JPH01269493A - 酵素の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、医薬品、食品及びその他の酵素反応を利用す
る分野で、いわゆるバイオリアクターとして使用するの
に適した酵素の固定化方法に関する。

従　技術とその問題点 酵素反応を利用する医薬品や食品の製造プロセスは、近
年急速に発展してきたが、従来、その多くば、水溶液中
で酵素と基質を反応させて、目的とする生成物を得る方
法であって、反応条件の管理、酵素の補給、反応後にお
ける生成物と酵素の分離、及び酵素の回収等の緊結な操
作を含んでおり、加うるに、反応を回分式で行うため生
産性が劣るという問題があった。

而して、最近このような問題点を改善するために、酵素
を担体内に固定した固定化酵素を承質と接触させること
により、上述の繁雑な操作から解放されると共に、生産
性を高めることが可能となった。

この固定化酵素の製造法の一つとして、水不溶性の樹脂
に酵素を共有結合、イオン結合又は、物理的吸着によっ
て結合させることから成る担体結合法が良く知られてい
る。これらの方法のうち、特に、水不溶性樹脂として、
イオン交換能を存する樹脂を用いて、該樹脂に酵素をイ
オン結合により固定する方法が多く報告される。

この目的に使用されるイオン交換樹脂としては、これま
でにも、蛋白質の回収又は精製等に用いられているポア
サイズの大きな陰イオン交換樹脂が知られているが、こ
れらの従来のイオン交換樹脂では、酵素の様に分子量が
１０万〜２０万もある巨大蛋白粒子を固定化する場合、
酵素の固定化能が小さく、必要な活性を有する固定化酵
素を得る為には、大量の樹脂を必要とし、固定化酵素の
製造コストを、高めているという欠点があった。

ｙ口片〃〕Ｌ法−見呵テ支ｙる課題 本発明は、従来のイオン交換樹脂の欠点をおぎなう目的
で、陰イオン交換能を有する活性基として、アミン基及
び／又は第四級アンモニウム塩基を有し、旧つ、親水性
で水中にて膨潤して１０〜１０００倍にその体積を増大
することのできろ水膨潤性樹脂を用いることにより、少
量の樹脂で、大きな酵素活性を発揮する、バイオリアク
ターにも有効に用いることのできる固定化酵素を製造す
るための酵素の固定化方法を提供することを課題とする
。

以下本発明の詳細な説明する。

課題を解決するための手２没 本発明は上記課題を解決するために次のような特徴的事
項から構成されている。すなわち、本発明は下記式で表
されるカチオンモノマー単位を１０重量％以」二含有す
るカチオン性高分子架橋物を水の存在下に酵素と接触さ
せて酵素を固定化することを特徴とする。

Ｃ−Ａ−Ｂ−Ｎ−Ｒ４Ｘ １１］ ○　　　　　Ｒ３ 〔但し、Ａは０又はＮｉｌ　、ＢはＣ２Ｈ，、Ｃ３１１
６又はＣｌ、、Ｃｌｌ０ＩＩＣＨ２、Ｒ，は水素又はメ
チル基、Ｒ２及びＲ３はメチル基又はエチル基、Ｒ４は
水素、メチル基、エチル基、ヘンシル基又は３クロロ２
ヒドロキシプロピル基、Ｘ　はアニオン（対イオン）を
表わす。〕 また、本発明は上記カチオン性高分子架橋物が、その乾
物重量当り１０〜１０００倍の水を吸収し、酵素を内包
する高分子ゲルとなる事も特徴とする。

さらに本発明は、酵素を内包する上記カチオン性高分子
架橋物から成る高分子ゲルをアルデヒド化合物と反応さ
せる事を特徴とする。

本発明による酵素の固定に用いるバイオリアクター担体
用の高分子ゲルとしては、アクリル系カチオンモノマー
単位を１０重量％以上含有するカチオン性高分子架橋物
が有効である。

かかる高分子架橋物の製造は、モノマー重合時にジビニ
ル化合物を共重合せしめる方法の他、水溶性カチオン高
分子を多官能化合物と反応させ、架橋結合を生しさせる
ことによっても製造できる。

高分子ゲルの製造に使用できるアクリル系水溶性カチオ
ンモノマーとしては、ジアルキルアミノアルキル（メタ
）アクリレート、ジアルキルアミノアルキル（メタ）ア
クリルアミドの三級アミン塩及び／又は四級アンモニウ
ム塩である。三級アミンの四級化にはジメチル硫酸、ジ
エチル硫酸、塩化メチル、塩化ベンジル、エピクロルヒ
ドリン等が用いられる。これらのカチオンモノマーは一
種類のめの単独重合ばかりでなく、上記のカチオンモツ
マー内から選ばれる複数のモノマーを共重合することも
でき、又は（メタ）アクリルアミド等のアクリル系水溶
性ノニオンモノマーを金子ツマ−に対し９０重量％以下
共重合させることも可能である。

また、吸水倍率とゲル強度を阻害しない範囲で、アクリ
ル酸、ジアセトンアクリルアミド、Ｎ−Ｎジアルキルア
クリルアミド、Ｎ−ビニルカルボン酸アミド、アリルア
ミン、アクリコニ１〜リル、酢酸ビニル等の各種モノマ
ーを共重合させること、さらに中和あるいは加水分解等
の変性を行う事も本発明を逸脱するものでない。

それらのアクリル系カチオンモノマーを重合してできる
ポリマーは高分子量であるため高吸水倍率であるにもか
かわらずゲル強度の大きい高分子ゲルが得られる。

本発明によるカチオン性高分子架橋物は純水中における
吸水倍率が乾物重量当り１０倍以上１０００倍以下であ
ることが望ましい。吸水倍率の高ずぎるポリマーはゲル
強度が弱く、吸水倍率の低すぎるポリマー４Ｊ酵素固定
に不適である。

上記ポリマーに適度の吸水倍率を付与するのに必要な架
橋剤の量は全モノマー単位当り０．０１〜２重量％であ
り、ジビニル化合物の共重合、または後架橋、或は両者
の（ｎ用により高分子鎖間に架橋結合を生せしめる。

共重合に用いるジビニル化合物としてはＮ、Ｎ−メチレ
ンビスアクリルアミドが代表的であり、（ポリ）エチレ
ングリコ−ルジ（メタ）アクリレート、Ｎ−アリルアク
リルアミド、トリアクリルポルマール、ジビニルヘンゼ
ン等があげられる。

後架橋に用いる多官能化合物としては、エピクロルヒド
リン、ジグリシジルアミン、ジグリシジルエーテル等の
アミンと反応する物質ばかりでなく、ホルムアルデヒド
のような共重合アクリルアミド、−級アミン等と反応す
るアルデヒド類も有効である。

本発明に従って固定し得る酵素については、特に限定さ
れることなく、はとんど全ての酵素に適応することがで
きる。例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、トリプ
シン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、パンクレ
アチン、アミノアシラーゼ、ヌクレアーゼ、リボヌクレ
アーゼ、ＡＴＰデアミナーゼ、ホスファターゼ、ストレ
プトキナーゼ、アビラーゼ（ＡＴＰ−ジキスファターゼ
）、ＡＴＰクレアチンリン酸転移酵素、ペクチナーゼ、
マルターゼ、ラクターゼ、ウレアーゼ、タンナーゼ、リ
パーゼ、グルコースイソメラーゼ、メリビアーゼ、アル
ドラーゼ、セルラーゼ、アルドラ−ゼ、ナリンジナーゼ
、グルコースオキシダーゼ、アスパラキシダーゼ等を挙
げることができ、これらはいずれも本発明の高分子ゲル
に簡易に固定し得る。

本発明によるカチオンポリマーを乾燥状態で酵素水溶液
中６千添加すると吸水により酵素を内包する高分子ゲル
を与える。あるいは予め吸水させた高分子ゲルを等電点
以上のｐＨにおいて酵素溶液と接触せしめ、イオン結合
により酵素を内包固定することができる。

さらに望ましくは酵素を内包した高分子ゲルにイオン結
合による架橋剤を反応させることにより、酵素は強固に
ゲル内に固定され、長期間使用しても流出は極めて少な
い。

この様な目的に用いられるイオン結合による架橋剤とし
ては、化学的結合による酵素の固定化のための架橋法に
用いられる架橋剤が用いられ、ゲルタールアルデヒド、
グリオキザール、ペプチド結合するイソシアナート誘導
体、ジアゾカップリングするビスジアゾヘンゼン或はＮ
、Ｎ’−エチレンビスマレイミド等を例示し得る。なお
、これらのうち、ゲルタールアルデヒドが最も一般的で
ある。

活性水素を有する窒素化合物、例えばアンモニア、アル
キレンジアミン等が高分子ゲル内に共存すると、上記架
橋剤による酵素固定に有利に寄与する。

本発明による高分子ゲルは酵素蛋白粒子が容易に流入で
きる、架橋密度の低い網目状高分子構造を有するカチオ
ン性高分子架橋物がら成る事を特徴とする。架橋密度が
適切であるため、酵素は高分子ゲル内に流入し容易に内
包される。通常のアニオン交換樹脂の如く表面吸着のみ
ではないため酵素固定の効率は高い。

本発明のカチオンポリマーはアクリル系であるため、高
重合度の架橋物が得られることから、架橋密度が低いに
もかかわらずゲル強度は高い。

酵素は等電点以上のｐｎにおいて負に帯電しているため
カチオン高分子ゲルに内包された酵素は容易にイオン結
合を生し固定される。さらにアルデヒド処理を行う事に
より酵素蛋白の固定は一段と強力になる。これは酵素蛋
白の高分子量化現象およびゲル中のポリマーセグメント
を包含した形状で酵素間の縮合反応に起因するものと考
えられる。

次に、本発明による酵素の固定化方法を実施例により具
体的に説明する。なお、この発明は、その特許請求の範
囲に記載された事項による技術的思想の範囲内において
種々に設計変更できるものであり、下記の実施例に限定
されるものでないことは勿論である。

去施炭 カチオン性高分子架橋物の合成： 合成例１ 攪拌機、温度計、還流冷却器、窒素導入管を備えた５０
０ｍ　ｌ！の五つ口のセパラブルフラスコに、シクロヘ
キサン２００ｇを仕込み、エチルセルロース１ｇを加え
、６０℃に加温して溶解させ、窒素ガスを通して酸素を
除いた。

メタクリロイロキシエチルトリメチルアンモニウムクロ
リドの８０％水？容ン夜７５ｇに、Ｎ、Ｎ−メチレンビ
スアクリルアミドの１０％水溶液を６．０ｍβと２．２
’−アゾビス（２−アミジノプロパン）塩酸塩の１０％
水溶液を１．２ｍβ加えたものを滴下ロートに仕込み、
窒素ガスを通して酸素を除いた。これを攪拌下シクロヘ
キサン中に徐々に滴下し、重合を行った。

６０°Ｃで３時間重合した後、還流冷却器を共沸水骨分
離器に替え、フラスコ中で攪拌下、外温８ｏ〜９０°Ｃ
の湯浴にて共沸脱水を行った。十分に脱水した後、ポリ
マー粒子を濾別し、シクロヘキサンを乾燥により除き、
ビーズ状の吸水性樹脂を得た。

粒径０．４〜０．５ｍｍの樹脂を篩い分け、蒸留水を吸
水させたところ、乾物重量当り３５倍の水を吸収した。

この樹脂を試料−１とする。

合成例２ 攪拌機、温度計、還流冷却器、窒素導入管を備えた５０
０ｍ　１２の五つ口のセパラブルフラスコに、シクロヘ
キサン２００ｇを仕込み、エチルセルロース１ｇを加え
、６０℃に加温して熔解させ、窒素ガスを通して酸素を
除いた。

Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド５ｇと
アクリルアミド４５ｇをイオン交換水５０ｍ　７！に溶
解し、Ｎ、Ｎ−’、！チレンビスアクリルアミドの１０
％水溶液０．５ｍｊ＋と２，２゛−アゾビス（２−アミ
ジノプロパン）塩酸塩の１０％水溶液を１．２ｍｌ加え
たものを滴下口一トに仕込め、窒素ガスを通して酸素を
除いた。

これを攪拌下シクロヘキサン中に徐々に滴下し、重合を
行った。

以下合成例１と同様の操作を行い、得られた樹脂に蒸留
水を吸水させたところ、乾物重量当り４１倍の水を吸収
した。

この樹脂を試料−２とする。

合成例３ 容量３００ｍ　ｌで且つ窒素導入管を備えた蓋付きガラ
ス製容器に、１２５ｇの８０％アクリロイロキシエチル
トリメチルアンモニウムクロリド水溶液を計量して入れ
、０．０５ｇのメチレンビスアクリルアミドを熔解した
。

次いで、該分散液を６０℃に加温し、窒素置換した後、
２，２゛−アゾビス（２−アミジノプロパン）塩酸塩の
１０％水溶液を３ｍＡ添加混合し、６０℃で５時間保温
し、重合を継続した。重合後、塊状物を取り出し、厚さ
５’ｍｍのシートに切り、１００°Ｃの通風式乾燥機内
で乾燥した。この乾燥物をミル式粉砕機を用いて、粉砕
した。

粒径０．４〜０．５ｍｍの樹脂をふるい分け、蒸留水を
吸水させたところ、乾物重量当り２７０倍の水を吸収し
た。

この樹脂を試料−３とする。

合成例４ 容量３００ｍ　ｉ！で且つ窒素導入管を備えた蓋付ガラ
ス製容器にＮ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルア
ミト２ｇとアクリルアミド１８ｇをとりイオン交換水１
８０ｍ　＋８に溶解し、硫酸にてｐｎ　４．５に調整し
た液を窒素置換した後、過硫酸アンモニウム１％水溶液
０．２ｍｊ！と亜硫酸水素ナトリウム１％水溶液０．２
ｍ＃を添加混合し、重合を行った。５時間後、得られた
重合物水溶液にホルマリンの１００倍希釈液２０ｍ　Ｉ
ｌを均一に混合した後、直径１５ｃｍのシャーレに移し
替え、１１０℃の通風乾燥機にて乾燥した。

この乾燥物をミル（ｍｉｌｌ）式粉砕機で粉砕した。次
いで粒径０．４〜０．５ｍｍの樹脂をふるい分は蒸留水
を吸水させたところ、高分子架橋物が乾物重量当りの３
０倍の水を吸収した。

この樹脂を試料−４とする。

比較合成例Ｉ Ｎ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミド６ｇをメタクリロ
イロキシエチルトリメチルアンモニウムクロリドの６０
％水溶液１００ｍβに溶解し、実施例１と同様の操作に
よりビーズ状の吸水性樹脂を得た。この樹脂は乾物重量
当り５．１倍の蒸留水を吸収した。

この樹脂を比較試料−１とする。

比較合成例１ 市販の強塩基性イオン交換樹脂アンバーライトＩＲＡ−
９０Ｘ（オルガノ社製）Ｉｇを用いて以下に述べる試験
に供した。

この樹脂を比較試料−２とする。

酵素の固定化： 実施例１ 前述の合成例における各試料の乾物１ｇを採取して、蒸
留水１１に膨潤させた後、濾過し、さらにそれを１βの
０．０５モルのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）に懸
濁分散した後濾過する。次いで再度０．０５モルのリン
酸−クエン酸緩衝液１００ｍ　Ｒ中に市販のインへルタ
ーゼ液（三共株式会社製）２０ｍ　ｌを加え、３時間室
温にて攪拌しながら固定化を行った。次いで、これを濾
別して、再度０．０５モルのトリス塩酸塩緩衝液１１に
懸濁分散させて濾別することにより、固定化酵素を得た
。

得られた固定化酵素を濃度０．０５モルのクエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ４，２）に熔解したサッカロースの１
０％溶液ｌｌ中に添加して４０℃において６０分間反応
させ、形成されただ還元糖量をメチレンブルー法により
求め、樹脂乾物１ｇによる１時間当りのサッカロース分
解量（ｇ）を表１に示す。

表１　乾燥樹脂１ｇ当りのサッカロース分解能実施例２ 前述の合成例における試料の乾物１ｇを採取し蒸留水１
！に膨潤させた後濾過し、さらに０．０５モルのホウ酸
ナトリウムー塩酸緩衝液（ｐＨ６，０）に懸濁分散した
後濾過する。グルコースイソメラーゼ溶液（長潮社製）
を透析処理後３倍に希釈した液１００ｍ／中に投入して
室温にて２時間ゆるやかに攪拌した後濾過する。

得られた固定化酵素を濃度０．１モルのリン酸緩衝液に
溶解したグルコースの４０％溶液１ρ中に添加し、６０
゛Ｃにて１時間反応させ、その結果形成されたフラクト
ース量をＨＰ　Ｌ　Ｃ法により求め、樹脂乾物１ｇによ
る１時間当りの転換フラクトース量を表２に示す。

表２　乾燥樹脂１ｇ当りのグルコース転換能実施例３ 実施例２により得られた固定化酵素をゲルタールアルデ
ヒドを０．６％含有する濃度０．０５モルのホウ酸すト
リウム緩衝液１００ｇに浸漬し、室温にて１．５時間放
置することによりアルデヒド処理を行つた。アルデヒド
処理をした試料と未処理の試料をそれぞれ１０％ＮａＣ
］水溶液１β中に投入し１時間攪拌した後水洗し、酵素
活性を求めた結果を表３に示す。

出願人　株式会社共立有機工業研究戸

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式で表されるカチオンモノマー単位を１０重
   量％以上含有するカチオン性高分子架橋物を水の存在下
   に、酵素と接触させる事を特徴とする酵素の固定化方法
   。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔但し、Ａは０又はＮＨ、ＢはＣ＿２Ｈ＿４、Ｃ＿３Ｈ
   ＿６又はＣＨ＿２ＣＨＯＨＣＨ＿２、Ｒ＿１は水素又は
   メチル基、Ｒ＿２及びＲ＿３はメチル基又はエチル基、
   Ｒ＿４は水素、メチル基、エチル基、ベンジル基又は３
   クロロ２ヒドロキシプロピル基、Ｘ＾−はアニオン（対
   イオン）を表わす。〕
2. （２）カチオン性高分子架橋物が純水中において、その
   乾物重量当り、１０〜１０００倍の水を吸収する事を特
   徴とする請求項（１）項記載の酵素の固定化方法。
3. （３）上記請求項（１）項記載の固定化方法において、
   酵素との接触により酵素を内包させた上記カチオン性高
   分子架橋物から成る高分子ゲルをイオン結合による架橋
   剤と反応させることを特徴とする酵素の固定化方法。