1%塩化アンモニウム水溶液で
洗浄することにより、対照の固定化シユードモナ
ス・ダクネー31g(湿重量)を得た。 (対照の固定化微生物(2)の調製) ゲニユーゲルWG1.0gを50℃の温水20mlに溶解
した、この溶解にシユードモナス・ダクネー
IAM1152の菌体5gを生理的食塩水5mlにけん
濁したものを37℃で添加混合した。この混合液を
4℃で30分間放置し、生成したゲルを1辺3mmの
立方体に成型することにより、対照の固定化シユ
ードモナス・ダクネー31g(湿重量)を得た。 (実験方法) 固定化シユードモナス・ダクネー4gを外とう
管付カラム(内径1.6cm×長さ10.5cm)に充填
し、37℃にて10-4Mピリドキサールリン酸を含む
1ML−アスパラギン酸アンモニウム水溶液(ア
ンモニアでPH5.5に調整)を18ml/hrの速度で昼
夜連続してカラムの下端から上方に向つて流し、
流出液中のL−アラニンの生成率を求め、また固
定化微生物の初期酵素活性が50%低下するのに要
する日数を測定した。 尚、流出液中のL−アラニンの定量はロイコノ
ストツク・チトロボラムATCC8081を用いるバイ
オアツセイにより行ない、酵素活性が50%低下す
るのに要する日数は下記式により算出した(以下
同)。 kd=2.303/tlogno/n t1/2=0.693/kd 〔但し kd;劣化速度定数(1/日) t;反応時間(日) no;初期酵素活性 n;t日後の酵素活性 t1/2;半減期(日)〕 (結果) 第1表および第1図に示す通りであり、本発明
方法で使用する固定化微生物は、高い酵素活性を
維持し、酵素活性の半減期も大巾に延長されるも
のであることが認められた。
【表】
に要する日数
実験例 2 実験例1で使用した固定化微生物と同一の固定
化微生物を用い、基質水溶液PHが固定化微生物の
酵素活性に及ぼす影響を調べた。 (実験方法) 固定化微生物1g(湿重量)を100ml容三角フ
ラスコに入れ、これに下記第2表に示す、異つた
PHを有する基質水溶液〔10-4Mピリドキサールリ
ン酸を含む1ML−アスパラギン酸アンモニウム
水溶液(PHは1Mリン酸緩衝液で調整)〕10mlを加
え、37℃で1時間振とう反応させた。反応後反応
終了液中のL−アラニンを定量し、各PH域におけ
る酵素活性発現率を求めた。 (結果) 第2表に示す通りであり、本発明方法で使用す
る固定化微生物は、アルカリ性側においても酵素
活性の低下が少ないことが認められた。
実験例 2 実験例1で使用した固定化微生物と同一の固定
化微生物を用い、基質水溶液PHが固定化微生物の
酵素活性に及ぼす影響を調べた。 (実験方法) 固定化微生物1g(湿重量)を100ml容三角フ
ラスコに入れ、これに下記第2表に示す、異つた
PHを有する基質水溶液〔10-4Mピリドキサールリ
ン酸を含む1ML−アスパラギン酸アンモニウム
水溶液(PHは1Mリン酸緩衝液で調整)〕10mlを加
え、37℃で1時間振とう反応させた。反応後反応
終了液中のL−アラニンを定量し、各PH域におけ
る酵素活性発現率を求めた。 (結果) 第2表に示す通りであり、本発明方法で使用す
る固定化微生物は、アルカリ性側においても酵素
活性の低下が少ないことが認められた。
【表】
【表】
し、 その相対値で表わした。
第1図は本発明方法で使用する固定化微生物と
対照の固定化微生物の酵素活性の経時変化を表わ
す図であり、は本発明で使用する固定化微生
物、は固定化微生物(1)、は固定化微生物(2)を
それぞれ示す。
対照の固定化微生物の酵素活性の経時変化を表わ
す図であり、は本発明で使用する固定化微生
物、は固定化微生物(1)、は固定化微生物(2)を
それぞれ示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 分子構造内に硫酸基を10w/w%以上有する
多糖類の水溶液にL−アスパラギン酸β−脱炭酸
酵素活性を有する微生物を添加混合し、該混合液
をゲル化してゲル格子中に前記微生物を包括させ
た後、該ゲルにジアミノ脂肪族カルボン酸および
脂肪族ジアルデヒドを順次作用させ、かくして得
られた固定化微生物にL−アスパラギン酸または
その塩を作用させることを特徴とするL−アラニ
ンの製法。 2 分子構造内に硫酸基を10w/w%以上有する
多糖類の水溶液にL−アスパラギン酸β−脱炭酸
酵素活性を有する微生物を添加混合し、該混合液
をゲル化してゲル格子中に前記微生物を包括させ
た後、該ゲルにジアミノ脂肪族カルボン酸および
脂肪族ジアルデヒドを順次作用させ、かくして得
られた固定化微生物にDL−アスパラギン酸また
はその塩を作用させ、ついで必要とあれば反応生
成物からL−アラニンとD−アスパラギン酸を分
離・採取することを特徴とするL−アラニンとD
−アスパラギン酸の製法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11617780A JPS5739793A (en) | 1980-08-22 | 1980-08-22 | Prepaeation of l-alanine and d-aspartic acid |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11617780A JPS5739793A (en) | 1980-08-22 | 1980-08-22 | Prepaeation of l-alanine and d-aspartic acid |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5739793A JPS5739793A (en) | 1982-03-05 |
JPS6225039B2 true JPS6225039B2 (ja) | 1987-06-01 |
Family
ID=14680695
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP11617780A Granted JPS5739793A (en) | 1980-08-22 | 1980-08-22 | Prepaeation of l-alanine and d-aspartic acid |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5739793A (ja) |
-
1980
- 1980-08-22 JP JP11617780A patent/JPS5739793A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5739793A (en) | 1982-03-05 |
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