Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania podloza dla unieruchomienia enzymów.Wiadomo, ze enzymy, majace charakter bialkowi i na ogól rozpuszczalne w wodzie, stanowia katali¬ zatory biologiczne, regulujace wiele róznych re¬ akcji chemicznych, zachodzacych w organizmach zywych. Enzymy mozna równiez wyodrebniac i sto¬ sowac w celach analitycznych, medycznych i prze¬ myslowych. Znajduja one np. zastosowanie prze¬ myslowe przy wytwarzaniu produktów zywnoscio¬ wych, takich jak ser lub chleb, a takze napojów alkoholowych. Istnieja tez rózne specjalne zastoso¬ wania przemyslowe enzymów, takie jak do roz¬ dzielania aminokwasów; do modyfikowania peni¬ cyliny w celu wytworzenia jej pochodnych; zasto¬ sowanie róznych proiteaz przy wyrobie sera, przy skruszaniu miesa, w przemysle srodków powierzch¬ niowo czynnych, skórzanych oraz jako pomocni¬ cze srodki trawienne; zastosowanie karbonydraz w hydrolizie skrobi, inwersji sacharozy, izomery¬ zacji glikozy itd.; zastosowanie nukleaz do regulo¬ wania smaku oraz zastosowanie oksydaz w celu zapobiegania utlenianiu i do regulowania koloru produktów zywnosciowych. Powyzsze zastosowania oraz wiele innych sa opisane w literaturze.Poniewaz, jak juz wspomniano, enzymy sa na ogól rozpuszczalne w wodzie oraz na ogól sa niesta¬ bilne i latwo sie dezaktywuja, trudno jest je od¬ zyskiwac do powtórnego uzytku z roztworów, w których byly stosowane jak równiez trudno jest" utrzymac ich aktywnosc katalityczna w ciagu sto¬ sunkowo dlugiego czasu. Trudnosci te maja po¬ wazne znaczenie przy zastosowaniu przemyslowym, poniewaz konieczna jest czesta zmiana enzymów na ogól trzeba stosowac za kazdym razem nowy en¬ zym. Aby temu zapobiec, zaproponowano unieru¬ chamianie enzymów lub przeprowadzanie ich w for¬ me nierozpuszczalna przed ich zastosowaniem.Unieruchamianie enzymów roznymi nizej opisanymi sposobami, pozwala je wzglednie stabilizowac; dzie¬ ki takiej stabilizacji nadaja sie one do powtórnego uzytku.W przeciwnym przypadku uleglyby dezaktywacji lub zostalyby stracone w srodowisku reakcyjnym.Takie unieruchomione lub nierozpuszczalne enzymy mozna stosowac w rozmaitych reaktorach, jak wy¬ pelnione kolumny, reaktory typu zbiornika z mie¬ szadlem itd.; w zaleznosci od potrzeby. Na ogól unieruchamianie enzymów podnosi stabilnosc ca¬ lego ukladu, zmniejsza problemy zwiazane ze scie- • kami i usuwaniem róznych substancji, a takze moze zwiekszac aktywnosc samego enzymu.Znanych jest wiele ogólnych sposobów unieru¬ chamiania enzymów, oraz wiele modyfikacji tych sposobów. Jeden z ogólnych znanych sposobów po¬ lega na adsorbcji enzymu na stalej .powierzchni; tak np. acylaze aminokwasowa adsorbuje sie na pochodnej celulozy np. na celulozie DEAE; papa- ine lub rybonukleaze absorbuje sie na porowatym szkle; katalaze na weglu drzewnym; trypsyne na 102 119102 3 szkle kwarcowym lub celulozie; chymotrypsyne na kaolinicie itd.Innym ogólnym sposobem jest wychwytywanie i osadzanie enzymu w sieci zelu, np, osadzanie oksy¬ dazy glikozy, ureazy, papainy itd. w zelu poliakrylo- amidowym, acetylocholinoesterazy w zelu skrobio¬ wym lub polimerze silikonowym; transaminazy glu- taminowo-pirogronowej w zelu poliamidowym lub z octanem celulozy itd. Nastepny ogólny sposób po¬ lega na sieciowaniu za pomoca dwufunkcyjnych re¬ agentów; sposób tein moze byc stosowany w pola¬ czeniu z kazdym^z wyzej opisanych ogólnych sposo¬ bów unieruchamiania. W sposobie tym reagenty dwu- lub wielofunkcyjne zdolne do wytwarzania miedzy- ozasteczkowych wiazan poprzecznych, wiaza kowa¬ lencyjnie enzymy ze soba oraz ze stalym podlozem.Przykladem takiego sposobu jest zastosowanie dwu- aldehydu glutarowego lub kwasu bisdwuazobenzy- dyno-2,2/-dwusulfonowego do wiazania enzymu ta¬ kiego jak papaina, ze stalym podlozem itd.Nastepnym sposobem unieruchamiania enzymów jest metoda wiazania kowalencyjnego, w której en¬ zymy takie jak glikoamylaza, trypsyna, papaina, pronaza, amylaiza, oksydaza glikozy, pepsyna, reni- na, proteaza grzybowa, laktaza itd., zostaja unieru¬ chamiane przez zwiazanie kowalencyjne z polime¬ rem, który jest przyczepiony do porowatego pod¬ loza organicznego lub nieorganicznego. Sposób ten równiez mozna laczyc z poprzednio opisanymi me¬ todami unieruchamiania.Powyzsze sposoby unieruchamiania enzymów wszystkie posiadaja pewne wady, które zmniejszaja ich mozliwosc zastosowania przemyslowego. Tak np., gdy enzym adsorbuje sie bezposrednio na po¬ wierzchni podloza, sily wiazania pomiedzy enzy¬ mem i nosnikiem sa czesto dosyc slabe, chociaz nie¬ które znane publikacje wskazuja, ze mozna otrzy¬ mac stosunkowo stabilne polaczenie tego typu dzie¬ ki zastosowaniu odpowiedniej korelacji wymiarów porów podloza oraz srednicy spinu enzymu. Wiel¬ kosc porów podloza nie moze jednak przekraczac srednicy okolo 1000 A. Ze wzgledu na stalosc ta¬ kiego wiazania enzym czesto ulega desorpcji w srodowisku reakcyjnym. Ponadto, enzym moze ulec czesciowej lub calkowitej dezaktywacji wsku¬ tek braku ruchliwosci lub wskutek wzajemnego oddzialywania podloza i osrodka aktywnosci w en¬ zymie.Innym stosowanym sposobem jest osadzanie en¬ zymów w sieciach zelów; mozna tego dokonac poli¬ meryzujac wodny roztwór lub emulsje, (zawierajaca monomer polimeru i enzym albo wprowadzajac enzym róznymi sposobami do prepolimeru, czesto w obecnosci czynnika 'sieciujacego. Zaleta tego sposobu unieruchamiania sa lagodne warunki pro¬ wadzenia reakcji, tak ze na ogól nastepuja tylko male zmiany lub nieznaczna dezaktywacja enzymu; wada zas jest niska wytrzymalosc mechaniczna uzyskanych kompleksów, co w efekcie prowadzi do zageszczania cieczy w kolumnach z ciaglym prze¬ plywem, a takze do zatykania tych kolumn. Kom¬ pleksy, uzyskane w powyzszy sposób, maja bar¬ dzo rózne wymiary porów, tak ze trafiaja sie i du¬ ze pory, umozliwiajace uwolnienie i strate enzymu. 119 4 Niektóre zas wymiary porów sa tak male, ze stwa¬ rzaja powazne bariery dla dyfuzji i transportu sub- stratów i produktów, co w efekcie opóznia reakcje; daje sie to zauwazyc przede wszystkim przy stoso- wamiu substratów wielkoczasteczkowych. Wady, wystepujace przy unieruchamianiu enzymów za pomoca sieciowania miedzyczasteczkowego sa, jak juz wspomniano, spowodowane brakiem ruchliwosci enzymu. Prowadzi to do dezaktywacji, poniewaz enzym nie moze przyjac naturalnej konfiguracji, niezbednej do uzyskania maksymalnej aktywnosci, szczególnie, gdy aktywny osrodek enzymu zostanie wplatany w wytworzony uklad wiazan.Metody wiazania kowalencyjnego znalazly szero- kie zastosowanie i mozna je stosowac jako osobne techniki unieruchamiania.albo w polaczeniu z tymi powyzej opisanymi sposobami, w których stosuje sie sieciowanie. Sposób ten stosuje sie czesto do wiazania enzymu i podloza za •posrednictwem cza- steczek dwufunkcyjnych, w których grupy funkcyj¬ ne czasteczki, takiej jak np. Y-amm0Pr0Pyl°t(róJ- etoksysilan, zdolne sa do reakcji z ugrupowaniami funkcyjnymi, obecnymi w enzymie i w organicznym lub nieorganicznym podlozu. Stosowano tu wiele substancji i wiele podlozy; zaleta tego sposobu jest wytwarzanie silnych wiazan kowalencyjnych w uzyskanych kompleksach oraz, w wielu przy¬ padkach, uzyskanie wysokiej aktywnosci.Wiazanie kowalencyjne enzym-podloze musi byc wytworzone poprzez te grupy funkcyjne enzymu, * które nie maja wplywu na jego aktywnosc katali¬ tyczna, takie jak wolne grupy aminowe, karboksylo¬ we, hydroksylowe, fenolowe, sulfohydrylowe dtd. Po¬ wyzsze grupy funkcyjne moga równiez reagowac z wieloma innymi grupami funkcyjnymi, takimi jak aldehydowa, izocyjanianowa, acylowa, dwuazcrwa, azydowa, bezwodnikowa, aktywowana estrowa itp., tworzac wiazanie kowalencyjne. Nie mniej jednak sposób ten równiez posiada szereg wad, miedzy 40 innymi stosowanie trudno dostepnych reagentów i rozpuszczalników, specjalnych porowatych podlo¬ zy oraz skomplikowana wieloetapowa technologie.Wszystko to sprawia, ze sposób ten nie jest ko¬ rzystny do stosowania przemyslowego. 45 Opisanymi wyzej znanymi sposobami mozna wy¬ tworzyc rozmaite srodki enzymatyczne, zawierajace unieruchomione enzymy. Tak wiec np. w opisie pa¬ tentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 50 3 556 945 opisano srodek enzymatyczny, w którym enzym jest zaadsorbowany na nosniku nieorganicz¬ nym, takim jak szklo. W opisie Stanów Zjednoczo¬ nych Ameryki nr 3 519 538 opisano srodek, w któ¬ rym enzym jest chemicznie sprzezony z nieorga- 55 nicznym nosnikiem za posrednictwem silanowego czynnika sprzegajacego. Podobnie w opisie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 783 101 równiez zasto¬ sowano czynnik wiazacy órganosilanowy, przy czym enizym zwiazany jest kowalencyjnie z nosnikiem 60 szklanym za posrednictwem silanowego czynnika sprzegajacego; czesc silikonowa tego czynnika jest przyczepiona do nosnika, zas jego czesc organiczna jest sprzezona z enzymem. Srodek ten zawiera rów- 65 niez tlenek metalu na powierzchni nosnika, usytu-.102 119 6 owany pomiedzy nosnikiem i czescia silikonowa czynnika sprzegajacego.W opisie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 821 083 obojetny nosnik pokryty jest prepolime- rem takim, jak poliakroleina, która wiaze do niego enzym. Jednakze, wedlug wiekszosci przedstawio¬ nych w tym opisie przykladów, konieczna jest wstepna hydroliza kwasna tej kompozycji, przed osadzeniem enzymu na polimerze.Inny opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 705 084 ujawnia makropór owaty re¬ aktor enzymatyczny, w którym enzym zostaje za- adsorbowany na powierzchni ipolimerycznej makro- porowatego rdzenia reaktora, a nastepnie siecio- wany na miejscu. Wskutek sieciowania enzymu na powierzchni polimeru po jego zaadsorbowaniu enzym ulega dalszemu czesciowemu unierucho¬ mieniu i nie moze dzialac swobodnie jako kataliza¬ tor, tak jak w swoim stanie naturalnym. Sieciowa¬ nie enzymów w efekcie wiaze je ze soba, uniemo¬ zliwiajac ich swobodny ruch i zmniejszajac ich ruchliwosc, która jest niezbednym warunkiem ma¬ ksymalnej aktywnosci.Znanych jest wiec bardzo wiele sposobów unieru¬ chamiania enizymóiw, zaden z nich jednak nie na¬ daje sie do zastosowania przemyslowego.Przedmiotem wynalazku jest sposób 'wytwarzania podloza dla unieruchomiania enzymów, w którym porowaty nosnik nieorganiczny o srednicach porów rzedu 100'—55000 A i (powierzchni wlasciwej 1—500 m2/g traktuje sie w temperaturze 5—60°C roztworem pierwszego wielofunkcyjnego monomeru, polimeru o niskim ciezarze czasteczkowym, hydro¬ lizatu polimeru o "niskim ciezarze czasteczkowym lub iprepolimeru, nadmiar niezaadsorbowanego roz¬ tworu usuwa sie, nosnik z zaadsorbowanym mono¬ merem lub polimerem kontaktuje sie z drugim dwufunkcyjnym monomerem w postaci reaktywne¬ go roztworu tego monomeru, z otrzymanego nie- organiczno-organicznego podloza usuwa' sie nad¬ miar nieprzereagowanego roztworu, a nastepnie otrzymany nieorganiozno-organiczny kompleks pod¬ daje sie reakcji z enzymem proteinowym.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze nie¬ organiczny nosnik i zaadsorbowany na nim mono¬ mer lub polimer poddaje sie reakcji z nadmiarem 3—50 moli drugiego dwufunkcyjnego monomeru na 1 mol pierwszego wielofunkcyjnego monomeru, po¬ limeru o niskim ciezarze czasteczkowym, hydroli¬ zatu polimeru o niskim ciezarze czasteczkowym lub prepolimeru, przy czym otrzymuje sie nieorga- niozno-organiczne podloze, zawierajace ruchome wystajace grupy zdolne do reakcji z enzymem.Sposób wedlug wynalazku jest prosty, latwy w wykonaniu, przy zastosowaniu srodowisk wod¬ nych lub latwo dostepnych rozpuszczalników; pro¬ ces prowadzi sie w zakresie temperatur od niz¬ szej niz pokojowa (okolo 5°C) ldo podwyzszonej do okolo 60°C, a korzystnie w temperaturze pokojo¬ wej (okolo 20—25°C).Sposób wedlug wynalazku obejmuje minimalna ilosc etapów oraz dodatkowo, umozliwia latwe od¬ zyskanie nadmiaru rjeagentów oraz gotowego pro¬ duktu. Wiele z nosników nieorganicznych, opisa¬ nych w znanym stanie techniki, stanowia materialy o "kontrolowanej wielkosci porów", takie jak szklo, tlenek glinu itp. Maja one srednice porów 500— ^700 A dla okolo 961% materialu oraz maksymalna srednice porów 1000 A, powierzchnie wlasciwa 40—70 m2/g oraz czastki o wielkosci 40—80 mesh.Nosniki te moga byc równiez pokrywane tlenkami metali takimi, jak tlenek cyrkonu i tlenek tytanu, dla uzyskania wyzszej stabilnosci. w przeciwienstwie do znanych nosników, poro-- wate nieorganiczne nosniki stosowane w niniejszym wynalazku stanowia substancje, posiadajaca pory o srednicy 100 A — 55 000 A, przy czym 25—601% porowatego nosnika posiada pory o srednicy powy- zej 20000 A oraz powierzchnie wlasciwe rzedu 150—200 m2/g. Wielkosc czastek moze wahac sie w szerokim zakresie od 10—20 mesh do delikatnego proszku, przy czym wielkosc czastki dobiera sie w zaleznosci od przeznaczenia srodka. Porowaty nosnik moze byc równiez pokryty róznymi tlenka¬ mi, wymienionymi powyzej; moze on takze posia¬ dac wbudowane rózne inne substancje nieorganicz¬ ne np. fosforan borowy itp. Dodatki te nadaja specjalne wlasciwosci nosnikowi. Szczególnie ko- rzystnym nosnikiem jest substancja ceramiczna, która (ma typ porowatosci opisany powyzej przy srodkach wedlug wynalazku, albo ma strukture plastra miodu iz laczacymi makrokanalikami we¬ wnatrz; takie materialy znane sa na ogól pod na- zwa monolitów — i mozna je pokrywac róznymi rodzajami porowatego tlenku glinu, cyrkonu itp.Zastosowanie tego typu nosnika jest szczególnie ko¬ rzystne, poniewaz umozliwia swobodny przeplyw substratów nawet o wysokiej lepkosci, które czesto spotyka sie w przemyslowych reakcjach en¬ zymatycznych.Jako nieorganiczne porowate nosniki, mozna sto¬ sowac np. niektóre tlenki metali, takie jak tlenek glinu, zwlaszcza yitlenek glinu, krzemionka, tlenek 40 cyrkonu lub mieszaniny tlenków metali, takie jak krzemionki z tlenkiem glinu, krzemionki z tlenkiem tytanu, krzemionki z tlenkiem magnezu, krzemionki z tlenkiem cyrkonu i glinu itp., lub y-tlenek glinu, zawierajacy inne zwiazki nieorganiczne, takie jak 45 fosforan borowy itd., substancje ceramiczne itp., oraz kombinacje wymienionyeh materialów, przy czym jeden z 'materialów moze stanowic nosnik, a drugi jego powloke.Substancje polimeryczne wytwarzane sa in situ, 50 tak ze polimer zostaje zarówno czesciowo osadzo¬ ny, jak czesciowo zaadsorbowany w porach nosnika nieorganicznego, opisanego powyzej. Wytwarza sie je wedlug wyzej opisanych ogólnych metod, a mia¬ nowicie najpierw adsorbuje sie roztwór, zawiera- 55 jacy 2^25% dwu- lub wielofunkcyjnego monomeru, hydrolizatu polimerowego, lub prepolimeru. Mo¬ nomer lub polimer moze byc pochodzenia natural¬ nego lub syntetycznego i korzystnie jest rozpusz¬ czalny w wodzie lub w innych rozpuszczalnikach 60 obojetnych w warunkach dalszych reakcji. Na¬ stepnie dodaje sie drugi dwufunkcyjny monomer w podobny sposób.W wyniku reakcji z poprzednio dodanym rea¬ gentem, zaadsorbowanym na podlozu nieorgainicz- 65 nym, otrzymuje sie podloze organiczno-nieorganicz-102 7 ne. Grupy funkcyjne, zawarte w monomerze dwu- funkcyjnym, stanowia znane grupy reaktywne, ta¬ kie jak aminowa, hydroksylowa, karboksylowa, tio- lowa, karbonyIowa itd. Jak juz wspomniano, grupy reaktywne zwiazków dwufunkcyjnych sa korzyst¬ nie, ale nie koniecznie, przedzielone lancuchami o 4—10 atomach wegla* Grupy reaktywne sa zdol¬ ne do wiazania sie kowalencyjnie tak z poprzedni¬ mi dodatkami, jak i nastepnie, po odmyciu nie^ przereagowanych substancja, z enzymem, który do¬ daje sie w nastepnym etapie. Enzym zostaje zwia¬ zany kowalencyjnie z grupa funkcjonalna, umiesz¬ czona na koncu lub bezposrednio przy koncu lan¬ cucha, a jednoczesnie zostaje zaadsorbowany na. podlozu. Po dodaniu enzymu uzyskuje sie stosun¬ kowo stabilny srodek enzymatyczny, charakteryzu¬ jacy sie zarówno wysoka aktywnoscia, jak i wyso¬ ka stabilnoscia.Przykladami dwu- lub wielofunkcyjnych mono¬ merów, hydrolizatów polimerów lub prepolime- rów, które w pierwszej kolejnosci adsorbuja sie na nosniku nieorganicznym sa: rozpuszczalne w wo¬ dzie poliamidy jak etylenodwuamina, dwuetyleno- trójamina, trójetylenoczteroamina, ozteroetyleno- piecioamina, piecioetylenoszesoioamina, szesciome- tylenodwuamina, polietylenoimina itd., nieroz¬ puszczalne w wodzie poliaminy, takie jak metylenom dwucykloheksyloamina, metylenodwuanilina itd.; naturalne i syntetyczne, czesciowo zhydrolizowane polimery i prepolimery, takie jak nylon, kolagen, poliakroleina, bezwodnik polimaleiinowy, kwas algi¬ nowy, hydrolizaty kazeiny, zelatyna itd.Przykladami nastepnych dwufunkcyjnych zwiaz¬ ków, które dodaje sie do powyzszych substancji, aby wytworzyc podloze organiczno-organiczne sa: dwualdehyd glutarowy, chlorek kwasu adypinowe- go, chlorek kwasu sebacynowego, toluenodwuizocy- janian, szesciometylenodwuizocyjanian itd.Jezeli podda sie reakcji polietylenoamine i dwu¬ aldehyd glutarowy, bez stosowania porowatego no¬ snika nieorganicznego, otrzymuje sie substancje rozpuszczalna w wodnych roztworach kwasów: przy reakcji polietylenoaminy z dwuizocyjanianem lub halogenkiem acylowym, otrzymuje sie produkt nierozpuszczalny w wodzie. Odwrotnie, jezeli kompleks reakcyjny bez nosnika nieorganicznego zawiera wolne grupy karboksylowe, otrzymuje sie produkt rozpuszczalny w roztworach alkalicznych.Dzieki duzemu nadmiarowi drugiego reagenta o~ przestrzennych, dwufunkcyjnych czasteczkach, wytworzone podloze polimeryczne zawiera wysta¬ jace ugrupowania, stanowiace te przestrzenne czasteczki; czasteczki te wystaja z podloza i posia¬ daja latwo dostepne grupy reaktywne, usytuowane na koncu wystajacej czasteczki lub bezposrednio przy jej koncu. Grupy te moga reagowac z enzy¬ mem, wiazac go wiazaniem kowalencyjnym z prze¬ strzenna, wystajaca czasteczka. Ponadto enzym, za¬ stosowany po odmyciu nieprzereagowanych rea¬ gentów z organiczno-nieorganicznego podloza, ule¬ ga jednoczesnie czesciowej adsorpcji na tym pod¬ lozu.Zwiazanie enzymu tylko z podlozem organicz¬ nym nie ^wplywa zazwyczaj na zaleznosc rozpusz¬ czalnosci zespolu od pH roztworu, jednak jezeli 119 8 w podlozu znajduje sie nosnik nieorganiczny, jak opisano powyzej, caly zespól wykazuje wysoka sta¬ bilnosc w stosunkowo szerokim zakresie pH=3—9.Stabilnosc jest oczywiscie funkcja optymalnych charakterystyk pH zastosowanego enzymu oraz za¬ stosowanego nosnika nieorganicznego.Jest wiec oczywiste, ze mozna wytworzyc odpo¬ wiednie podloze organiczno-nieorganiczne, nadaja¬ ce sie do wielu, zastosowan, stosujac nosnik i ad- io sorbujac na nim którakolwiek z powyzej opisanych, znanych substancji, a nastepnie traktujac otrzy¬ many produkt którakolwiek ze znanych dwufunk¬ cyjnych czasteczek, zdolnych do reakcji z poprzed¬ nim reagentem, pod warunkiem, ze zastosuje sie nadmiar dwufunkcyjnych czasteczek, wystarczaja¬ cy do wytworzenia wystajacych ugrupowan, zdol¬ nych do dalszej reakcji z enzymem. Zastosowanie tych wystajacycli ugrupowan z grupa funkcyjna jako punktów wiazania enzymu pozwala na zacho- wanie znacznej ruchliwosci enzymu. Dzieki temu enzym zachowuje swoja wysoka aktywnosc kata¬ lityczna w ciagu znacznie dluzszego czasu, niz w preparatach, gdzie zastosowano inne sposgby jego unieruchamiania, takie jak osadzanie w sieci zelu, adsorbcja na stalych powierzchniach lub sie¬ ciowanie enzymu dwufunkcyjnymi reagentami itp.Nie wszystkie jednak kompozycje daja takie same wyniki w zakresie stabilnosci lub aktywnosci.Przykladami enzymów, które mozna unierucha- miac wiazaniem kowalencyjnym i które zawieraja grupe aminowa, zdolna do reakcji z grupa alde¬ hydowa lub izocyjanianowa ugrupowan wystaja¬ cych z substancji polimerycznej, osadzonej i za- adsorbowanej w porach nosnika sa: trypsyna, pa- paina, heksokinaza, p-galaktozydaza, ficyna, bro- molaina, dehydrogenaza mlekowa, glikoamylaza, . chymotrypsyna, pronaza, acylaza, inwertaza, amy- laza, oksydaza glikozy, pepsyna, reniina, proteaza grzybowa itd. W zasadzie mozna zastosowac kazdy 40 enzym, którego aktywny punkt nie jest zwiazany wiazaniem kowalencyjnym.Omówiono powyzej wystajace ugrupowania, za¬ wierajace jako grupy funkcyjne grupe aldehydowa lub izocyjanianowa, jednakze podloza otrzymane 45 wedlug wynalazku moga równiez posiadac inne grupy reaktywne, zdolne do reakcji z grupami karboksylowymi, sulfohydrylowymi lub innymd, któ¬ re zazwyczaj znajduja sie w enzymach. Jednakze wiazanie kowalencyjne, wytworzone miedzy tymi 50 innymi grupami reaktywnymi enzymów i podloza niekoniecznie daje takie same rezultaty, a takze moze nasuwac wieksze trudnosci technologiczne.Powyzej zestawione porowate nosniki, monomery, hydrolizaty, polimery i enzymy wymienione sa je- 55 dynie w charakterze reprezentantów róznych mo¬ zliwych typów zwiazków i w zadnym przypadku nie ograniczaja zakresu wynalazku.Korzystnie sposób, wedlug wynalazku prowadzi sie metoda nieciagla, jak opisano powyzej, jednak 60 w zakres wynalazku równiez wchodzi sposób ciag¬ ly. W sposobie ciaglym umieszcza sie pewna ilosc porowatego stalego nosnika w odpowiednim urza¬ dzeniu. Nosnik moze byc w kazdej postaci, jak proszek, tabletki, monolity itd. Nosnik laduje sie 65 do kolumny, nastepnie wprowadza sie go w kon-102 119 9 10 takt korzystnie z wodnym roztworem np. wielo¬ funkcyjnej aminy do momentu nasycenia go, po czym nadmiar, roztworu odsacza sie. Nastepnie na¬ sycony nosnik wprowadza si^ w kontakt z prze¬ strzennymi dwufunkcyjnymi czasteczkami, np. dwualdehydem glutarowym. Podloze polimeryczne wytwarza sie w ten sposób w roztworze wodnym, przy czym reakcja moze trwac 1—»10 godzin; za¬ zwyczaj jednak trwa krótko.Nastepnie odprowadza sie nadmiar aldehydu glutarowego i odmywa wszelkie rozpuszczalne w wodzie nieprzereagowane substancje; w przy¬ padku poliaminy odmywanie korzystnie prowadzi 4e roztworem buforowym o wartosci pH okolo 4.Nastepnie do kolumny wprowadza sie wodny roz¬ twór enzymu, ewentualnie w formie zawracanego obiegu; w tym etapie wytwarza sie wiazanie ko¬ walencyjne enzymu z koncowa grupa aldehydowa wystajacych z podloza ugrupowan. Etap ten prowa¬ dzi sie do zakonczenia adsorpcj/i/lub procesu wia¬ zania kowalencyjnego enzymu z organiczno-nieor¬ ganicznym podlozem i wystajacymi czasteczkami.Nadmiar enzymu odzyskuje sie z odcieku po od- ciekniecin i. przemyciu kolumny. Kolumna jest po tej operacji gotowa do zastosowania do reakcji che¬ micznej, katalizowanej enzymatycznie.Czasy, temperatury i stezenia, stosowane w pro¬ cesie ciaglym sa na ogól te same, co wyzej opisane w procesie okresowym; równiez i otrzymane wy¬ niki sa porównywalne. Jednakze w zakres wyna¬ lazku wchodzi równiez stosowanie innych odpo¬ wiednich wartosci pH i temperatur, w zaleznosci od rodzaju zastosowanych reagentów i enzymów.Ponizej podane przyklady blizej wyjasniaja wy¬ nalazek, nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad 1. Zastosowano 2 g porowatego nosnika, zlozonego z krzemionki i tlenku glinu, za¬ wierajacego wbudowany fosforan borowy, o wy= miarze czasteczek 40—80 mesh i srednicy porów od 100 do okolo 550000 A ii powierzchni wlasciwej 150—200 m2/g. Nosnik ten wypalano w temperatu¬ rze okolo 260°C do usuniecia zaadsorbowanej wilgo¬ ci. Nastepnie traktowano nosnik 25 ml 4% wodne¬ go roztworu czteroetylenopiecioaminy w tempera¬ turze otoczenia w ciagu 1 godziny, pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, dla ulatwienia penetracji roztworu w glab porów, po czym dekantowano niezaadsor- bowany roztwór. W parach adsorbowalo sie okolo % czteroetylenopiecioaminy.Nastepnie, wilgotny nosnik traktowano 25 ml % wodnego, roztworu dwualdehydu glutarowego w temperaturze pokojowej; reakcja zachodzila prawie natychmiast, przy czym wytwarzal sie nie¬ rozpuszczalny produkt reakcji na powierzchni i wewnatrz porów nosnika. Nadmiar roztworu dwu¬ aldehydu glutarowego dekantowano i przemywano organiczno-nieorganiczny kompleks do usuniecia njeprzereagowanych i niezaadsorbowanych rea¬ gentów. Przemywano najpierw woda, a nastepnie 0,02 molowym buforem octanowym o wartosci pH = 4,2, w temperaturze 45°C. Nastepnie dodano roztwór enzymu, zawierajacy okolo 20fl mg gliko-, amylazy na 25 ml wody; /reakcje prowadzono w temperaturze pokojowej w ciagu 1 godziny. Pod koniec tego okresu zdekantowano nadmiar roztwo¬ ru glikoamylazy i otrzymany kompleks przemyto woda do usuniecia nie zwiazanego i/Lub niezaad- sorbowanego enzymu.Preparat nastepnie lugowano . w ciagu 24 godzin buforem octanowym, analogicznym jak powyzej opisany. Ilosc zaadsorbowanego i/lub zwiazanego kowalencyjnie enzymu oznaczano analitycznie na drodze mikrochromatografii gazowej Dumasa przed 1& i po dodaniu enzymu. Aktywnosc uzyskanego kom¬ pleksu enzymatycznego oznaczano za pomoca ilosci glikozy wytworzonej z 30% rozcienczonego roztwo¬ ru skrobi o wartosci pH=4,2 i w temperaturze 60°C, stosujac metode glikostatowa Worthingtona "do l.5 oznaczania glikozy. Uwaza sie, ze metoda ta jest najlepsza do oznaczania jakosci srodka enzyma¬ tycznego. Aktywnosc, oznaczona ta metoda, wynor sila 28 jednostek na gram nosnika, przy zawartosci enzymu 29 mg/g nosnika. Jednostka, zgodnie z usta- leniami tej metody, odpowiada wytwarzaniu 1 g glikozy na godzine w temperaturze 60°C.Nalezy zauwazyc, ze pomimo,, iz wiadomo* ze analogiczny preparat, wytworzony bez nieorganicz¬ nego nosnika, jest rozpuszczalny przy wartosci pH=4,2, to przy lugowaniu buforem uzyskanego preparatu na podlozu nieorganiczno-prganicznym przy pH=4,2 strata enzymu byla znikoma. Stwier¬ dzono ten fakt, analizujac odcieki z tego etapu.Przyklad II. Postepowano analogicznie, jak w przykladzie I, stosujac jednak porowaty nosnik nieorganiczny o wielkosci czastek 10—30 mesh.Nosnik z krzemionki i tlenku glinu, zawierajacyv wbudowany fosforan borowy, traktowano cztero- etylenopiecioamina, dwualdehydem glutarowym i glikoamylaza, analogicznie jak w przykladzie I.Otrzymano aktywny kompleks z unieruchomionym enzymem, chociaz aktywnosc byla nieco obnizona, prawdopodobnie wskutek utrudnionej dyfuzji spo¬ wodowanej wiekszym wymiarem czastek nosnika.Przyklad III. Analogicznie, jak w przykla¬ dzie I, 2 g nosnika z krzemionki i tlenku glinu o tej samej charakterystyce fizycznej, wymiarach czastek, srednicy porów i powierzchni wlasci- 45 wej, co w przykladzie I, traktowano acetonowym roztworem czteroetylenopiecioaminy, a nastepnie acetonowym roztworem toluenodwuizocyjanianu zamiast wodnym roztworem dwualdehydu glutaro¬ wego. Po zdekantowaniu nadmiaru roztworu dwu-. 50 izocyjanianu i przemyciu woda kompleks organicz¬ no-nieorganiczny traktowano wodnym roztworem glikoamylazy. Jak w przykladzie I, gotowy produkt stanowil aktywny, calkowicie nierozpuszczalny kompleks enzymatyczny. 55 Przyklad IV. W celu zilustrowania faktu, ze mozna stosowac rózne stezenia, roztworów, powtó¬ rzono postepowanie z przykladu I z ta róznica, ze stosowano bardziej stezone roztwory róznych rea¬ gentów. Np. 2 g nosnika z krzemionki i tlenku 60 glinu o wielkosci czastek 10^30 mesh traktowano ml 20% roztworu czteroetylenopiecioaminy, a po zdekantowaniu dodano 50 ml 25% roztworu dwu¬ aldehydu glutarowego. Kompleks po,przemyciu po¬ traktowano wodnym roztworem glikoamylazy, przy 65 czym otrzymano kompleks z unieruchomionym en^102 119 11 12 zymem, o aktywnosci 12 jednostek/g wedlug testu glikostatowego.Przyklad V. Nosnik z krzemionki i tlenku glinu o wielkosci czastek 10—30 mesh, srednicy po¬ rów od okolo 100 do okolo 55 000 A i powierzchni wlasciwej o okolo 150—(200 m2/g traktowano cztero- etylenopiecioamina w 1% wodnym roztworze czesciowo zhydrolizowanego kolagenu; kolagen sta¬ nowi tu dodatkowy czynnik wiazacy. Po odsaczeniu i reakcji z dwualdehydem glutarowym, podloze or¬ ganiczno-nieorganiczne potraktowano roztworem glikoamylazy analogicznie, jak w przykladzie I, otrzymujac aktywny kompleks enzymatyczny.Przyklad VI. W celu zilustrowania faktu, ze mozna stosowac rózne enzymy do wytwarzania za¬ danych kompleksów, nosnik z krzemionki i tlenku glinu, zawierajacy Wbudowany fosforan borowy traktowano roztworem czteroetylenopiecioaminy, dekantowano, przemyto i potraktowano roztworem dwualdehydu glutarowego. Otrzymany produkt po¬ traktowano wodnym roztworem laktazy. Otrzyma¬ no aktywny kompleks enzymatyczny. Podobne po¬ stepowanie mozna stosowac do wiazania enzymów takich jak proteazy, izomerazy glikozy ii oksydazy glikozy, przy czym otrzymuje sie aktywne kom¬ pleksy.Przyklad VII. Kolumna o srednicy wewnetrz¬ nej 20 mm zawierala 14,2 g aktywnego kompleksu enzymatycznego, wytworzonego z glikoamylazy, zwiazanej z nosnikiem z krzemionki i tlenku glinu, zawierajacym wbudowany fosforan borowy o wiel¬ kosci czastek 10—30 mesh, w sposób wedlug przy¬ kladu I. Kolumne uzywano w sposób ciagly w ciagu 30 dni w temperaturze 45°C do zhydro- lizowania wodnego rozcienczonego 30% roztworu skrobi, zbuforowanego do wartosci pH=4,2. Wy¬ twarzanie glikozy kontrolowano, analizujac odciek glikostatowa metoda Worthingtona. Stwierdzono, ze w tym okresie czasu nie nastepuje widoczny spadek aktywnosci enzymu; stopien konwersji skrobi -na glikoze wynosil 62% w tej temperaturze i przy szybkosci przeplywu okolo 150 ml/godz.Przyklad VIII. W celu zilustrowania faktu, ze mozna stosowac rózne substraty i rózne nosniki, monolit, stanowiacy substancje ceramiczna o struk¬ turze plastra miodu z laczacymi makrokanalikami, pokryty tlenkiem glinu poddano obróbce analo¬ gicznie, jak w przykladzie I, mianowicie roztwora¬ mi czteroetylenopiecioaminy, dwualdehydu glutaro¬ wego i enzymu glikoamylazy. Postepowanie obejmo¬ walo kolejino operacje takie jak dekantowanie, przemywanie i lugowanie. Oryginalny monolit ce¬ ramiczny posiadal sucha mase 256 g, z czego 13% odpowiadalo powloce z tlenku glinu.Gotowy kompleks z unieruchomionym enzymem wytworzono w kolumnie wewnatrz rury szklanej o wewnetrznej srednicy 70 mm, z przeznaczeniem do pracy W sposób ciagly z odpowiednim urzadze¬ niem pompujacym wewnatrz pojemnika z regulo¬ wana temperatura, nastawiona na 45°C. Po 40 dniach ciaglego stosowania do hydrolizy 30% zbu¬ forowanego rozcienczonego roztworu skrobi, stwier¬ dzono, ze nastepuje tylko 3% spadek oryginalnej aktywnosci kompleksu enzymatycznego przy prze¬ plywie okolo 85 ml/godz. Ponadto, stwierdzono, ze w ciagu 40 dni nastepowala okolo 80% konwersja skrobi do glikozy.W celu wnikliwego zbadania pracy ukladu sto- siowano kolejne zmiany w szybkosci przeplywu; stwierdzono, ze przy przeplywie okolo 38 ml/godz. mozna bylo uzyskac konwersje rzedu 92—93% skrobi do glikozy. Stosunkowo^ dlugi okres czasu, w którym enzym stosowano do konwersji skrobi do glikozy bez widocznego spadku aktywnosci en¬ zymu, spowodowanego desorbeja czy dezaktywacja, wskazuje na dlugi okres póltrwania katalizatora.Przyklad IX. Wytworzono kompleks typu mo- ~ nolitu i kolumne podobnie, jak w przykladzie IX, stosujac jednak zamiast glikoamylazy laktaze.Kompleks badano pod wzgledem stabilnosci przy ciaglym przeplywie, utrzymujac temperature 37°C w ciagu 29 dni. Ponownie stwierdzono, ze nie na¬ stepowal widoczny spadek aktywnosci kompleksu enzymatycznego. Unieruchomiony enzym stosowano do 5% roztworu laktozy, zbuforowainego do war¬ tosci pH=4,2. Roztwór laktozy wprowadzano do ko¬ lumny z szybkoscia 54 ml/godz. W oiagu 29 dni na¬ stepowala 35% konwersja laktozy do glikozy i ga- laktozy.Przyklad X. W przykladzie tym przedstawio¬ no szereg prób z wykorzystaniem róznych porowa¬ tych nosników jako substratów, na których adsor- bowano kombinowane polimeryczne podloze orga- niczno-nieorganiczne, zawierajace enzym, zwiazany wiazaniem kowalencyjnym i uwieziony w jego po¬ rach. W pierwszej próbie 2 g nosnika z krzemionki i tlenku glinu, zawierajacego takze fosforan baru, o rozmiarach porów 100—55 000 A i powierzchni wlasciwej okolo 400 m2/g poddawano obróbce 25 ml roztworu czteroetylenopiecioaminy o stezeniu 4%. Nastepnie z nosnika z krzemionki i tlenku gli¬ nu, poddanego opisanej obróbce, usuwano nadmiar roztworu i poddawano obróbce 25 ml roztworu al- 40 dehydu glutarowego o stezeniu 5%.Po usunieciu nadmiaru roztworu podklad orga¬ niczno-nieorganiczny traktowano 200 mg enzymu glukoamylazy w 10 ml wody. Aktywnosc kom¬ pleksu, zawierajacego unieruchomiony enzym, 45 okreslano jako ilosc glikozy, wytworzonej z 50 ml % roztworu skrobi w ciagu 1 godziny w tempera¬ turze 60°C. Oznaczanie ilosci wytworzonej glikozy prowadzono metoda glukostatowa, opisana w przy¬ kladzie I. Z definicji jedna jednostka aktywnosci 50 jest równa jednemu gramowi glikozy, wytworzo¬ nemu w ciagu godziny. Ilosc jednostek na gram kompleksu, wyrazona iloscia wytworzonej glikozy, wynosila 28,3.W przeciwienstwie do tego, gdy na "2 g nosnika 55 z krzemionki i tlenku glinu adsorbowano bez¬ posrednio 200 mg glukoamylazy w 10 ml wody bez tworzenia podloza nieorganiczno-organicznego, jak opisano poprzednio w przykladzie I itd. i stosowa¬ no jako katalizator enzymatyczny w sposób podob- 60 ny do opisanego poprzednio, uzyskiwano tylko 4,2 jednostki aktywnosci na gram kompleksu. Widac wiec wyraznie, ze zwiazanie kowalencyjne enzymu glukoamylazy z wystajacymi grupami, zakonczony¬ mi resztkami aldehydowymi, które powstaly w re- 65 akcji nadmiaru aldehydu glutarowego z czteroety-102 119 13 14 * lenopiecioamina (TEP) powoduje uzyskanie kom¬ pleksu, zawierajacego unieruchomiony enzym, o znacznie wyzszej aktywnosci niz aktywnosc kompleksu z enzymem, w którym enzym jest tylko zaadsorbowany na porowatym nosniku nieorganicz¬ nym.Przeprowadzono tez inne próby, w których kompleks z unieruchomionym enzymem wytwarza sie, stosujac porowaty nosnik ze szkla o rozmia¬ rach 40—80 mesh i rozmiarach porów, wynosza¬ cych 1000 A. Nosnik ten traktowano w sposób po¬ dobny, jak opisano w przykladzie I, 25 ml 4% roztwo¬ ru TEP, odwadniano i nastepnie traktowano 25 ml 5% roztworu aldehyduglutarowego; Podklad organicz¬ no-nieorganiczny uzupelniano, traktujac nosnik, otrzymany w wyniku poprzednio opisanej obróbki, 200 mg glukoamylazy w 10 ml wody z utworzeniem kompleksu, zawierajacego unieruchomiony enzym.Kompleks ten stosowano jako katalizator do ob¬ róbki skrobi z wytworzeniem glukozy. Warunki prowadzenia procesu byly podobne, jak opisano poprzednio i prowadzono nastepnie takie same ozna¬ czenia. Stwierdzono, ze kompleks ten wykazuje ak¬ tywnosc 7,4 jednostek na gram kompleksu.Wytworzony podobnie kompleks z porowatego nosnika nieorganicznego, zawierajacego szklo po¬ kryte tlenkiem glinu, równiez wykazuje aktywnosc 7,4 jednostek ma gram kompleksu. Gdy powtórzono opisana próbe, stosujac szklo o srednicy porów 550—700 A z nastepna obróbka TEP, nadmiarem aldehydu glutarowego i glmkoamylaza jako enzy¬ mem, aktywnosc wynosila 6,8 jednostek na gram kompleksu.Z porównania powyzszych kompleksów, zawiera¬ jacych unieruchomiony enzym widac wyraznie, ze kompleks, otrzymany przy uzyciu porowatego nos¬ nika nieorganicznego o srednicy porów 100—55000 A nadmiaru dwufunkcyjnego monomeru jaki przy¬ kladowo stanowi aldehyd glutarowy, dodatku po¬ limeru o niskim ciezarze czasteczkowym jaki przy¬ kladowo stanowi TEP; i zawierajacy enzym, zwia¬ zany kowalencyjnie z wystajacymi grupami, utwo¬ rzonymi przez nadmiar aldehydu glutarowego, ma aktywnosc katalityczna znacznie wyzsza niz inne kompleksy," zawierajace enzym, które nie spelniaja powyzszych kryteriów. Stwierdzono, ze dostepnosc nadmiaru dwufunkcyjnego monomeru, takiego jak aldehyd glutarowy, w reakcji z TEP staje sie zu¬ pelnie oczywista, zwazywszy ze 75% lub wiecej do¬ prowadzonej TEP usuwa sie z porowatego nosnika nieorganicznego przed dodaniem aldehydu i ze na¬ stepnie wszystek nieprzereagowany aldehyd gluta¬ rowy jest równiez wymywany z kompleksu przed dodaniem enzymu.Przyklad XI. W celu zilustrowania obecnosci nadmiaru dwufunkcyjnego monomeru, przeprowa¬ dzono operacje wiazania, stosujac 2,7 g nosnika z krzemionki i tlenku glinu, zawierajacego fosfo¬ ran boru, i o trozmianach porów 100—155000 A. Roz¬ drobniony nosnik o czastkach o wymiarach 10—30 mesh traktowano 25 ml 2% roztworu TEP i po odr wodnieniu 25 ml 25% roztworu aldehydu glutaro¬ wego. Z tak otrzymanego podkladu organiczno- nieorganicznego*wymywano nieprzereagpwane rea¬ genty i suszono go pod zmniejszonym cisnieniem.Nastepnie okreslano zawartosc w nim organicznego polimeru, oznaczajac zawartosc azotu i wegla.Analiza wykazala zawartosc azotu 1,53% i wegla 13,7%, z czego obliczono, ze stosunek molowy alde¬ hydu glutarowego do TEP wynosil 8,2. Dlatego or¬ ganiczny material polimerycany musi zawierac wy¬ stajace grupy, zakonczone resztami aldehydowymi, z którymi moze wiazac sie kowalencyjnie enzym.Ponadto, produkt reakcji TEP z aldehydem gluta- rowym, sporzadzony podobnie przy uzyciu 4% roz¬ tworu TEP i 5% roztworu aldehydu glutarowego, wykazywal podczas analizy w podczerwieni obec- nosc grup karbonyiowych.Przyklad XII. Przeprowadzono dwie próby w celu zilustrowania faktu, ze podloza otrzymane wedlug wynalazku, zawierajace unieruchomiony enzym, moga byc stosowane w sposób ciagly w przeciwienstwie do znanych kompleksów, zawie¬ rajacych enzym, których nie mozna stosowac w operacjach, prowadzonych w sposób ciagly.W jednej próbie 22 g monolitu krzemionkowego, powleczonego tlenkiem glinu, zawierajacego laczace sie wzajemnie makrokanaliki, umieszczano w apa¬ racie typu kolumny, nadajacym sie do prowadze¬ nia w nim operacji ciaglego przeplywu. W kolum¬ nie tej monolit traktowano glukoamylaza na dro¬ dze prostej adsorpcji.W drugiej kolumnie 22 g monolitu poddano ob¬ róbce sposobem wedlug wynalazku, powodujac unieruchomienie w nim enzymu, to znaczy tirakto^ wano TEP, a nastepnie nadmiarem aldehydu glu¬ tarowego i do organiczno-nieorganicznego podloza dodawano glukoamylaze. W pierwszej kolumnie prowadzono hydrolize 30% gestego roztworu skrobi w temperaturze 45°C i przy czasie przebywania 2,38 godzin, uzyskujac 25% konwersji na gl^Jcoze i okres póltrwania 30 dni. W przeciwienstwie do tego w drugiej kolumnie, w której znajdowalo sie podloze otrzymane wedlug wynalazku, zawierajace unieruchomiony enzym, uzyskano w temperaturze 45°C konwersje okolo 38% przy czasie przebywa¬ nia 2,7 godziny bez zmniejszenia aktywnosci enzy¬ mu po 41 dniach prowadzenia operacji w sposób ciagly.Przyklad XIII. W celu zilustrowania koniecz¬ nosci obecnosci kopolimeru, wytworzonego w re- 50 akcji wielofunkcyjnego monomeru, polimeru o ni¬ skim ciezarze czasteczkowym, hydrolizowanego po¬ limeru lub wytworzonego wstepnie polimeru z dwu- funkcyjnym monomerem opisanego poprzednio ro¬ dzaju, sporzadzono kompleks, stosujac nosnik 55 z krzemionki i tlenku glinu, podobny do opisane¬ go w poprzednich przykladach. W jednym przy¬ padku jednak porowaty nosnik nieorganiczny trak¬ towano 4% roztworem TEP, a nastepnie dodawano glukoamylaze omijajac posrednie dodawanie alde- 60 hydu glutarowego.Otrzymany kompleks stosowano do konwersji % roztworu skrobi i stwierdzono, ze posiadal on aktywnosc 0,3 jednostek nagram. Gdy podobnie poddawano porowaty nosnik nieorganiczny obróbce 65 tylko 5% roztworem aldehydu glutarowego, a na- 40 45102119 stepnie dodatkiem glukoamylazy, aktywnosc kom¬ pleksu w odniesieniu do konwersji skrobi ma gli- koze wynosila zaledwie 1,0. Wykazuje to, ze zaden z tych reagentów jako taki nie sluzy do skutecz¬ nego unieruchomienia enzymu w nieorganicznym nosniku.Przyklad XIV. W celu zilustrowania skutecz¬ nosci dzialania i wysokiej aktywnosci kompleksu, zawierajacego jako unieruchomiony enzym laktaze, przeprowadzono szereg prób z porowatymi nosni¬ kami nieorganicznymi o róznej konfiguracji.W pierwszej próbie kulki tlenku glinu o srednicy 3475 mim, w których 51% porów ma rozmiary 500—(1000 A, a 27!% porów ma irózmiaiy 300^500 A pozornym ciezarze nasypowym 0,3 1 powierzchni wlasciwej 184 m2/g poddano obróbce 25 ml 2% roz¬ tworu TEP. Wartosc pH roztworu doprowadzone do 3,5, usunieto nadmiar roztworu i dodano 25 ml 6,6% roztworu aldehydu glutarowego.Otrzymany podklad organiczno-nieorganiczny przemywano i dodawano do niego 1000 mg laktazy, rozpuszczonej w 25 ml wody. Powstaly kompleks, zawierajacy unieruchomiony enzym, przemywano i stosowano jako katalizator/Kompleks, wytworzo¬ ny w tej partii mial aktywnosc 152,7 jednostek na gram i wydajnosc sprzegania okolo 14%. 16 kompleks, zawierajacy unieruchomiony enzym, wy¬ tworzony z kulek tlenku glinu o powierzchni wlasciwej 19 m2/g, w których 68% porów ma roz¬ miary 1000—1750 A, traktowanych kolejno & ml • 2,5% roztworu TEP, 25 ml 25% roztworu aldehydu glutarowego i 200 ml preparatu laktazy, sprzeda¬ wanego jako Lactase-LP produkcji firmy Waller- stein i zawierajacego okolo 10% enzymu i 90% sacharozy, rozpuszczonego w 10 ml wody, mial w otrzymanej partii aktywnosc 409 jednostek na gram i wydajnosc sprzegania 75,8%.Przyklad XV. W celu zilustrowania oddzia¬ lywania nadmiaru dwufunkcyjnego monomeru wo¬ bec poczatkowych dodatków, z kulek z tlenku gli- nu o srednicy 3,175 mm, sporzadzono szereg kom¬ pleksów, zawierajacych jako unieruchomiony en-, zym laktaze, stosujac rózne stosunki molowe al¬ dehydu glutarowego do TEP. W sposób podobny do opisanego w poprzednich przykladach sporza- dzono rózne kompleksy, zawierajace enzym, sto¬ sujac równa objetosciowo i(25 ml) ilosc TEP i al¬ dehydu glutarowego. Wyniki tych prób przedsta¬ wiono w tablicy 1.. Tablica 1 Gdy opisany poprzednio rozdrobniony nosnik o rozmiarach 40—80 mesh poddano procedurze wia¬ zania enzymu, w której stosowano 25 ml 6% roz¬ tworu TEP o pH=)3,5 usuwano nadmiar roztworu i nastepnie dodawano 39,7 ml 25% roztworu alde¬ hydu glutarowego, po czym calosc przemywano i dodawano 250 mg laktazy w 25 ml wody, stwier¬ dzono, ze kompleks wytworzony w tej partii mial aktywnosc 328,1 jednostek na gram i wydajnosc sprzegania 62,1%, przy czym jedna jednostka ak¬ tywnosci oznacza wytwarzanie 1 mikromola gliko- zy w ciagu minuty o stezeniu 40% z 20% roztworu laktozy przy pH=4,2 w ciagu 0,5 godziny prowa¬ dzenia próby.W próbie tej kulki z krzemionki i tlenku glinu o srednicy 1,587 mm i o porach, z których 43,6% ma rozmiary 500^1000 A, a 18,1% rozmiary 1000— —1750 A, przeprowadzano w podloze nieorgandozno- organiczne, stosujac 25 ml 2% roztworu TEP, na¬ stepnie 25 ml 6,6% roztworu aldehydu glutarowego, przemycie i wreszcie obróbke 100 ml laktazy w 25 ml wody.Powstaly kompleks, wytworzony w tej partii, mial aktywnosc okolo 218 jednostek na gram i wy¬ dajnosc sprzegania 60,0%. W próbie tej geste kulki z gamma — tlenku glinu, wytworzone w operacji marumeryzacjl, w których 86% porów ma roz¬ miary 1000^1750 A i o (powierzchni wlasciwej za¬ ledwie 9,0, m2/g, traktowano 8 ml 6,25% roztworu TEP, usuwano nadmiar roztworu i dodawano 25 ml 13,2% roztworu aldehydu glutarowego, wytwa¬ rzajac podloze do którego po przemyciu dodawano 250 mg laktazy w 10 ml wody, aby zwiazac kowa¬ lencyjnie enzym z podlozem.Próbka otrzymanego kompleksu, zawierajacego enzym wykazywala aktywnosc 195,6 jednostek na gram i wydajnosc sprzegania 42,2%. Podobny tu En 1 ^0 1 ®~" 2fl 2,0 2,0 6,0 6,0 % aldehydu gluta¬ rowego yl,32 \6,6 25i,0 3,96 119,82 Stosunek molowy doprowa¬ dzonych aldehydu glutaro¬ wego: TEP 1,25 6,25 23/,6 Ji,25 6,25 pH. roztworu •HEP 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 Akty¬ wnosc otrzyma¬ nej partii kompleksu jedn./g 77,5 1318,4 1)84,9 140,5 190,9 Dodatkowo przeprowadzono inna serie prób w celu wykazania, ze pH przy którym enzym zo¬ staje zwiazany kowalencyjnie z podlozem orga¬ niczno-nieorganicznym, moze zmieniac sie w sto¬ sunkowo szerokich granicach 3—11 i wiecej. Jak i w poprzednich próbach, kulki z tlenku glinu o srednicy 3,175 mm traktowano 25 ml roztworu al¬ dehydu glutarowego, tworzac podloze organiczno- nieorganiczne. Jak i w poprzednich opisanych spo¬ sobach unieruchamiania enzymu, staly porowaty nosnik, zawierajacy TEP, przemywano i odwad¬ niano przed dodaniem roztworu aldehydu glutaro¬ wego. Podloze organiczno-nieorganiczne przemywa¬ no, usuwano nadmiar roztworu i traktowano 500 mg preparatu laktazy, opisanego w przykladzie XIV, na gram nosnika. Dodawanie roztworu TEP prowadzono, jak wspomniano poprzednio, przy róznych wartosciach pH. Wplyw pH na aktywnosc zwiazanej laktazy podano w tablicy 2. ' 10 40 45 50 55 6017 Tablica 2 PH, roztworu TEP 11,3 6,0 4,5 3,0 ¦11,3* 6,0 3,5 ,TEP 3,0 2,0 A0 2,0 6,0 6,0 ' 6,0 aldehydu- gluta- rowego 6,6 6,6 6,6 6,6 19,82 1&,82 19,82 Aktywnosc otrzymanej partii aoi,4 131,2 138,4 152,7 77,5 * 1=22,3 190,9 Przyklad XfVI. W celu wykazania, ze tylko niewielka czesc doprowadzonego TEP jest absor¬ bowana na stalym nosniku po obróbce tego nos¬ nika roztworem TEP i nastepnie usunieciu nadmia¬ ru roztworu, co w warunkach reakcji zapewnia na¬ wet wyzsze stosunki molowe aldehydu glutarowego do TEP niz wynikaloby to z obliczen na podstawie wzajemnego stosunku ilosci doprowadzonych mate¬ rialów, 2 g kulek z tlenku glinu o srednicy 3,175 mm traktowano 25 ml roztworu TEP b stezeniu 1-—50%. W pierwszej serii prób, cztery próbki ku¬ lek z tlenku glinu traktowano roztworami o ste¬ zeniu TEP, wynoszacym 4—50% przy pH okolo 11,5.Po usunieciu nadmiaru cieczy z nosnijca, poddawa¬ no go analizie, uzyskujac wyniki, przedstawione w tablicy 3.Tablica 3 Stezenie doprowa¬ dzonej TEPw% 4,0 8,0 Ii6,0 So,o Ilosc doprowa¬ dzonej TEP wg 1,0 2,0 4,0 12,5 Ilosc zaadsorbo- wanego TEP wg 0,069 0,109 . 0,234 0,666 % zaad- sorbowa- nego TEP 6,9 ,5 ,0 ,3 Gdy powtórzono próby, -poddajac nosnik obróbce czterema roztworami o stezeniu, zmieniajacym sie od 1% do 12% i o pH, doprowadzonym do wartosci 4,0 dodatkiem kwasu solnego, analiza nosników po usunieciu roztworu dala nastepujace wyniki, przed¬ stawione w tablicy 4.Tablica 4 Stezenie 1 doprowa- [ dzonej TEPw% 1,0 2,0 6,0 12*0 Ilosc doprowa¬ dzonej TEP wg 0S,25 0,50 1,50 3,00 Ilosc zaadsorbo- wanej TEP w g 0,0146 0j,0168 0,0984 0,1742 % zaad- sorbowa- wanjej TEP ,84 3,36 6,56 ' 2»w 119 18 Przyklad XVII. W przykladzie tym kolumne wypelniano kulkami z tlenku glinu, wytworzony- . mi na drodze marumeryzacji. Kulki te traktowano nastepnie, jak opisano poprzednio, przez dodanie roztworu TEP, a po usunieciu nadmiaru roztworu przez dodanie nadmiaru roztworu aldehydu gluta¬ rowego. Kompleks, zawierajacy unieruchomiony enzym, otrzymywano, poddajac otrzymane podloze organiczno-nieorganiczne obróbce laktaza.Nastepnie kompleks, zawierajacy unieruchomio¬ ny enzym, stosowano jako katalizator do obróbki zarówno roztworu laktazy, jak i odsaczonej ser¬ watki. Proces w instalacji prowadzono w tempera¬ turze 40°C w ciagu 620 godzin, stosujac objetoscio- wa predkosc przeplywu na jednostke objetosci kompleksu, wynoszaca okolo 5,0. Otrzymane wy¬ niki przedstawiono w tablicy 5.Tablica 5 l i 0 gtS S N o +¦» &s3 w cd 8 "3 * fi o 0) „ y f B & s Calkowit wu stru ru lakto serwatki (w godzi 241,0 ' 257,5 280,2 287,0 304,2 312,8 329,0 335,8 424,2 432,2 448,2 452,2 456,2 570,0 I 574,0 592,2 598,0 601,0 615,5, 620,2 , ' cd .3-O a/cd aczen ach o zpocz dzani Czas ozn w godzin chwili ro doprowa serwatki 0,0 16,5 39,2 45,0 63,2 71,8 88,0 94,8 183,2 191,2 207,2 ' 211,2 215,2 329,0 333,0 3$1,2 357,0 360,0 374,5 379,2 I Ilosc wy¬ tworzonej glikozy (mg/ml) 17,3 17,65 17,75 17,0 17,15 17,15 '16,0 16,45 16,7 17,05 17,0 17,15 17,50 16,1 ,25 17,65 1 117,3 17,4 17,05 17,1 %i kon¬ wersji 65,8 67,1 67,5 64,6 65,2 65,2 60,8 62,5 63,5 64,8 64,6 65,2 66,5 61,2 58,0 ~ 67,1 65,8 66,2 64,8 65i,0 55 Widac wyraznie, ze podloza otrzymane wedlug wynalazku, zawierajace unieruchomiona enzym utrzymuja stosunkowo stala aktywnosc w odnie¬ sieniu do procentowej konwersji odcedzonej ser¬ watki, zawierajacej laktaze, na glikoze i galaktoze 60 w ciagu 620 godzin próby.W przeciwienstwie do tego, gdy laktoze adsorbo- wano na kulkach, otrzymanych na drodze .murme- ryzacji bez wczesniejszego sporzadzania, jako skladnika podloza, organicznego polimeru, kon- 65 wersja na glikoze i galaktoze spada ze 100% na19 poczatku próby do okolo 28% Pod koniec próby trwajacej 450 godzin.Przyklad XVIII. W przykladzie tym przepro¬ wadzono dodatkowa serie prób, w których kulki z tlenku glinu o rozmiarach 12/20 inesh, pozornym ciezarze nasypowym (ABD) 0,93, powierzchni wla¬ sciwej 7 m2/g i takim rozkladzie porów, ze okolo 97% z nich ma rozmiary 300—1750 A, kontaktowa¬ no w ciagu okolo 1 godziny w temperaturze okolo °C i z okresowym wytrzasaniem, z 6,25% wo¬ dnym roztworem TEP, a nastepnie dekantowano i tak otrzymany nosnik zraszano woda destylo- ^wana.Kulki z tlenku glinu, zawierajace zaadsorbowany TEP, traktowano nastepnie róznymi ilosciami 25% wodnego roztworu aldehydu glutarowego w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wytrzasajac mieszanine, po czym wymywano nieprzereagowany aldehyd glutarowy woda i do¬ dawano enzym w postaci wodnego roztworu, za¬ wierajacego laktaze. Kulki po takiej obróbce po¬ zostawiano w ciagu 3 godzin w temperaturze po¬ kojowej w zetknieciu z roztworem, zawierajacym enzym, a nastepnie przemywano woda i roztworem, buforowym o pH=4,2 w celu usuniecia niezwiaza- nego enzymu. W próbach tych stosunek molowy aldehydu glutarowego do zaadsorbowanego TEP zmienial sie od 0 do 10.Rózne otrzymane kompleksy, zawierajace nie¬ przereagowany enzym, umieszczano nastepnie w oddzielnych kolumnach, pracujacych w sposób ciagly w ciagu 41 dni, przy czym jako roztwór sub- stratu stosowano 5% wodny roztwór laktozy, za¬ wierajacy 0,5% NaCl. Pod koniec próby mierzono pozostala aktywnosc kompleksów, zawierajacych enzym, a otrzymane wyniki podano w tablicy 6.Tablica 6 Stosunek molowy aldehydu glutarowego do zaadsorbowanego TEP 1 0,1 0 (suma TEP pod nie¬ obecnosc aldehydu glutarowego) Pozostala aktywnosc % 42 [ 31 brak aktywnosci Dane te wskazuja - wyraznie, ze dla uzyskania najlepszych warunków nalezy stosowac nadmiar al¬ dehydu glutarowego w stosunku do zaadsorbowa- nej TEP, w celu wytworzenia takich kompleksów, zawierajacych enzym, które zachowuja znaczna aktywnosc po stosunkowo dlugim okresie pracy.Przyklad* XIX. Sporzadzono dalsza serie Kompleksów zawierajacych unieruchomiony enzym, w celu zilustrowania róznicy pomiedzy podlozem nosnikowym unieruchomionego enzymu, wytworzo¬ nym*sposobem wedlug wynalazku, a koncentratem 2119 unieruchomionego enzymu, w którym podloze nos¬ nikowe zredukowano borowodorkiem sodu w celu wyeliminowania aldehydowych grup funkcyjnych przed dodaniem enzymu. Nosnik z tlenku glinu o pozornym ciezarze nasypowym 0,82, powierzchni wlasciwej 14 m2/g, zawierajacy 88% porów o roz¬ miarach 300—1500 A i o rozmiarach czastek 20/40 mesh traktowano 4 ml 6,25% wodnego roztworu TEP na gram nosnika. io Po zdekantowaniu i zroszeniu woda w celu usu¬ niecia nadmiaru TEP, nosnik nr 1 poddany opisanej obróbce, kontaktowano z 2 ml 25% wodnego roz¬ tworu aldehydu glutarowego na gram nosnika, nos¬ nik nr 2 z 1,5 ml roztworu aldehydu glutarowego, a nosnik nr 3 z 3 ml tego samego roztworu. Tak otrzymane podloze nr 3 traktowano wodnym roz¬ tworem borowodorku sodu az do zredukowania wszystkich wolnych grup aldehydowych. Wskazu¬ je na to negatywny wynik próby barwienia rea- genta fuksynowego, wskazujacego obecnosc grup aldehydowych, podczas, gdy przed redukcja boro¬ wodorkiem wynik tej próby byl pozytywny, wska¬ zujac na obecnosc wolnych grup aldehydowych.Nastepnie wszystkie podloza traktowano równymi ilosciami wodnego roztworu amyloglukozydazy.Trzy otrzymane kompleksy, zawierajace unierucho¬ miony enzym, umieszczono w oddzielnych kolum¬ nach, stosujac w kazdej kolumnie próbki komplek¬ su po 2 ml kazda. Przez tak wypelnione kolumny 80 przepuszczano w ciagu 1 godziny z predkoscia 2,5 ml/minute dostepny w handlu, czesciowo: zhy- drolizowany roztwór skrobi (D.E.=15). Pod koniec próby odciek analizowano na zawartosc glikozy w celu okreslenia aktywnosci kompleksów.Po oznaczeniu aktywnosci kompleksy przemy¬ wano wodnym roztworem chlorku sodu, a nastep¬ nie roztworem mocznika, aby ulatwic desorpcje en¬ zymu, zaadsorbowanego fizycznie, w przeciwien¬ stwie do enzymu, zwiazanego kowalencyjnie. Przez kompleksy ponownie przepuszczano zhydrolizowa- ny roztwór skrobi w ciagu dodatkowej godziny.Odcieki z kazdej kolumny analizowano, stwierdza¬ jac, ze oba kompleksy, wytworzone sposobem we¬ dlug wynalazku, zachowuja okolo 80% poczatkowej aktywnosci, podczas gdy kompleks zredukowany podczas przygotowania borowodorkiem sodu zgod¬ nie ze sposobem, opisanym przez Haynesa i innych, stracil ponad 50% swej poczatkowej aktywnosci. 50 Nastepnie kompleksy uzywano w dalszej, ciaglej operacji rozkladu skrobi w ciagu 20 godzin, po za¬ konczeniu której oznaczona aktywnosc kompleksu nr 1 wynosila 70% aktywnosci istniejacej w chwili rozpoczecia operacji ciaglej, podczas gdy aktywnosc 55 kompleksu nr 3 wynosila zaledwie 43% aktywnosci wystepujacej na poczatku operacji ciaglej. Widac stad, ze redukcja wolnych grup aldehydowych przed zwiazaniem enzymu znacznie zmniejsza trwalosc kompleksu. 60 Przyklad XX. Dla zilustrowania wplywu pH na wytwarzanie podloza nosnikowego, z którym kowalencyjnie wiaze sie enzym, przeprowadzono dalsza serie prób. Kulki tlenku glinu o powierzchni wlasciwej 11 m2/g, w których 98% porów ma roz- 65 miary 500—1750 A, (traktowano zgodnie ze sposo- S102 119 21 bem wedlug wynalazku wodnym roztworem TEP i aldehydu glutarowego. Enzym, zwiazany nastepnie z podlozem z polimeru i nieorganicznego tlenku, stanowila amyloglukozydaza. W kazdym z trzech przypadków nosnik z tlenku organicznego trakto¬ wano 6% wodnym roztworem TEP i 12,5% roztwo¬ rem aldehydu glutarowego. W kompleksach nr 1 i nr 2 pH roztworu aldehydu glutarowego, stosowa¬ nego do wytworzenia podloza z polimeru i nieorga¬ nicznego tlenku, utrzymywano na poziomie 7,0 pod¬ czas gdy w przypadku kompleksu nr 3 na poziomie 3,5. Przygotowano tez kompleks nr 4, postepujac podobnie, jak w przypadku kompleksu nr 1 z tym, ze przed dodaniem enzymu podloze z polimeru i nieorganicznego tlenku zredukowano dodatkiem borowodorku sodu i zbadano na obecnosc wolnych grup aldehydowych reagentem fuksynowym. Jak poprzednio, kompleksy stosowano do obróbki roz¬ tworu hydrolizowanej skrobi w wypelnionych ko¬ lumnach wedlug nastepujacego sposobu postepo¬ wania.Najpierw wszystkie cztery kompleksy przemyto kolejno wodnym roztworem chlorku sodu i wod¬ nym roztworem mocznika, a nastepnie uzyto do obróbki hydrolizowanej skrobi. Po przepuszczaniu skrobi przez kolumny w ciagu 1 godziny, odciek badano na zawartosc glikozy w celu oznaczenia aktywnosci kompleksów, zawierajacych unierucho¬ miony enzym. Nastepnie kompleksy przemyto wodnym roztworem chlorku sodu, wodnym roztwo¬ rem mocznika i zakwaszonym roztworem moczni¬ ka, po czym powtórzono ponownie obróbke skrobi.Wyniki tych prób podano w tablicy 7.Kompleks nr Jednostek aktywnosci/ g/nosnika Jednostek aktywnosci/ /g nosnika Ta 1 blica 7 2 3 4 Po obróbce wodnym roztworem chlorku sodu i mocznika 1,7 1,9 1,5 ¦1,3 Po dalszym przemyciu wodnym roz¬ tworem chlorku sodu, mocznika i zakwaszonym roztworem mocznika 1,7 1,7 ,1,4 1,0 Z tablicy 7 widac, ze dwa kompleksy (nr nr 1 i 2), wytworzone sposobem wedlug wynalazku, w któ¬ rych osiagnieto powstanie polimeru, utrzymujac pH roztworu aldehydu glutarowego 7,0, wykazywa¬ ly po serii przemyc dobra aktywnosc, w przeci¬ wienstwie do kompleksu nr 4, który zostal wytwo¬ rzony w znany sposób, to jest przez redukcje boro¬ wodorkiem sodu przed traktowaniem enzymem, i chociaz w tym przypadku równiez utrzymywano pH=7,0, wykazywal mniejsza aktywnosc po pierw¬ szych przemyciach wodnym roztworem chlorku so¬ du i mocznika, z dalsza strata aktywnosci po ^prze- 45 50 55 60 22 myciu dodatkowymi ilosciami wodnych roztworów chlorku sodu, mocznika i zakwaszonego mocznika.Wskazuje to ponownie, ze usuniecie grup aldehy¬ dowych przez redukcje borowodorkiem powoduje utworzenie mniej trwalego kompleksu, zawieraja¬ cego enzym, spowodowane strata miejsc, w któ¬ rych moze powstac wiazanie kowalencyjni.Przyklad XXI. W celu zilustrowania wplywu, wywieranego przez dodawanie -do nieorganicznego nosnika, zawierajacego zaadorbowana TEP, na ak¬ tywnosc otrzymanego kompleksu, zawierajacego unieruchomiony enzym, wytworzono dodatkowa serie kompleksów. Ponownie nosnik stanowily czastki tlenku glinu o powierzchni wlasciwej 11 m2/g, zawierajacych 98% porów o rozmiarach 500—1750 A i o rozmiarach czastek 30—40 mesh.Nosnik traktowano 6% wodnym roztworem TEP i po zdekantowaniu i zroszeniu woda dodawano ml 25% roztworu aldehydu glutarowego w czte¬ rech porcjach, po 5 ml kazda.Po dodaniu kazdej porcji calosc wytrzasano i dekantowano faze ciekla. Z czesci nosnika z tlen¬ ku nieorganicznego, poddanego takiej obróbce, wytwarzano kompleks, zawierajacy unieruchomio¬ ny enzym, dodajac amyloglukozydaze, podczas gdy druga czesc przed dodaniem enzymu redukowano borowodorkiem sodu. Oba kompleksy uzywano do obróbki roztworu hydrolizowanej skrobi podobnie, jak opisano w przykladzie XX, przy czym oznaczo¬ no aktywnosc kompleksu przez oznaczenie ilosci glikozy w odcieku. Wyniki tych prób po kolejnym przemyciu roztworem chlorkiem sodu i mocznika o róznym pH podano w tablicy 8, w której kom¬ pleks nr 1 stanowi kompleks, wytworzony sposo¬ bem wedlug wynalazku, a kompleks nr 2 jest kompleksem, wytworzonym w znany sposób.Tablica 8 Aktywnosc poczatkowa Po przemyciu NaCl i mocznikiem' (pH=8,5) Po 4 dniach odpoczyr poko] Aktywnosc poczatkowa Po przemyciu NaCl Po przemyciu mocznikiem pH=4,2 Po przemyciu NaCl, pH= 4,0 Po przemyciu NaCl, pH=8,5 Po przemyciu mocznikiem, pH=3,3 Aktywnosc (jednostek) g nosnika Nr 1 2,4 2,3 lku w tempe owej '2,0 2,0 2,0 1,9 li,8 0,5 Nr 2 1 2,0 1,5 raturze 1,2 1,1 1,0 ' 10,9 ,0,8 0,2 | Z powyzszego porównania dwóch kompleksów 65 widac wyraznie, ze oprócz wyzszej aktywnosci po-23 czatkowej, kompleks, wytworzony sposobem wedlug wynalazku, zachowuje swoja aktywnosc na sto¬ sunkowo wysokim poziomie przy znacznie dluz¬ szym przemywaniu w róznych warunkach pH niz kompleks, wytworzony w sposób znany. Stosunko¬ wo duzy spadek aktywnosci obu kompleksów przy 3,3 powodowany jest niewatpliwie dobrze znanym oddzialywaniem dezaktywujacym takiego kwasne¬ go srodowiska na amyloglukozydaze.Przyklad XXII. W dalszych próbach nosnik z tlenku glinu, stosowany do wytwarzania kom¬ pleksów, zawierajacych unieruchomiony enzym, jak opisano w przykladzie XXI, traktowano 5% wod¬ nym roztworem polietylenoiminy (ciezar czastecz¬ kowy 1800, produkcji Dow Chemical Co.) ("PEI-18").Tlenek glinu, poddany próbce wspomnianym roz¬ tworem polietylenoiminy, traktowano nastepnie aldehydem glutarowym i wreszcie amyloglikozyda- za zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku, wy¬ twarzajac kompleks nr 1. Kompleks nr 2 wytwa¬ rzano z posrednia redukcja borowodorkiem, ale bez koncowego etapu sieciowania z aldehydem glu¬ tarowym z nastepnym dodaniem enzymu. Po¬ dobnie, jak kompleks nr 2, wytwarzano kompleks nr 3, z tym, ze sieciowano go przez dalsze doda¬ nie aldehydu glutarowego. Kompleksy nr 4 i 5 wy¬ twarzano w sposób podobny, jednak bez usuwania i dekantowania niezaadsorbowanej "PEI-18", przy czym kompleks nr 4 wytwarzano bez koncowego sieciowania, a kompleks nr 5 z koncowym siecio¬ waniem.Nastepnie wytworzone kompleksy stosowano do obróbki roztworu hydrolizowanej skrobi, jak opi¬ sano poprzednio. Po obróbce roztworu skrobi i oznaczeniach aktywnosci, wszystkie piec kom¬ pleksów przemyto, przy czyni pierwsze przemywa¬ nie prowadzono destylowana woda, a nastepnie bu¬ forem octanowym o pH=4,2, drugie 2 molarnym roztworem chlorku sodu, a trzecie roztworem chlorku sodu i glikolu etylenowego, podczas gdy czwarte przemywanie prowadzono ponownie 2 mo¬ larnym roztworem chlorku sodu. Jak i w poprzed¬ nich próbach, po kazdym przemyciu kompleksy stosowano do obróbki hydrolizowanej skrobi i oz¬ naczano ich aktywnosc po uplywie 1 godziny. Wy¬ niki tych prób podano w tablicy 9.Tablica 9 Kompleks nr Aktywnosc poczatkowa (jednostek/gram) A — Przemywa¬ nie nr 1 B — Przemywa¬ nie rur 2 C — Przemywa¬ nie nr 3 D'— Przemywa¬ nie nr 4 1 2,5 2,5 2,4 2,3 2,2 2 1,8 1,6 1,2 1,1 1,0 3 1,1 1,0 1,0 0,9 0,9 4 2,9 2,7 1,9 1,8 1,6 1,9 1,9. 1,9 1,8 1,6 1119 24 Wyniki, podane w tablicy 9, wskazuja, ze kom¬ pleksy, wytworzone sposobem wedlug wynalazku, maja stosunkowo wyzsza aktywnosc poczatkowa, która zachowuja w duzym stopniu nawet po po- wtarzajacym sie przemywaniu róznymi wskazany¬ mi roztworami, w przeciwienstwie do kompleksów, wytwarzanych w znany sposób, z zastosowaniem redukcji borowodorkiem sodu, wykazujacych albo w duzym stopniu strate aktywnosci po powtarza¬ lo jacych sie przemywaniach {nr 2 i 4) albo, jesli za¬ chowuja w stosunkowo duzym procencie aktyw¬ nosc, jak po przemyciach nr 3 i 5, w których sto¬ suje sie koncowe sieciowanie, ich poziom aktyw¬ nosci jest mniejszy niz aktywnosc kompleksu, za- wierajacego enzym unieruchomiony na podlozu otrzymanym wedlug wynalazku (nr 1).Przyklad XXIII. W celu zilustrowania ko¬ niecznosci wykorzystywania porowatego nosnika nieorganicznego o podanej poprzednio charaktery- styce, to jest o odpowiednich srednicach porów, powierzchni wlasciwej itd., przeprowadzono szereg prób, w których wytwarzano • podloze nosnikowe do unieruchamiania enzymów sposobem wedlug wynalazku. Ponadto sporzadzono takze inny pod- 26 klad nosnikowy, stosujac jako nosnik nieorganicz¬ ny koloidalna krzemionke, która poddano obróbce polietylenoimina i aldehydem glutarowym w zna¬ ny sposób.Zgodnie ze znanym sposobem dla wytworzenia dajacej sie mieszac zawiesiny kompleksu, przy intensywnym mieszaniu do zawiesiny krzemionki koloidalnej, poddanej. obróbce polietylenoimina, do¬ dawano powoli 2,5% wodny roztwór aldehydu glu¬ tarowego. Rezultatem takiego dodawania byla aglomeracja krzemionki i tak utworzonego polime¬ ru z wytworzeniem masy trudnej do obróbki. To samo nastepuje równiez, gdy krzemionke koloi¬ dalna, poddana obróbce polietylenoimina, odwirowy¬ wano najpierw od niezaadsorbowanej polietyleno- 40 iminy i nastepnie dodawano do 25% roztworu al¬ dehydu glutarowego.Wynika z tego jasno, ze podklad nosnikowy, z którym mozna wiazac kowalencyjnie enzym, nie moze byc wytwarzany, gdy stosuje sie czastki o rozmiarach koloidalnych.Z a s t r z e zr&n ia patentowe 50 i. Sposób wytwarzania podloza dla unierucho¬ miania enzymów, w którym porowaty nosnik nie¬ organiczny traktuje sie w temperaturze 5—60°C roztworem pierwszego wielofunkcyjnego polimeru, nadmiar niezaadsorbowanego roztworu usuwa sie, 55 nosnik z zaadsorbowanym pierwszym wielofunk¬ cyjnym polimerem kontaktuje sie z reaktywnym roztworem drugiego dwufunkcyjnego monomeru, z otrzymanego nieorganiczno-organicznego podloza usuwa sie nadmiar nieprzereagowanego roztworu 60 i obdziela podloze, znamienny tym, ze porowaty nieorganiczny nosnik, taki jak y-tlenek glinu, dwu¬ tlenek krzemu, dwutlenek cyrkonu, dwutlenek krzemu — tlenek magnezu, dwutlenek krzemu — dwutlenek cyrkonu — tlenek glinu lub dwutlenek 65 krzemu — tlenek glinu o srednicy porów 100— .102 119 —55000 A i powierzchni wlasciwej 1—500 m2/g, traktuje sie roztworem rozpuszczalnej w wodzie poliaminy jako pierwszego wielofunkcyjnego poli¬ meru, takiej jak etylenodwuamina, dwuetyleno- trójamina, trójetylenoczteroamina, czteroetyleno- piecioamina, piecioetylenoszescioamina, szesciome- tylenodwuamina lub polietylenoimina, usuwa sie niezaadsorbowana poliamine, traktowany nosnik kontaktuje sie z roztworem, zawierajacym molowy nadmiar dwufunkcyjnego monomeru, takiego jak aldehyd glutarowy lub toluenodwuizocyjanian, nastepnie po przereagowaniu tego monomeru z ru- 26 chomymi wystajacymi grupami aminowymi polia¬ miny, zaadsorbowanej na nosniku, z otrzymanego nieorganiczno-organicznego podloza usuwa sie nieprzereagowany nadmiar roztworu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie mieszanine reakcyjna, w której znajdu¬ je sie 3—50 moli dwufunkcyjnego monomeru na mol rozpuszczalnej w wodzie poliaminy. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako nieorganiczny nosnik stosuje sie dwutlenek krzemu — tlenek glinu, zawierajace fosforan boru. PL PL