JPH0434397B2

JPH0434397B2 -

Info

Publication number: JPH0434397B2
Application number: JP59007290A
Authority: JP
Inventors: Ichiro Watanabe; Yasuo Ogawa; Susumu Seki
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1984-01-20
Filing date: 1984-01-20
Publication date: 1992-06-05
Also published as: DE3573136D1; EP0150956A3; EP0150956B1; EP0150956A2; JPS60153798A; US4851342A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物によるアクリルアミドの製造法
において、極めて高品質のアクリルアミドの製造
法において、極めて高品質のアクリルアミド水溶
液を得る方法に関するものである。従来、ニノトリラーゼ活性を有する微生物の中
にアクリロニトリルを水和してアクリルアミドに
変換する能力を有するものがあることは公知であ
り、このような微生物として、これまでにバチル
ス属、バクテリジウム属、ミクロコツカス属およ
びブレビバクテリウム属（特開昭51−86186号公
報参照）、コリネバクテリウム属およびノカルジ
ア属（特公昭56−17918号公報参照）、およびシユ
ードモナス属（特開昭58−86093号公報参照）に
属する微生物が知られている。また、これらの微生物を使用してアクリロニト
リルよりアクリルアミドを製造するには、これら
の微生物の菌体をそのまま、あるいは重合体ゲル
などで固定化した固定化菌体を用いて水性媒体
（例えば水、生理食塩水、リン酸塩緩衝液など）
中でアクリロニトリルと接触反応させて行われ
る。この際、酵素反応を円滑に進行させるために
は、通常、基質アクリロニトリル濃度：0.1〜10
重量％、菌体濃度：0.01〜10重量％、PH：７〜
９、温度：氷点〜30℃、時間：0.5〜100時間で行
われる。特に最近、微生物反応では菌体からの不純物溶
出の防止、菌体の反応液からの分離性、菌体の反
復利用性、酸素安定性の増大などの点から粒状化
した固定化菌体を用いる回分法あるいは連続法な
どによる方法が普及している。微生物によるアク
リルアミドの製造法においてもかかる方法が経済
的に有利であり、本発明者らは、先にポリアクリ
ルアミドなどのゲルにて包括固定化した固定化菌
体を用いた連続カラム反応によるアクリルアミド
の製造法を提案している（特公昭57−1234号公報
参照）。しかしながら、反応に際し菌体をそのまま、あ
るいは固定化菌体として使うにせよ水性媒体とし
て上記のごとき生理食塩水、リン酸塩緩衝液など
を用いることは、生成するアクリルアミド水溶液
中に多量の塩化ナトリウム、リン酸塩類などを含
有させることになり品質上好ましくない。特に、
リン酸塩の存在は高重合度のアクリルアミド系重
合体を製造する際に生成重合体の水不溶化を招き
やすいなど好ましくない結果をもたらす。従つ
て、この場合にはこれらの塩類を除去するためイ
オン交換処理などの後処理が不可欠となり、操作
が煩雑化し経済上好ましくない。また、一方、水性媒体として生理食塩水、リン
酸塩緩衝液などを用いない水のみの系で反応を行
うと菌体の酵素活性が急速に低下しやすいなどの
難点を有すると共に、ポリアクリルアミドゲルな
どで固定化した菌体をカラムに充填して連続水和
反応を行う場合には、反応開始後短時間のうちに
カラム内の固定化菌体が膨潤してしまい円滑な運
転ができなくなる、などの問題点を有し好ましく
ない。すなわち、微生物法によるアクリルアミドの製
造においては、経済性に重点をおいて菌体酵素の
安定化をはかろうと思えば、多量の塩類を反応液
中に存在させなければならず、従つて、生成アク
リルアミド水溶液の純度が低下してしまうこと、
一方、生成アクリルアミド水溶液の純度（品質）
に重点をおいて考えれば、菌体酵素が安定性を欠
き、アクリルアミド製造価格に占める菌体コスト
が大となり経済性がなくなる、といつた相容れな
い問題点を有する。かかる問題点を解決するために、本発明者ら
は、先に、高純度のアクリルアミド水溶液を得る
条件で菌体酵素を長時間安定に保つて反応が行え
る方法を見出すべく検討し、(1)少量でも有効に効
きかつ、生成アクリルアミドの重合性に悪影響を
与えない添加物として少量のアルカリ金属の炭酸
塩、重炭酸塩など、あるいはさらに有機カルボン
酸を水性媒体中に存在させて反応を行う方法（特
開昭56−51987号および特開昭56−51988号公報参
照）、(2)塩類無添加の水性媒体を用いても菌体酵
素を安定に保つて反応が行える方法として、菌体
をカチオン性のアクリルアミド系重合体ゲルで包
括した固定化菌体を用いる方法（特公昭58−
35078号公報参照）を提案した。しかし、前者(1)
は実施例にもみるごとく塩類濃度は約0.1％であ
る。この濃度は連続カラム反応における固定化菌
体の膨潤防止に重点をおいて決められたものであ
り、生成アクリルアミド水溶液の品質に特に悪影
響を及ぼさない塩類を選んではいるものの塩類濃
度としては高い。また、アクリル酸など有機酸併
用の場合は反応の副生物を添加する形となり、高
純度のアクリルアミド水溶液を望む上では好まし
くない。従つて、より高品質（純度）のアクリル
アミド水溶液を得ようとする場合には、さらに低
濃度でも有効な化合物の探索が必要である。後者
(2)は実質的に塩類を添加しないで菌体酵素を安定
に保持して反応が行える方法として提案されたも
のである。しかし、(2)では確かに従来公知のポリ
アクリルアミド固定化菌体などにくらべれば塩類
無添加の反応液系での菌体酵素の安定性は改良さ
れているとは云うものの、リン酸塩緩衝液からな
る反応液系とくらべれば長時間反応時の菌体酵素
の安定性が若干劣ることは否めない。従つて、本発明者らは極めて高品質（純度）の
アクリルアミド水溶液を得ると云う観点にたつ
て、菌体酵素の安定性が通常のリン酸塩緩衝液か
らなる反応液系の場合と遜色ない水性媒体を見出
すべく反応系水溶液に添加すべき塩類、それらの
添加量などについてさらに種々検討した結果、菌
体酵素の安定性は塩類の濃度というよりはそのイ
オン強度に大きく関係し反応系水溶液のイオン強
度を0.004M／まで下げても反応時の菌体酵素
の安定性が生理食塩水（（0.85％）、リン酸塩緩衝
液（0.05〜0.1M）の場合と殆んど変らないこと
を見出した。イオン強度はその定義から明らかな
ごとくＩ＝1/2Σmizi²（但し、miはイオンのモル
濃度、ziはイオンの原子価）で表わされる。従つ
て、重合に悪影響をおよぼさず、少量で大きなイ
オン強度を示す塩類が使用する塩類としては好ま
しい。かかる塩類としては１価の陽イオンと多価
（２〜３価）の陰イオンからなる塩類があげられ、
このような塩類を用いれば水性媒体中の塩類濃度
が比較的低くてもイオン強度が大きく菌体酵素の
安定化に寄与する効果が大きいと考えられる。こ
のような塩類の例としてナトリウム、カリウム、
アンモニウムなどの硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩
などを挙げることができる。しかるに、これらの
塩類水溶液を用いアクリロニトリルからアクリル
アミド生成の水和反応を試みたところ、陽イオン
としてアンモニウムを用いた場合、あるいは陰イ
オンとしてホウ酸を用いた場合は水和反応中にお
ける菌体酵素の安定性が余りよくないこと、ま
た、陰イオンとしてリン酸を用いた場合には菌体
酵素の安定化はよかつたが、生成アクリルアミド
水溶液の品質がこの程度のリン酸塩の存在であつ
ても先に記したように悪くなること、従つて、有
効な塩類としてはナトリウム、カリウムの硫酸塩
がよいこと、などが分つた。本発明はこの知見に
もとずいてなされたものであり、少量で大きなイ
オン強度を与え、かつ、アクリルアミドの重合性
に対して不活性な塩類を選択したところにその特
徴を有するものである。すなわち、本発明は、水性媒体中でニトリラー
ゼ活性を有する微生物の作用によりアクリロニト
リルからアクリルアミドを製造する方法におい
て、該水性媒体としてイオン強度が0.004〜
0.01M／１のアルカリ金属の硫酸塩のみの水溶液
を用い、PHを水酸化アルカリにて７〜９にコント
ロールしつつ反応を行うことを特徴とするアクリ
ルアミド水溶液の製造法である。本発明に用いる微生物はアクリロニトリルを加
水分解してアクリルアミドを生成する能力を有す
るものであれば微生物の分類学的位置づけには関
係なくいずれも利用することができる。例えば、
前記特公昭56−17918号公報記載のコリネバクテ
リウム属Ｎ−771菌株（微工研菌寄第4445号）、コ
リネバクテリウム属Ｎ−774菌株（微工研菌寄第
4446号）およびノカルジア属Ｎ−775菌株（微工
研菌寄第4447号）などを好適にあげることができ
る。また、これらの微生物は菌体をそのまま、あ
るいは固定化して用いることができる。微生物を
固定化して使用する場合には、通常広く用いられ
ているポリアクリルアミド、コラーゲン、ゼラチ
ン、カラギーナン、寒天などのゲルによる包括法
が使用できるが、本発明においてはアクリルアミ
ドを製造するという観点からポリアクリルアミド
ゲルによる包括固定化が特に好ましい。また、包括固定化菌体の調製は通常の方法で行
うことができる。例えば、ポリアクリルアミドゲ
ルによる固定化菌体をつくる場合には、単量体で
あるアクリルアミドおよびＮ，N′−メチレンピ
スアクリルアミドをグルタルアルデヒド処理を施
した菌体の懸濁液と混合し、これに重合触媒であ
る過硫酸カリウムおよびジメチルアミノプロピオ
ニトリルを加え、PH6.5〜8.5、温度０〜10℃に30
〜60分間保つて重合させる。かくして菌体を含ん
だ塊状ゲル、すなわちポリアクリルアミドゲルに
より包括された固定化菌体が得られる。本発明において水性媒体中に存在させるアルカ
リ金属塩の硫酸塩としては具体的には硫酸ナトリ
ウム、硫酸カリウムなどであり、その量はアクリ
ロニトリルを含む水性媒体のイオン強度が0.004
〜0.01M／を示す量であり、濃度として反応液
当り0.0189〜0.0473％程度と極めて少量である。さらに、これらの塩類はいずれも中性塩であ
り、重合に対して不活性の塩であるので生成アク
リルアミド水溶液中にこの程度の量存在しても実
質的にアクリルアミドの重合性に影響を及ぼすこ
とはない。以下に本発明の実施態称について述べる。本発明の方法を実施するに当つては、例えば、
前記した微生物の１種または２種以上を選び、菌
体をそのまま、または適当な粒径の粒状物に成型
されたポリアクリルアミドゲル固定化菌体として
硫酸ナトリウムでイオン強度0.004〜0.01M／
に調製された水性媒体中に懸濁し、これに攪拌下
にアクリロニトリルを滴下すればよい。この際、
菌体酵素をより安定に保つために反応系内のPHを
７〜９、好ましくは7.5〜8.5にコントロールし、
温度氷点〜30℃、好ましくは氷点〜15℃、アクリ
ロニトリル濃度0.1〜10重量％、好ましくは３重
量％以下で反応を行う。反応は回分（含半回分）、
連続いずれでも可能であり、上記条件の範囲内で
菌体濃度、反応時間を適宜選定することにより、
アクリルアミド濃度30％までの無色透明な水溶液
（APHA色度10以下）を反応進行率ほぼ100％で
得ることができる。反応終了液から菌体または固定化菌体を常法に
より除いて得られるアクリルアミド水溶液は極く
僅かの硫酸ナトリウム、硫酸カリウムなどを含む
が、アクリルアミドの重合に悪影響を及ぼす不純
物は殆んど含まない。従つて、そのまま、あるい
は通常の方法により濃縮して高分子凝集剤、紙力
増強剤など各種重合体製造用の原料として使用す
ることが可能である。以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。なお、実施例中の部および％は重量に関す
る。また、アクリロニトリル、アクリルアミド、
アクリル酸などの分析はいずれもガスクロマトグ
ラフイー、により行つた。実施例１グルコース１％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.3％および麦芽エキス0.3％からなる培地（PH
7.2）により好気的に培養して調製したＮ−774菌
株の洗浄菌体（含水率80％）４部、イオン強度
0.0075M／の硫酸ナトリウム水溶液847部およ
びアクリロニトリル９部を混合し、攪拌下にアク
リロニトリル、1/20Ｎ水酸化ナトリウムを逐時添
加し、PH8.5、アクリロニトリル濃度１％に保ち
ながら０℃で反応を行つた。約4.5時間で140部の
アクリロニトリルの添加を終了し、さらに３時間
攪拌をつづけ反応を完結させた。菌体を遠心分離
により除去して無色の澄明液を得た。この水溶液
は20％のアクリルアミドを含み未反応のアクリロ
ニトリルは殆んど検出されなかつた。この水溶液を空気を吹き込みつつ45℃でフラツ
シユエバポレーターにより減圧濃縮し50％のアク
リルアミド水溶液を得た。このものはそのままで
種々の重合体製造用の原料として使用可能であつ
た。実施例２実施例１と同様の方法にて調製したＮ−774菌
株の洗浄菌体50部に50％グルタルアルデヒド水溶
液0.4部および0.05Mリン酸塩緩衝液（PH8.0）9.6
部を添加し攪拌下に10℃以下で30分間処理した。
次いで、この菌体懸濁液にアクリルアミド9.5部、
Ｎ，N′−メチレンピスアクリルアミド0.5部、
0.05Mリン酸塩緩衝液15部を混合して均一な懸濁
液となし、これに５％ジメチルアミノプロピオニ
トリル水溶液５部および2.5％過硫酸カリウム水
溶液10部を加え10℃以下に１時間保つて重合ゲル
化させた。かくして得られた塊状の菌体含有ゲル
を小粒子に破砕し0.5％硫酸ナトリウム水溶液
（PH8.5）で十分洗浄し不純物を除去して固定化菌
体100部を得た。この固定化菌体８部、イオン強度0.0075M／
の硫酸ナトリウム水溶液830部およびアクリロニ
トリル25部を混合し、攪拌下にアクリロニトリル
および1/20Ｎ水酸化ナトリウムを逐次添加し、PH
8.5アクリロニトリル濃度３％に保ちながら０℃
で反応を行つた。約６時間で162部のアクリロニ
トリルの添加を終了し、さらに20時間攪拌を続け
反応を完結させた。反応液を静置して無色透明な
上澄液と固定化菌体とを分離した。この上澄液の
アクリルアミド濃度は25％であり、微量のアクリ
ル酸が検出されたが未反応のアクリロニトリルは
殆んど検出されなかつた。この水溶液を空気を吹き込みつつ45℃でフラツ
シユエバポレーターにより減圧濃縮し50％のアク
リルアミド水溶液を得た。このものはそのままで
種々の重合体原料として使用可能であつた。実施例３〜６および比較例１〜３実施例１と同様の方法にて調製したＮ−774菌
株の洗浄菌体５部、種々のイオン強度の硫酸ナト
リウム水溶液846部およびアクリロニトリル17部
を混合し、攪拌下にアクリロニトリルおよび1/20
Ｎ水酸化ナトリウムを逐次添加し、PH7.5〜8.0、
アクリロニトリル濃度２〜１％に保ちながら０℃
で半回分反応を行いアクリルアミドの生成蓄積の
時間的経過を求めた。表１に各種イオン強度の硫
酸ナトリウム水溶液系における反応２，５，８時
間後の生成アクリルアミドの濃度（％）を示し
た。なお、比較のため硫酸ナトリウム水溶液の代
りに0.05Mリン酸カリウム・ナトリウム塩緩衝液
（イオン強度：約0.15M／）を使用した場合に
ついても上記同様の操作を行つた（但し、この場
合は水酸化ナトリウムによるPH調整は不要）。これにより硫酸ナトリウム水溶液のイオン強度
が0.004M／より小さくなると、0.05Mリン酸
カリウム・ナトリウム塩緩衝液の場合に比しアク
リルアミドの蓄積性が悪くなり反応媒体として好
ましくないことが分る。

【表】実施例７および比較例４実施例２と同様の方法にて調製したＮ−774菌
株の固定化菌体４部を、イオン強度0.0075M／
の硫酸カリウム水溶液847部およびアクリロニト
リル17部と混合し、攪拌下にアクリロニトリルお
よび1/20Ｎ水酸化カリウムを逐次添加し、PH8.5、
アクリロニトリル濃度２％に保ちながら０℃で反
応を行つた。なお、比較のため硫酸カリウム水溶
液の代りに0.05Mリン酸カリウム塩緩衝液（イオ
ン強度：約0.15M／）を使用した場合について
上記同様に反応を行つた（但し、この場合は水酸
化カリウムによるPH調整不要）。いずれの塩類を
用いた場合も約12時間で132部のアクリロニトリ
ルの添加を終了し、さらに18時間攪拌を続けて反
応を完結させた。反応液を静置後固定化菌体を分
離して無色透明な上澄液を得た。得られた２種類
の反応液はいずれもアクリルアミド濃度は20％で
あり、微量のアクリル酸が認められたが未反応の
アクリロニトリルは殆んど検出されなかつた。この水溶液をそれぞれ別個に空気を吹き込みつ
つ45℃でフラツシユエバポレーターにより濃縮し
50％のアクリルアミド水溶液を得た。両者につい
て高分子量ポリアクリルアミド系凝集剤を得べく
重合体の製造を試みたところ、硫酸カリウム水溶
液系のものは良好な重合体を生成したが、リン酸
カリウム塩緩衝液系のものは一部水不溶性の重合
体を生じ、良好なポリアクリルアミド系凝集剤が
できなかつた。

Claims

【特許請求の範囲】

１水性媒体中でニトリラーゼ活性を有する微生
物の作用によりアクリロニトリルからアクリルア
ミドを製造する方法において、該水性媒体として
イオン強度が0.004〜0.01M／１のアルカリ金属
の硫酸塩のみの水溶液を用い、PHを水酸化アルカ
リにて７〜９にコントロールしつつ反応を行うこ
とを特徴とするアクリルアミド水溶液の製造法。