JPS5835078B2 - 新規なる固定化菌体によるアクリルアミドの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はニトリラーゼ活性を有する微生物をカチオン性
のアクリルアミド系重合体ゲルで包括固定化した新規な
る固定化菌体を用いるアクリルアミドの製造法に関する
。

アクリルアミドは、高分子凝集剤、紙力増強剤、石油回
収用重合体、その他各種の重合体原料として多くの用途
を有している。

その製造法は、従来、例えばアクリロニトリルを還元状
態の銅を触媒として水と反応させて製造する方法が公知
である。

しかしながら、この方法は触媒調製の煩雑さ、再生の困
難さ、釦よび生成アクリルアミドの分離、精製の煩雑さ
など改良すべき種々の点を有している。

また、アクリルアミドのように分子内に２重結合を有す
る化合物は一般に重合しやすいため温和な条件下で製造
されることが望ましくもある。

このような状況にかんがみ、微生物を利用して温和な条
件下でアクリロニトリルを水和してアクリルアミドを製
造する方法を確立することは極めて有意義なことである
。

ニトリラーゼ活性を有する微生物がアクリロニトリルを
加水分解してアクリルアミドを生産する微生物として有
効であることは公知である。

このよう彦微生物として、これ１でにバチルス属、プレ
ボートの意味でのバクテリジウム属、ミクロコツカス属
、バーギーの意味でのブレビバクテリウム属などが知ら
れて耘り（特開昭５１−８６１８６号公報）、本発明者
らも、先に、コリネバクテリウム属、ノカルジア属など
に属する微生物を見出している（特開昭５４−１２９１
９０号公報）。

また、これらの微生物を使用してアクリロニトリルより
アクリルアミドを製造するには、これらの微生物由来の
菌体または酵素をそのま＼、あるいは重合体ゲルなどで
固定化した固定化菌体を用いて、水性媒体（例えば、水
、生理食塩水、リン酸塩緩衝液など）中でアクリロニト
リルと菌体とを接触反応させて行われる。

特に、最近、微生物反応では菌体からの不純物溶出の防
止、菌体の反応液からの分離性、菌体の反復利用性、酵
素安定性の増大などの点から粒状化した固定化菌体を用
いた回分法、連続カラム法などによる方法が普及してい
る。

微生物によるアクリルアミドの製造法にかいてもか＼る
方法が経済的に有利であり、本発明者らは、先にポリア
クリルアミドなどのゲルにて包括固定化した固定化菌体
を用いた連続カラム反応によるアクリルアミドの製造法
を提案した（特開昭５４−１４３５９３号公報）。

しかしながら、水性媒体として、上記のごとき生理食塩
水、リン酸塩緩衝液などを用いることは、生成するアク
リルアミド水溶液中に多量の塩化ナトリウム、リン酸塩
類などを含有させることになり品質上好ましくない。

特に、リン酸塩の存在は高重合度のアクリルアミド系重
合体を製造する際に、生成重合体の水不溶化を招きやす
いなど好ましくない結果をもたらす。

従って、これらの塩類を除去するためにイオン交換処理
などの後処理が不可欠となり、固定化菌体法によるアク
リルアミド製造の特徴でもある特別な精製工程を設けず
して高品質のアクリルアミド水溶液が得られるという利
点がなくｉシ安価なアクリルアミド製造法としての妙味
がなくなる。

また、一方において、水性媒体として生理食塩水、リン
酸塩緩衝液などを用いないと、反応時に固定化菌体が膨
潤し菌体の酵素活性が低下し易く、さらにカラム反応な
どの場合、通常使われるポリアクリルアミドによる固定
化菌体をカラム内に充填して、これにアクリロニトリル
の水溶液を通液させると反応開始後短時間のうちに、カ
ラム内の固定化菌体が膨潤してし１い円滑な運転ができ
なく女るなどの難点を有する。

このように、反応中に固定化菌体が膨潤する原因の詳細
は不明であるが基質溶液を流す際に負電荷を帯びた菌体
、担体ゲルの相互間に生ずる反発力によるものと考えら
れる。

また、膨潤現象による酵素活性の劣化は、膨潤により菌
体細胞内より酵素が漏出したり、菌体の正常な細胞内で
とっていた酵素の安定なコンホメーションがこわされる
ことなどによるものと考えられる。

従って、水性媒体として生理食塩水、リン酸塩緩衝液安
どの等張液を用いることにより、反応中に前記のような
現象が生じなくなるので固定化菌体の膨潤を防止できる
とともに酵素を安定に保つことができるものと考えられ
る。

本発明者らはか＼る観点から水性媒体として前記のよう
役塩類を含まない基質水溶液を用いても反応中に膨潤を
伴なわず、かつ、酵素安定性のよい固定化菌体を見出す
べく種々検討した結果、固定化用の担体（重合体）をカ
チオン性化し、重合体ゲルと菌体または酵素などとの親
和性を強めることにより、上記目的が達成されることを
見出し本発明に至った。

すなわち、本発明は、ニトリラーゼ活性を有する微生物
をカチオン性のアクリルアミド系重合体ゲルで固定化し
、塩類を実質的に含まない水性媒体中で該固定化菌体に
アクリロニトリルを作用せしめてアクリルアミドを製造
することを特徴とする新規なる固定化菌体によるアクリ
ルアミドの製造法を要旨とするものである。

本発明に用いる微生物は、アクリロニトリルを加水分解
してアクリルアミドを生成する能力を有するものであれ
ば微生物の分類学的位置づけに関係なくいずれも利用す
ることができる。

例えば、前記特開昭５４−１２９１９０号公報記載のコ
リネバクテリウム属Ｎ−７７１菌株（微工研菌寄第４４
４５号）、コリネバクテリウム属Ｎ−７７４株（微工研
菌寄第４４４６号）、カよびノカルジア属Ｎ−７７５菌
株（微工研菌寄第４４４７号）などを好適に挙げること
ができる。

また、本発明にむいて、酵素活性を有する菌体の態様と
しては、菌体培養液、洗浄菌体、菌体破砕物女どを挙げ
ることができる。

本発明で菌体を固定化するために用いるアクリルアミド
系カチオン性重合体とは、アクリルアミド、アクリルア
ミドと共重合可能々カチオン性のエチレン性不飽和単量
体釦よび水溶性架橋性単量体の共重合体であり、アクリ
ルアミドと共重合可能なカチオン性のエチレン性不飽和
単量体としては、例えばジアルキルアミノアルキルアク
リレート、ジアルキルアミノアルキルメタクリレート、
ジアルキルアミノアルキルアクリルアミド、ジアルキル
アミノアルキルメタクリルアミドによびこれらの四級化
物などがあり、具体的にはジメチルアミノエチルメタク
リレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメ
チルアミノプロピルメタクリルアミド、ジエチルアミノ
プロビルメタクリルアミドおよびこれらのジメチル硫酸
、塩化メチルなどによる４級化物などが挙げられる。

これらの単量体は１種または２種以上を混合使用するこ
とも可能である。

また、水溶性の架橋性単量体としては、例えばメチレン
ビスアクリルアミド、１．３−ジ−アクリルアミドメチ
ル−２−イミダゾリトン、ジアクリルアミドメチルエチ
レン尿素、ジアクリルアミドメチルエーテル、エチレン
グリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタ
クリレート、ヘキサヒドロ−１３，５−）リアシル−８
−トリアジンなどが挙げられる。

これらの単量体の量的関係は通常全単量体に対しアクリ
ルアミドが５０〜９５重量φ、カチオン性のエチレン性
不飽和単量体が１〜５０重量多、水溶性の架橋性単量体
が０．１〜２０重量饅重量る。

本発明に用いられる固定化菌体の調製法は、例えば、前
記、微生物菌体懸濁液、単量体などを混合し、これに通
常使われている重合用触媒、例えば過硫酸カリウム釦よ
びジメチルア□ノプロピオニトリルを加えｐＨ５〜１０
、好ましくは６〜８、温度Ｏ〜３０℃、好ましくは０〜
１５℃に３０〜６０分間保って重合ゲル化させることに
より行われる。

重合ゲル体中の菌体の含有量は使用する微生物の種類、
使用状態などにより異るが、通常０．１〜５０重量φ、
好ましくは１〜２０重量φである。

重合反応液中の単量体の含有量は２〜３０重量φ、好ま
しくは５〜２０重量φである。

また、固定化菌体ゲル調製にあたっては、前記のように
カチオン性部分を単量体として添加、共重合させる方法
の外、ゲル化が３こる範囲内でカチオン性単量体の１部
または全部をゲル作成前に水溶性重合体として添加して
からゲル化させることもできる。

また、ゲル作成前に添加する水溶性重合体としてはアク
リルアミドの１部を共重合したものであってもよい。

このようにして調製した固定化菌体は必要によりグルタ
ルアルデヒドなどの水溶性ジアルデヒドで硬化処理を行
い、好ましい大きさに成形して反応に供される。

本発明を実施するに当っては、前記のごとくして調製し
たカチオン性固定化菌体の適当な大きさの粒状物を反応
釜またはカラム内に入れ、基質水溶液として塩類濃度ｏ
、ｘ％以下、より好ましくは０．０１％以下の実質的に
アクリロニトリルのみの水溶液を用い反応させればよい
。

反応は使用する固定化菌体の量、アクリロニトリルの濃
度、基質水溶液の流速、その他適当な反応条件を見出す
ことによりは＼ｘｏｏ％の反応進行率で行うことができ
る。

この場合、固定化菌体のニトリラーゼ活性を長時間安定
に保たせると共にアクリル酸などの副生物の生成を抑制
することなどから、アクリロニ） １）ルの濃度は５饅
以下、反応温度は基質水溶液が凍結しない範囲のできる
だけ低温、すなわち１０℃以下氷点未満、ｐＨは７．０
〜８．５で行うことが好ましい。

本発明の方法によれば、基質水溶液として生理食塩水、
リン酸塩緩衝液などを用いなくても反応中に固定化菌体
の膨潤を招くこともなく、かつ、酵素活性を長時間安定
に保ちつつ反応を行うことができる。

特に、連続カラム反応にかいては上述の特徴の外、反応
中、往々にしてみられる生成アクリルアミドの反応器内
にかける重合トラブルＺども全くみられず安定した運転
を行うことができるという利点も加味される。

このようにして、反応生成液として無色透明なアクリル
アミド水溶液を得ることができる。

この水溶液は塩類などを実質的に含まず、かつ、重合に
悪影響を及ぼすその他の不純物も殆んど含まないので、
そのま＼あるいは通常の方法により濃縮して高分子凝集
剤、紙力増強剤などの各種用途の重合体製造用の原料と
して使用することが可能である。

以下、実施例によシ本発明を具体的に説明するなお、下
記実施例中の部および多は重量に関するまた、アクリロ
ニトリル、アクリルアミド々どの分析はいずれもガスク
ロマトグラフィーにより行った。

実施例１および比較例１ グルコース１％、へ７”トン０．５％、酵母エキス０．
３φおよび麦芽エキス０．３ ’％を含む培地（ｐＨ７
，２）により好気的に培養して調製したＮ−７７４菌株
の洗浄菌体（乾燥菌体弁２０％）５０部、アクリルアミ
ド４．２部、ジメチルアミノエチルメタクリレートの塩
化メチル４級化物０．４部、メチレンビスアクリルアミ
ド０，４部および０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，
５以下同じ）３０部を混合して均一な懸濁液とした。

これに５％ジメチルアミノプロピオニトリル水溶液５部
、督よび２．５％過硫酸カリウム水溶液１０部を加え１
０℃以下に１時間保って重合ゲル化させた。

かくして得られた塊状の菌体含有ゲルをブレンダー（日
立ＶＡ−１０Ｐ）にて小粒子に破砕し、０．０５Ｍリン
酸塩緩衝液３００部、５０φグルタルアルデヒド水溶液
０．５部と混合して攪拌下に１０℃以下で３０分間グル
タルアルデヒド処理をした。

これを水洗し、反応用固定化菌体試料とした。

この試料１０部、および水９０部を混合し、攪拌下にｐ
Ｈを７．５に保ちつつアクリロニトリルを１時間当り２
部の割合で断続的に滴下し１０℃で６時間反応を行った
。

反応はは＼定量的に進行し１４．６％のアクリルアミド
水溶液１１０部を得た。

このような方法により、くり返し反応を行ない反応終了
後の固定化菌体の残存活性を測定した。

また、比較のため、通常のポリアクリルアミドによりつ
くった固定化菌体、すなわち、固定化菌体調製時の単量
体配合割合をアクリルアミド４．６部、メチレンビスア
クリルアミド０．４部とした以外は上述の方法と全く同
様にしてつくった固定化菌体を用い上記同様に反応を行
い、反応終了後の固定化菌体の残存活性を測定した。

その結果を第１表に示した。

なか、活性測定は下記の要領で行った。

すなわち、固定化菌体試料を乳鉢で十分にすりつぶした
後、これを０．１ Ｍ リン酸塩緩衝液で希釈し菌体濃
度０．１％の懸濁液をつくる。

この懸濁液５ｍｌと５％アクリロニトリル水溶液５ｍｌ
を混合し１０℃で１０分間反応させる。

この時に生成したアクリルアミドを定量し、反応使用前
の固定化菌体について同様に行った時の値に対する割合
で活性を表わした。

実施例２訃よび比較例２ 実施例１で用いたＮ−７７４菌株のアクリルアミド−ジ
メチルアミノエチルメタクリレートの塩化メチル４級化
物共重合体ゲル固定化菌体４ｏ部を外とう管付きガラス
カラム内に充填し、５℃にてカラム上部より４饅アクリ
ロニトリル水溶液（炭酸ナトリウムにてｐＨ７，５に調
整）をＳＶｏ、８ｈｒ ’で流下、反応させた。

反応中力ラム内の固定化菌体粒子の膨潤はみられず、見
掛の充填体積も殆んど変らずに長期間安定して運転を行
うことができ、カラム下部より流出液として無色透明の
アクリルアミド水溶液が得られた。

なか、反応開始５日後の流出液を分析したところ、５．
４％のアクリルアミドを含みアクリロニトリルは全く検
出されなかった。

一方、比較のため従来公知のポリアクリルアミドゲルに
より包括固定化されたＮ−７７４菌株の固定化菌体を用
いて上と同様のカラム反応を行ったところ、反応開始後
まもなくして固定化菌体ゲルが膨潤しはじめ円滑な運転
ができなくなった。

また、反応開始５日後にこの膨潤した固定化菌体の活性
を測ったところ初期の約１／１ｏに減少していた。

実施例３〜８および比較例３ 実施例１の方法により製造したＮ−７７４菌株の洗浄菌
体から固定化菌体ゲルを調製するにあたり、重合用の単
量体としてアクリルアミド、ジメチルアミノエチルメタ
クリレート、メチレンビスアクリルアミドのうち、アク
リルアミドとジメチルアミノエチルメタクリレートの割
合をいろいろに変えて重合ゲル化を行い、これらの組成
比の異なった固定化菌体を調製した。

なお、固定化菌体の調製は重合時系内を窒素置換した以
外は実施例１と同様の方法で行った。

これらの固定化菌体について、実施例１と同様の方法、
条件で回分反応によりアクリロニトリルからアクリルア
ミドの生成反応をくり返し行った。

この時のく９返し反応回数と残存活性を測定し第２表に
示した。

表にみるごとくジメチルアミノエチルメタクリレートを
共重合することにより酵素安定性がよくなっていること
が分る。

実施例 ９〜１４ 実施例１の方法により製造したＮ−７７４菌株の洗浄菌
体について第３表に掲げた重合体組成の固定化菌体を調
製した。

なお、実施例１１〜１４にかいては、予め作成したカチ
オン性の水溶性重合体の存在下に重合ゲル化を行い固定
化菌体を調製した。

これらの固定化菌体を用い実施例１にしたかってアクリ
ロニトリルよりアクリルアミド生成の回分反応をくり返
し行い、反応終了後の各固定化菌体の残存活性を測定し
た。

その結果を第３表に示した。

この表より本発明による固定化菌体は塩類などを実質的
に含まない基質溶液中でも菌体の酵素活性が長時間安定
であることが分る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ニトリラーゼ活性を有する微生物をカチオン性のア
   クリルアミド系重合体ゲルで固定化し、塩類を実質的に
   含まない水性媒体中で該固定化菌体にアクリロニトリル
   を作用せしめてアクリルアミドを製造することを特徴と
   する新規なる固定化菌体によるアクリルアミドの製造法
   。 ２ 固定化菌体が、ニトリラーゼ活性を有する微生物の
   水性懸濁液中でアクリルアミド、アクリルアミドと共重
   合可能なカチオン性のエチレン性不飽和単量体訟よび水
   溶性の架橋性単量体の混合物を重合させて得たものであ
   る特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ 固定化菌体が、ニトリラーゼ活性を有する微生物の
   水性懸濁液中で水溶性カチオン性重合体の存在下にアク
   リルアミド耘よび水溶性の架橋性単量体、あるいはさら
   にアクリルアミドと共重合可能なカチオン性のエチレン
   性不飽和単量体の混合物を重合させて得たものである特
   許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ４ アクリルアミドと共重合可能なカチオン性のエチレ
   ン性不飽和単量体が、ジメチルアミノエチルメタクリレ
   ート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメチル
   アミノプロピルメタクリルアミド、ジエチルアミノプロ
   ピルメタクリルアミド釦よびこれらの第４級化物よりｉ
   る群から選ばれた少なくとも１種の単量体である特許請
   求の範囲第２項または第３項記載の製造法。 ５ 水溶性カチオン性重合体が、ジメチルアミノエチル
   メタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート
   、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、ジエチル
   アミノプロビルメタクリルアミド釦よびこれらを第４級
   化して得られる単量体の単独重合体、トよび該単量体の
   １種または２種以上とアクリルアミドとの共重合体より
   なる群から選ばれた少なくとも１種の重合体である特許
   請求の範囲第３項記載の製造法。