JPH0355103B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアスパルターゼ活性を有する微生物の
マフラーゼ活性除去方法に関する。 アスパルターゼはフマール酸とアンモニアから
のＬ−アスパラギン酸生成反応を触媒する酸素で
ある。従来、Ｌ−アスパラギン酸の製法とは例え
ば上記アスパルターゼ活性を有する微生物を基質
であるフマール酸アンモニウム塩またはフマール
酸もしくはその塩と無機アンモニウム塩を含有す
る培地で培養しＬ−アスパラギン酸を生成著積さ
せる方法が知られている他、アスパラターゼ活性
を有する微生物をポリアクリルアミドゲルに固定
化し、得られる固定化微生物を基質に作用させる
方法（特開昭48−49988号）等種々の方法が知ら
れている。しかしながら微生物にはエネルギー生
産系の一つとしてTCAサイクルが存在し、該
TCAサイクルのフマール酸とＬ−リンゴ酸の平
衡反応を触媒する酵素、フマラーゼが含まれてい
る。このフマラーゼ活性のためフマール酸アンモ
ニウム塩又はフマール酸もしくはその塩と無機ア
ンモニウム塩からＬ−アスパラギン酸を製造する
際、Ｌ−アスパラギン酸と共にＬ−リンゴ酸が副
生してくる。従つてＬ−ｆアスパラギン酸を効率
よく製造するためにはこのフマラーゼ活性と発現
を阻止する必要がある。しかしながら現在知られ
ている如く酸素を高温で処理する方法（酸素工学
ハンドブツク、A.ワイズマン編、辻阪好夫監訳、
p20、1977（講談社発行））ではフマラーゼ活性は
抑えられるが、アスパルターゼ活性も共に抑えら
れるためＬ−アシパラギン酸の生成量が低下する
という難点があつた。 これに対し本発明者等は鋭意研究の結果、微生
物の有するアスパルターゼ活性には全く影響を与
えることなくフマラーゼ活性にみを選択的に失活
させる方法を見出した。 即ち、本発明によればアクパルターゼ活性を有
する微生物又はその固定化微生物を酸処理するこ
とにより当該微生物又は固定化微生物のフマラー
ゼ活性を除去することができる。 本発明において用いられるアスパルターゼー活
性を有する微生物としては上記活性を有する微生
物であればいずれも用いることができ、かかる微
生物としては例えば大腸菌（ATCC11303）、シユ
ードモナス・アエルギノーサ（OUT8252）、セラ
チア・マルセツセンス（OUT8259）、プロテウ
ス・ブルガリス（微工研菌寄第562号）、バクテリ
ウム・サクシニウム（IAM1017）、アルカリゲネ
ス・フエカリス（OUT8030）等が好適にあげら
れる。 これらの微生物は遊離菌体のまま用いることが
でき、該菌体をそれ自体公知の方法で固定化した
微生物であつてもよく、例えばポリアクリルアミ
ドゲル、含硫多糖類ゲル（カラギーナン、フアー
セレラン等）、コラーゲンゲル、アルギル酸ゲル、
ポリビニアルコールゲル、寒天ゲルで固定化した
微生物をいずれも本発明の目的に用いることがで
きる。上記の内ポリアクリルアミドゲルによる場
合は、例えば特公昭53−18131号記載の通り微生
物菌体の水けん濁液にアクリルアミドモノマー、
架橋剤（例えばＮ，N′−メチレンビスアクリル
アミド）、重合促進剤〔例えばβ−（ジメチルアミ
ノ）プロピオニトリル〕、重合開始剤（例えば過
硫酸カリウム）を加え、ゲル化させることにより
固定化微生物が得られる。又、カラギーナン、フ
アーセレラン等の含硫多糖類による場合は例えば
特開昭53−6483号に記載の通り微生物菌体をカラ
ギーナン水溶液にけん濁しこのけん濁液にゲル化
剤（例えば第４周期以上のアルカリ金属、アルカ
リ土類金属、アンモニウムイオン等）を接触させ
るか冷却してゲル化させることにより固定化微生
物が得られる。含硫多糖類としては分子内の硫酸
基含量10w／ｗ％以上、とりわけ硫酸基含量12〜
62w／ｗ％のものを用いるのが好ましい。その
他、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリビニ
ルアルコールゲル、寒天ゲル等による場合も、そ
れ自体公知の方法例えば特開昭51−144780号、特
開昭49−30582号、特開昭49−80285号、特開昭51
−133484号記載の方法に従つて当該微生物を処理
することにより容易に相当する固体化微生物を得
ることができる。これらの固定化微生物は例えば
立方体状（１辺約３mm程度）、球状（直径約３mm
程度）、繊維状（径約１mm程度）、膜状あるいは板
状等の適当な形状に成型すればつづいての処理操
作を効率よく実施できるので好ましい。 上記の如き微生物又は固定化微生物の酸処理は
当該微生物又は固定化微生物を酸溶液中に浸漬す
るかあるいは当該微生物又は固定化微生物を含有
する液中に酸を加えることにより実施できる。酸
としての例えば酢酸、乳酸、酒石酸等の有機酸、
塩酸、硫酸等の無機酸をいずれも用いることがで
き、とりわけ酢酸を用いるのが好ましい。これら
酸による処理はいPH３〜６、とりわけ４〜5.5の
条件下に実施するのが好ましく、又酸は水溶液そ
れ自体だけでなく酸緩衝液をも用いることができ
る。 微生物又は固定化微生物含有液中に酸を加えて
実施する場合には前記酸を上記PH範囲のなるよう
に酸の添加量を調整することより行なう。更に微
生物又は固定化微生物の酸処理は約０〜60℃、と
りわけ約20〜50℃で実施するのが好ましい。接触
時間は微生物が遊離菌体の場合約３分〜24時間、
とりわけ約５分〜10時間程度とするのが好まし
く、固定化微生物の場合には約10分〜５日間、と
りわけ約１〜48時間程度とするのが好ましい。上
記微生物又は固定化微生物の酸処理に際し、Ｌ−
アスパラギン酸もしくはその塩又はフマール酸も
しくはその塩を添加して実施すれば該酸処理後の
酸素反応においてアスパルターゼー活性が長時間
安定となるので好ましい。これらの添加量は約
0.001〜1.5モルが好適である。 かくして得られたフマラーゼ活生の除去された
微生物又は固定化微生物にフマール酸アンモニウ
ム塩を作用させるか、又はフマール酸もしくはそ
の塩および無機アンモニウム塩を作用させること
によりＬ−アスパラギン酸を得ることができる。
フマール酸塩としては例えばフマール酸ナトリウ
ム、フマール酸カリウム好適に用いることがで
き、無縁アンモニウム塩として例えば塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム又はこれらの混合物を好適に用いることができ
る。 フマール酸もしくはその塩と無機アンモニウム
塩を用いる場合には、これら２成分のモル比は
１：1.5〜１：２の間にあるのが適当である。酸
素反応は、０〜60℃の広い温度範囲で実施するこ
とができるが微生物の酸素と安定生を考慮して20
〜45℃で実施するのが好ましい。尚、上記酵素反
応に際してはマグネシウム、カルシウム、マンガ
ン等の２価金属イオンを添加すると微生物の酵素
活性の安定性を高めることができ好ましい。 反応は遊離の微生物菌体を用いる場合にはバツ
チ法で実施するのが好しく、培養後集菌した微生
物菌体を前記した如き基質溶液にけん濁しかくは
んすることによつてＬ−アスパラギン酸が生成す
る。又、固定化微生物を用いる場合の反応は固定
化微生物が水に不溶性であるため、バツチ法によ
るのみならず、カラム法によつて連続的に実施す
ることもできる。例えば固定化微生物をカラムに
充填し、このカラムに基質溶液を適当な速度で流
下すれは、Ｌ−アスパラギン酸のみを含む流出液
が得られる。またバツチ法による場合は基質溶液
に固定化微生物をけん濁させ、かくはんすること
によつてＬ−アスパラギン酸が生成する。この場
合には反応終了液から固定化微生物をロ過或いは
遠心分離することにより取得すれば再びこれを反
覆使用することができる。上記反応を実施するに
あたつて反応進行率は微生物の量、温度、反応時
間、基質と流速（特に線速度）その他により影響
される。例えば、カラム法による場合は使用する
固定化微生物の量に従い基質溶液の流下速度を、
またバツチ法による場合はその反応時間を適当に
調整することにより反応進行率を100％にまで高
める至適条件を見出すことも容易である。 以上の如く本発明方法は(1)はアスパルターゼ活
性を有する微生物を酸処理するという極めて簡単
な操作で該微生物のフマラーゼ活性を完全に除去
できること；(2)該方法は遊離の微生物にも固定化
微生物にもともに適用できること；(3)又、一旦除
去されたフラマーゼ活性は長期間酵素反応を実施
しても再び出現することがないこと；(4)更にフマ
ラーゼ活性の除去された微生物を公知の方法で固
定化してもその得られる効果には何ら変りがない
こと等、種々のすぐれた特徴及び効果を有するも
のである。又、本発明方法によりフマラーゼ活性
の除去された微生物あるいは固定化微生物を用い
てフマール酸アンモニウム塩又はフマール酸もし
くはその塩および無機アンモニウム塩からＬ−ア
スパラギン酸を製造すれば生成物中にＬ−リンゴ
酸が含まれていないので再結晶等の後処理が不用
であり、この点からも本発明方法はＬ−アスパラ
ギン酸の工業的に極めて製造方法となるのもので
ある。 以下、実験例、実施例により本発明をさらに詳
細に説明する。 実験例 １ 下記により調製した微生物を用いてフマール酸
アンモニウム塩からＬ−アスパラギン酸を生成さ
せ反応中に副生するＬ−リンゴ酸量を比較した。 (1) 微生物の調整 （本発明方法による酸処理をした微生物の調
製） コーンスチープリカー２％、ミースト２％、
フマール酸1.14％、フマール酸ジアンモニウム
0.5％、第１リン酸カリウム0.2％、硫酸マグネ
シウム0.05％を含む培地（PH7.0）100mlを500
ml容坂口フラスコに入れ、これに大腸菌
（ACC11303）を植菌した。30℃で16時間振と
う培養したのち酢酸1.5mlを加えPHを5.0に調整
し45℃で１時間放置した。 （対照微生物の調製） 酢酸処理をしない以外は上記と同様にして微
生物を調製した。 (2) 実験方法 上記で得られた微生物0.4ｇを0.1％ポリエチ
レングリコール−ｐ−アルキルフエニルエーテ
ルと10^-3M塩化マグネシウムを含む1Mフマー
ル酸アンモニウム水溶液（アンモニアでPH8.5
に調整）50mlを入れた100ml容三角フラスコに
加え37℃にて振とう反応させ反応中のＬ−アス
パラギン酸とＬ−リンゴ酸の生成量を経時的に
測定した。 尚、Ｌ−アスパラギン酸の定量はロイコノス
トツク・メツセンテロイデスｐ−60を用いるバ
イオアツセイ法により行ないＬ−リンゴ酸の定
量は硫酸中2.7−ナフタレンジオールと反応さ
せて発色させる方法で行つた（以下、同）。 (3) 結果 結果は後記図面に示す通りであり、本発明方
法により調製した微生物はＬ−リンゴ酸を全く
生成しないのに対し対照の微生物は５時間目に
おけるＬ−リンゴ酸生成量が0.08Mに達するこ
とが認められた。 実施例 ２ 下記により調製した固定化微生物を用い連続酵
素反応を実施し反応終了液中のＬ−リンゴ酸生成
量を比較した。 (1) 固定化微生物の調製 （本発明方法による酸処理をした固定化微生物
の調製） 実験例１(1)と同様の培地を500ml容坂口フラ
スコ10本に100ml宛分注し、これに大腸菌
（ATCC11303）を植菌した。30℃で16時間しん
とう培養したのち遠心分離することにより大腸
菌菌体23ｇ（湿重量）を集めた。別にゲニユー
ゲルWG6ｇを45℃の温水129mlに溶解しカラギ
ーナン水溶液を調製した。この溶液に上記で得
た大腸菌菌体23ｇを生理的食塩水23mlにけん濁
したものを40℃にて添加混合した。４℃にて30
分間放置し生成しゲルを１辺約３mmの立方体に
成型した。このゲルを10ｍML−アスパラギン
酸と２％塩化カリウムを含む0.2M酢酸緩衝液
（PH5.0）400ml中に浸漬し37℃にて24時間放置
した。その後２％のカリウム水溶液で洗浄する
ことによりフマラーゼ活性を有しない固定化大
腸菌180ｇ（湿重量）を得た。 （対照微生物の調製） 酢酸緩衝液浸漬処理をしない以外は上記と同
様に行つた。 (2) 実験方法 上記(1)で得た固定化大腸菌40ｇをそれぞれ外
とう管付カラム（内径1.6cm×長さ19cm）に充
填し37℃にて10^-3M塩化マグネシウムを含む
1Mフマール酸アンモニウム水溶液（アンモニ
ウムでPH8.5に調整）500mlを50ml／ｈな流速で
導通した。定常状態に達した後、流出液中のＬ
−アスパラギン酸とＬ−リンゴ酸の濃度を経時
的に測定した。 (3) 結果 結果は下記表に示す通りであり、本発明方法
により酸処理した固定化微生物はＬ−リンゴ酸
を全く生成しないのに対し、対照の固定化微生
物は４％のリンゴ酸を生成することが認められ
た。

【表】 参考例 １ 実験例１(1)と同様にして得た大腸菌を含む培養
液にポリエチレングリコール−ｐ−アルキルフエ
ニルエーテル0.1％を添加しフマール酸ジアンモ
ニウム25.9ｇを加え37℃にて24時間反応させた。
反応終了液をろ過しろ液に硫酸を加えPH2.8に調
整して析出晶をろ取し、冷水、冷メタノールで洗
浄することによりＬ−アスパラギン酸21.3ｇを無
色結晶として得る。 〔α〕²⁰ _D＋24.8°（Ｃ＝２，6N−HCI） 参考例 ２ 実験例２(1)と同様にして得た固定化大腸菌40ｇ
を外とう管付カラム（内径1.6cm×長さ19cm）に
充填し37℃にて10^-3M塩化マグネシウムを含む
1Mのフマール酸アンモニウム水溶液（アンモニ
アにてPH8.5に調製）500mlを50ml／ｈの硫速で導
通した。流出液500mlに濃硫酸を加えてPHを2.8に
調整した。析出晶をろ取し冷水、冷メタノールで
洗浄することによりＬ−アスパラギン酸59.9ｇを
得る。 〔α〕²⁰ _D＋24.8°（Ｃ＝２，6H−HCI） 参考例 ３ 実験例１(1)と同様の培地を500ml容坂口フラス
コ10本に100ml宛分注し、これに大腸菌
（ATCC11303）を植菌した。30℃で16時間振とう
培養した培養終了液に、６規定塩酸45mlを加えPH
を5.0に調整し45℃で１時間放置した。これに10
％カセイソーダ33mlを加えPHを5.5に調整したの
ち、遠心分離することにより、大腸菌菌体23ｇ
（湿重量）を集めた。別にゲニユーゲルWG6ｇを
45℃の温水129mlに溶解し（カラギーナン水溶液
を調製した。この溶液に上記で得た大腸菌菌体23
ｇを生理的食塩水23mlにけん濁したものを40℃に
て添加混合した。４℃にて30分間放置し生成した
ゲルを１辺約３mmの立方体に成型した。このゲル
40ｇを外とう管付カラム（内径1.6cm×長さ19cm）
に充填し、37℃にて10^-3M塩化マグネシウムを含
む1Mフマール酸アンモニウム水溶液（アンモニ
アにてPH8.5に調整）500mlを50ml／ｈの流速で導
通した。流出液500mlに濃硫酸を加えてPHを2.8に
調整した。析出晶をろ取し冷水、冷メタノールで
洗浄することよりＬ−アスパラギン酸59.8ｇを得
る。 〔α〕²⁰ _D＋24.8°（Ｃ＝２，6N−HCI）

【図面の簡単な説明】

図面は実施例１において本発明方法によりフマ
ラーゼ活性を除去した微生物と対照微生物を用い
てＬ−アスパラギン酸を製造した場合の副生する
Ｌ−リンゴ酸量とＬ−アスパラギン酸量を経時的
に表わしたものである。図面中においては本発
明方法によりフマラーゼ活性を除去した微生物
を、は対照微生物を表す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アスパルターゼ活性を有する微生物又はその
   固定化微生物を酸処理することを特徴とする該微
   生物のフマラーゼ活性を除去する方法。 ２ アスパルターゼ活性を有する微生物又はカラ
   ギーナンで包括されてなる当該微生物を酸酢水溶
   液で処理することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３ アスパルターゼ活性を有する微生物又はその
   固定化微生物を酸処理してフマラーゼ活性を除去
   するに際し、Ｌ−アスパラギン酸もしくはその塩
   又はフマール酸もしくはその塩を添加して行う特
   許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。