SU755296A1

SU755296A1 - Способ получения активированных носителей для иммобилизации биологически активных веществ 1

Info

Publication number: SU755296A1
Application number: SU782600204A
Authority: SU
Inventors: Indulis V Gruzin; Avgust K Aren; Valda U Bukbarde; Ruta A Melngalve; Oyar A Vitols; Alda Ya Rankevitsa
Original assignee: Indulis V Gruzin; Avgust K Aren; Valda U Bukbarde; Ruta A Melngalve; Oyar A Vitols; Alda Ya Rankevitsa
Priority date: 1978-04-04
Filing date: 1978-04-04
Publication date: 1980-08-15

Description

Изобретение относится к химической, микробиологической промышленности и может быть использовано при получении активированных носителей _ςдля иммобилизации биоактивных веществ/ в частности ферментов. Иммобилизованные ферменты используют в качестве биохимических реактивов, лекарственных препаратов, а также в химической, | микробиологической и пищевой промышленности, как гетерогенные катализаторы .

Из большого числа носителей наибольшее внимание заслуживают органоминеральные материалы,ь частности покрытые полимерами пористые кремнеземные носители. Носители такого типа характеризуются хорошими гидродинамическими свойствами и достаточной стабильностью получаемых препаратов. Свойства получаемых препаратов во многом зависят от метода нанесения и активации полимерного слоя на-носителе.

Известны способы получения модифи-2 цированных твердых носителей путем покрытия поверхности носителя полиакролеином [1, 2].

Слой полимера образуется на поверхности носителя в результате пропиты- 3

2

вания носителя мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Полимеризация происходит на поверхности носителя. Иммобилизация фермента производится за счет реакции между альдегидными группами носителя и аминогруппами фермента.

Недостатком этих способов является малая операционная стабильность получаемых активированных носителей. По крытие неорганического материала линейными полимерами, образующимися при полимеризации винильных полимеров, не обеспечивает достаточную нераствори.мость и, следовательно, стабильность •получаемых ферментных препаратов, не скрепляет неорганическую основу носителя. Кроме того,' модификация носителя ограничена только альдегидосодержа щими полимерами, а связывание ферментов только через альдегидные группы не всегда дает возможность получить активные препараты и не обеспечивает высокого содержания белка на единицу носителя.

Известен способ, в котором для иммобилизации ферментов используют стек лянные шарики, покрытые слоем полималеинового ангидрида [3] .

3

755296

4

Связывание белка осуществляется реакцией с ангидридными группами подималеинового ангидрида, нанесенного непосредственно на поверхность стеклянных шариков.

Недостатком известного способа является то, что покрытие полимерным 'слоем поЛималеинового ангидрида не ртабилизирует поверхность неорганической основы, так как используется линейный,, легко набухающий и раство- «« ряющийся в воде полимер. Активные группы расположены непосредственно у поверхности носителя, что снижает подвижность фермента, приводит к изменению его пространственного,строения и потере'активности. Вследствие 15 малой поверхности стеклянных шариков получают носители-с низким содержанием активных ангидридных групп.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является спо- 20 соб получения активированных носителей, согласно которому'макропористые кремнеземные материалы пропитывают эпоксидной смолой с последующим образованием поверхностных аминных 25 групп полиэтиленполиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:2 при 100-120°С в течение . не менее 1 ч [4] .

Активацию проводят п-бензохиноном 33 и получают носитель, содержащий до 0,2мг экв/г активных аминогрупп. Данный способ позволяет получать активированные носители с повышенной операционной стабильностью, в которых ^5 внутренняя поверхность пор покрыта слоем водонерастворимого полимера, . содержащего аминные реактивные группы. Полученные нерастворимые ферментные препараты отличаются стабильностью при хранении. Однако прототип об- 40 ладает следующими недостатками:

в качестве поверхностных групп носителя используют только аминогруппы, что не позволяет использовать множество известных способов, разрабо- 45 тайных для активации поверхностных· гидроксильных групп на органических носителях;

так как для образования поверхностных аминных групп используют поли- 5θ этиленамин, имеющий относительно низкую среднюю молекулярную массу (до 150), то получают носители с относительно низким содержанием реакционноспособных аминных групп на поверхности (0,2 мг-экв/г).

Целью изобретения является расширение ассортимента носителей и получение носителей с повышенной активностью.

Поставленная цель достигается тем, 60 что в способе поучения активированных носителей для иммобилизации био- . логически активных веществ пропиткой неорганического носителя эпоксидной смолой, нанесением поверхностных ак- 65

тивных групп путем обработки аминосодержащим агентом и активацией в качестве аминосодержащего агента используют триэтиламин, обработку прово дят в присутствии 1-10%-ного раствора поливинилового спирта, а активацию - акролеином или тиогликолевой 'кислотой, или эпихлоргидрином, или цианурхлоридом или гексаметилендииэоциаиатом.

Отличительными признаками изобрете ния являются использование 1-10%-ного раствора поливинилового спирта в присутствии · триэтиламина для получения поверхностных активных групп и применение в качестве активаторов акролеина или тиогликолевой кислоты,или эпихлоргидрина, или цианурхлорида или гексаметилендиизоцианата.

Способ позволяет получить неорганические носители, содержащие реакционноспособные поверхностные гидроксильные группы, для активации которых перечисленные выше химические реагенты можно использовать.

Реакции этих реагентов с поверхностными аминными группами часто не протекают количественно, так как аминные группы в растворах склонны к протонированию: ΚΝΗ2+ Η⁴ -* ΚΝΗ^,.

Такие протонированные аминные труп пы не способны к взаимодействию с активаторами носителей, что.приводит к снижению активности полученных носи телей. При использовании содержащих гидроксильные группы носителей подобное явление не наблюдается и реакции активации протекают с большими выходами. Кроме того, при отверждении про· питанного эпоксидной смолой неорганического материала полиэтиленполиамином получают носители, аминные группы которых находятся в непосредственной близости к поверхности неорганического материала, так как молекулярная · масса полиэтиленполиамина в среднем составляет около 150. Это способствует сорбционному взаимодействию иммобилизованного фермента с поверхностью неорганического материала и изменению его пространственной конфигурации к потери активности. При использовании в качестве отвердителя поливинилового спирта,молекулярная масса которого составляет 10000-150000.получают носители с большим содержанием гидроксильных групп, которые удалены от поверхности неорганического материала на значительное расстояние. Это способствует повышению активности иммобилизационных ферментов, так как исключается сорбционное взаимодействие с неорганическим материалом.

1%>и. использовании в качестве отвердителя полиэтиленполиамина степень удаления концевой аминной группы от поверхности неорганического материала соответствующая степени полимеризации полиэтиленполиамина, в среднем не пре5

755296

6

вышает 3 элементарных звеньев. В то же время, если отверждение проводить избытком поливинилового спирта, т.е. « 1-10%-ным раствором поливинилового спирта, концевые гидроксильные группы полученного носителя удалены от поверхности на расстояние, соответствующее степени полимеризации поливинилс/вого спирта, что может составить до 3000 элементарных звеньев.

Таким образом, предлагаемый способ получения высокоактивных носителей исключает сорбционное взаимодействие ферментов с поверхностью.

, Носители, получаемые по предлагаемому способу, содержат значительно больше поверхностных активных групп, чем носители, получаемые по способупрототипу: 0,4-1,4 мГ’Экв/г ОН-групп против 0,2 мг экв/г аминных групп в прототипе.

Высокая концентрация активных поверхностных гидроксильных групп позволяет использовать для активации множество химических реагентов и тем самым расширить ассортимент активированных носителей для иммобилизации биологически активных веществ.

Получение активированных веществ по данному способу производится следующим образом.

В колбу загружают силохром или силикагель и раствор эпоксидной смолы в ацетоне. Систему подключают к вакууму на 15 мин для удаления воздуха из пор носителя. После выпаривания растворителя добавляют 1-10%ный водный раствор поливинилового спирта, триэтиламин и нагревают на масляной бане при 90-100°С в течение 5 ч, фильтруют и промывают горячей водой и ацетоном. Сушат при 80°С. После этого проводят активацию.

П р и м е р 1. В колбу емкостью 2 л загружают 200 г силохрома С-80 и раствор эпоксидной смолы в ацетоне (20 г¹смолы на 700 мл ацетона).После выпаривания растворителя при 100°С добавляют 1000 мл 5%-ного водного раствора поливинилового спирта, 5 мл триэтиламина и нагревают на масляной бане при 100°С в течение 5 ч.

Фильтруют и промывают горячей водой, ацетоном, а затем сушат при 80°С. Получают носитель, содержащий 1,4 мг экв/г гидроксильных групп.

К 20 г полученного носителя добавляют 120 мл фосфатного буферного раствора (рН 8,3) и выдерживают в течение 0,5 ч. Прибавляют 30 мл 95%-ного этилового спирта, 9 г η-бензохинона и'перемешивают. Оставляют, на 1 сут при комнатной температуре. Промывают 20%-ным раствором этилового спирта, водой, 1 н. раствором хлористого натрия и водой. Сушат при 100°С. Получают активированный носитель, содержащий 0,44 мг экв/г хиноновых-групп.

10

15

20

25

30

35

40

55

60

65

45

50

Пример 2. В колбу емкостью 2 л загружают 200 г силикагеля МСА-750 и раствор эпоксидной смолы в ацетоне (60 г смолы на 700 мл ацетона). Систему подключают к вакууму на 15 мин. После выпаривания растворителя при 100°С добавляют 1000 мл 10%-ного вод-; ного раствора поливинилового спирта,

5 мл триэтиламина и нагревают на масляной бане при 100°С в. течение 5 ч. Фильтруют и промывают горячей водой. Потом промывают ацетоном и сушат при 80°С. Получают носитель, содержащий 0,9 мг·экв/г гидроксильных групп.

К 20 г полученного носителя добавляют 120 мл фосфатного буферного раствора (рН 8,3) и выдерживают в течение 0,5 ч. Прибавляют .30 мл 95%-ного этилового спирта, 9 г п-бенэохинона и перемешивают. Оставляют на 1 сут при комнатной температуре. Промывают 20%-ным раствором этилового спирта, водой, 1 н. раствором хлористого натрия и водой. Сушат при 100°С. Получают носитель, содержащий 0,18 мг экв/г активных бензохиноновых групп.

Пример З.В колбу емкостью 2 л загружают 200 г силикагеля МАС1500 и раствор эпоксидной смолы в ацетоне (2 г смолы на 700 мл ацетона) . Систему подключают к вакууму на 15 мин. После выпаривания растворителя при 100^с)С добавляют 1000 мл 1%-ного водного раствора поливинилового спирта, 5 мл триэтиламина и нагревают на масляной бане при 90°С в .течение 5 ч. Фильтруют и промывают горячей водой, ацетоном и сушат при 80 С. Получают носитель, содержащий 0,4 мг·экв/г гидроксильных групп.

К 20 г полученного носителя добавляют 120 мл фосфатного буферного раствора (рН 8,3) и выдерживают в течение 0,5 ч. Прибавляют 30 мл 95%-ного этилового спирта, 9 г Ν-бензохинона и перемешивают. Оставляют на 1 сут при комнатной температуре. Промывают 20%-ным раствором этилового спирта, водой, 1 н. раствором хлористого натрия и водой. Сушат при 100°С. Получают активированный носитель, содержащий 0,1 мг-экв/г хиноновых групп.

Пример 4.В колбу емкостью 2 л загружают 200 г силохрома СХ-2,5 и раствор эпоксидной смолы в ацетоне (20 г смолы на 700 мл ацетона). Систему подключают к вакууму на 15 мин. После выпаривания растворителя при 100°С добавляют 1000 мл 5%-ного водного раствора поливинилового спирта, 10 мл триэтиламина и нагревают на мае ляной бане при 100°С в течение 5 ч. Фильтруют,- промывают горячей водой и ацетоном, сушат при 80°С. Получают носитель, содержащий 1,2 мг·экв/г гидроксильных' групп.

Ί

755296

δ

К 20 г модифицированного эпоксидной смолой силохрома добавляют 200 мл диоксана, 1 мл триэтиламина, 10 мл гексамеТилендииэоцианата и перемешивают при 90°С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают диоксаном и ацетоном. 5 Сушат при 100°С. Получают активированный носитель, содержащий 0,5 мг- экв/г изоцианатных групп.

Пример 5. К 20 г модифицированного эпоксидной смолой носителя ю (пример 4) добавляют 150 мл 93%-ного водного раствора акролеина и 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Кипятят с обратным холодильником в течение б ч. Фильтруют и промывают водой до исчезновения в фильтрате акролеина. Сушат в вакуум-эксикаторе над серной кислотой при комнатной температуре. Получают носитель, содержащий 0,18 мг»экв/г альдегидных групп.

Пример 6. В 550 мл диоксана +0 растворяют 15 г цианурхлорида и добавляют 20 г модифицированного эпоксидной смолой силохрома (пример 4). Перемешивают 5 мин, добавляют 250 мл воды и перемешивают в течение 5 мин, 25 фильтруют, промывают 500 мл смеси воды с ацетоном· в объемном соотношении, 1:1, сушат 15 мин при 80°С. Получают активированный носитель, содержащий 0,3 мг-экв/г хлорных групп. 30

Пример 7. К 20 г модифицированного эпоксидной смолой силохрома' (пример 4) добавляют 80 мл тиогликолевой кислоты, перемешивают при 120°С в течение 3 ч, фильтруют, про- 35 мывают соляной кислотой на фильтре, водой, 0,1 н. раствором НСЕ, водой и спиртом. Сушат при 80°С. Получают активированный носитель с содержанием сульфогидрильных групп 0,49 мг-экв/г.40

Пример 8. К 20 г модифицированного эпоксидной смолой силохрома (пример 4) добавляют· 100 мл эпихлоргидрина и 5 мл триэтиламина, перемешивают при 100°С 3 ч, фильтруют. Переносят в колбу и обливают 200 мл 5%-ного водного раствора едкого натра. Перемешивают при 60 С 15 мин. Фильтруют, промывают холодной водой, ацетоном и сушат при Ю0°С. Получают активированный носитель, содержащий 0,57 мг-экв/г эпоксидных групп.

Claims

Формула изобретения

Способ получения активированных носителей для иммобилизации биологически активных веществ пропиткой неорганического носителя эпоксидной- смо лой, нанесением поверхностных активных групп путем обработки отверждающим агентом с последующей активацией, отличающийся тем, что, с целью получения носителя с повышенной активностью и расширения ассортимента носителей, в качестве отверждающего агента используют 1-10%-ный раствор поливинилового спирта, обработку проводят в присутствии триэтиламина, а активацию ведут -акролеином или тиогликолевой кислотой, или эпихлоргидри ном, или цианурхлоридом или гексаметилендиизоцианатом.