FI92074B - Menetelmä entsyymien immobilisoimiseksi kiinnittämällä ne rakeiseen piimaahan - Google Patents

Description

92074

Menetelmä entsyymien immobilisoimiseksi kiinnittämällä ne rakeiseen piimäähän Tämä keksintö koskee immobilisoitua entsyymikonju-5 gaattia ja tällaisen konjugaatin valmistusmenetelmää. Tarkemmin sanottuna entsyymi immobilisoidaan tukimateriaaliin, jona on rakeinen piimää.

Entsyymit, jotka ovat laadultaan proteiineja ja yleensä vesiliukoisia, toimivat biokatalyytteinä, jotka 10 säätelevät monia elävissä organismeissa tapahtuvia kemiallisia reaktioita. Entsyymejä voidaan myös eristää ja käyttää analyyttisiin, lääketieteellisiin ja teollisuuden käyttötarkoituksiin. Niitä käytetään esimerkiksi ruoan, kuten mm. juuston ja leivän, valmistukseen samoin kuin al-15 koholijuomien valmistukseen.

Koska entsyymit ovat tavallisesti vesiliukoisia ja myös yleensä epästabiileja, ne ovat alttiina deaktivoi-tumiselle, ja niitä on vaikea poistaa uudelleenkäyttöä varten liuoksista, joissa niitä käytetään. Nämä vaikeudet 20 lisäävät kustannuksia käytettäessä entsyymejä kaupallisen mittakaavan operaatioissa johtuen välttämättömyydestä korvata ne usein. Jotta vähennettäisiin entsyymien korvaamisesta aiheutuvia korkeita kustannuksia, on kehitetty erilaisia menetelmiä entsyymien immobilisoimiseksi eli kiin-25 nittämiseksi liikkumattomiksi (joskus tätä nimitetään liukenemattomaksi tekemiseksi) ennen niiden käyttöä. Entsyymin immobilisoiminen mahdollistaa sen käytön uudelleen, kun taas muussa tapauksessa se saattaisi deaktivoitua tai se voitaisiin menettää reaktioväliaineeseen, jossa sitä 30 käytetään. Immobilisoituja entsyymijärjestelmiä voidaan käyttää erilaisissa reaktorisysteemeissä, kuten esimerkiksi pakatuissa pylväissä ja sekoitetuissa säiliöreaktoreis-sa, riippuen biokatalyysin kohteena olevan substraatin laadusta.

35 On kuvattu useita yleisiä menetelmiä samoin kuin monia näiden muunnelmia, joiden avulla entsyymit voidaan 2 92074 immobilisoida. Esimerkiksi GB-patentissa 1 444 539 on esitetty materiaaleja, jotka soveltuvat käytettäviksi entsyymien tai entsyymejä sisältävien solujen immobilisointiin. Edullisesti entsyymejä tai soluja käsitellään veteen se-5 koittuvalla liuottimena, kuten esimerkiksi asetonilla, kuivataan ja käsitellään sitten polyeteeni-imiinillä ja glutaarialdehydillä veteen liukenemattoman rakenteen omaa-vien muotokappaleiden valmistamiseksi.

Erityisesti kuvataan US-patentissa 3 796 634 immo-10 bilisointimenetelmää, jossa polyamiinin annetaan absorboitua kolloidikokoa olevien hiukkasten pinnalle. Polyamiini ristiliitetään tavanomaisen amiinin kanssa reagoivan ris-tikytkentäaineen, esim. glutaarialdehydin, avulla ja saatua reaktiotuotetta käsitellään NaBH4: llä aldehydiryhmien 15 pelkistämiseksi, jotta estettäisiin kovalenttisten sidosten muodostuminen aldehydiryhmien ja entsyymin aminoryh-mien välille. Seuraavaksi annetaan entsyymin absorboitua hiukkasten käsitellylle pinnalle sellaisessa pH:ssa, että kolloidisella absorbantilla on nettosähkövaraus, joka on 20 vastakkainen entsyymimolekyylien varaukselle, jolloin io-nisidokset auttavat muita ei-kovalenttisia sitovia voimia. Patentissa kuvataan absorboivan aineen hiukkasten olevan kooltaan noin 50 - noin 20 000 Angströmin, edullisesti noin 100 - 200 Angströmin läpimitan omaavia, ja absorboi-25 van aineen olevan aktiivihiiltä, hydroksiapatiittia, alumiinioksidi C-gammaa tai bentoniittia. Tässä järjestelmässä entsyymin sitoutuminen käsiteltyihin hiukkasiin perustuu varausten keskinäisiin vaikutuksiin. Tämän tyyppinen sitoutuminen ei ole niin tavoiteltavaa kuin kovalenttisten 30 sidosten muodostuminen, koska ionien vuorovaikutukset ovat . alttiita ympäristöolosuhteille, jotka koskevat tämän tyyp pistä sidosta, kuten esimerkiksi pH:lie, ionivahvuudelle ja lämpötilalle.

Liu et ai. esittävät julkaisussa Biotechnol.

35 Bioeng. 17, 1695 - 1696, 1975 menetelmän laktaasin immobi-lisoimiseksi rakeisen hiilen pinnalle, jossa menetelmässä * « 3 92074 hiilen pinnalle absorboidaan p-amino-fenolia tai 1-fenoli- 2-amino-4-sulfonihappoa. Nämä absorboituneet yhdisteet tarjoavat aminoryhmät, joiden kanssa glutaarialdehydi reagoi ja puolestaan sitoo entsyymin. Mainitut aminoryhmän 5 sisältävät yhdisteet ovat monomeereja, joilla on erilaisia kemiallisia ja fysikaalisia ominaisuuksia kuin polyamii-nilla, kuten esimerkiksi polyeteeni-imiinillä.

Eräs toinen tutkijaryhmä (Cho et ai.. Immobilization of Enzymes on Activated Carbon: Properties of Immobi-10 lized Glucoamylase, Glucose oxidase and Gluconolactonase, Biotechnol. Bioeng. 20, 1651 - 1665, 1978) on myös immobi-lisoinut entsyymejä rakeisen hiilen pinnalle kovalentti-sesti sitoen. Tässä menetelmässä hiili aktivoidaan karbo-di-imidillä, jonka entsyymi voi korvata, jolloin muodostuu 15 entsyymi-hiili-kompleksi.

US-patentissa 4 141 857 esitetään menetelmä entsyymin immobilisoimiseksi, jossa käsitellään epäorgaanista huokoista kantajamateriaalia, kuten esimerkiksi gamma-alumiinioksidia, jonka huokosten läpimitat ovat noin 100 -20 noin 55000 Angströmia ja pinta-ala on noin 100 - 500 m2 grammaa kohti, veteen liukenevan polyamiinin liuoksella ja käsitellyn kantajamateriaalin annetaan olla kosketuksissa bifunktionaalisen monomeerisen aineen, esim. glutaarialde-hydin, liuoksen kanssa. Tämän käsittelyn jälkeen käsitel-25 ty kantajamateriaali on sopivaa reagoimaan entsyymin kans- ’ sa siten, että muodostuu kovalenttisia sidoksia entsyymin ja vapaiden aldehydiryhmien välille. Tämän patentin esimerkissä II on kuvattu immobilisoidun entsyymikonjugaatin valmistus käsittelemällä huokoisia alumiinioksidipalloja 30 peräkkäin polyeteeni-imiini-, glutaarialdehydi- ja gluko- amylaasiliuoksilla.

US-patentissa 4 438 196 esitellään menetelmä, jossa entsyymit kiinnitetään liikkumattomiksi rakeisen aktiivi-hiilen pinnalle. Tässä menetelmässä hiiltä käsitellään 35 vapaita aminoryhmiä sisältävällä polyamiiniyhdisteellä, jotta polyamiini kiinnittyisi hiileen jättäen amiiniryhmiä 4 92074 vapaiksi reagoimaan edelleen. Vapaista amiiniryhmistä tehdään johdoksia käsittelemällä ne difunktionaalisella yhdisteellä, jossa on amiinin kanssa reagoivia ryhmiä, niin että entsyymin vapaita amiiniryhmiä voidaan sitoa kova-5 lenttisesti polyamiiniin amiinin kanssa reagoivan yhdisteen välityksellä.

Tätä keksintöä kuvaavassa esimerkissä 11 osoitetaan, että kun kantajana käytetään piimaata, on immobili-soidun entsyymin termostabiilisuus paljon parempi kun käy-10 tettäessä US-patenttijulkaisussa 4 438 196 kuvattua hiili- perusteista kantajaa. US-patenttijulkaisun 4 438 196 mukaan hiiliperusteiseen kantajaan sidotulla entsyymillä on ylivoimainen kyky hajottaa pieniä oligosakkarideja (ks. taulukot 5 ja 6 sekä sarake 15, r. 50 - 62) verrattuna US-15 patenttijulkaisussa 4 292 199 kuvattuun alumiinioksidikan-tajaan sidottuun entsyymiin. Näin ollen, kun piimää on ylivoimainen verrattuna hiiliperusteiseen kantajaan, joka taas on osoitettu paremmaksi kuin alumiinioksidi, piimää on lisäksi kantajana parempi kuin alumiinioksidi.

20 US-patenttijulkaisun 4 186 053 esimerkissä 3, 4 ja 5 kuvataan reaktiotuotteen muodostamista silikageelin (esimerkit 3 ja 4) ja piimään (esimerkki 5) kanssa entsyymien sitomista varten. Reaktio suoritetaan oleellisesti seuraavasti: kantaja + glutaarialdehydi + 1,3-fenyleenidi-- 25 amiini, mutta tämän lisäksi kondensaatiotuotetta käsitellään vielä diatsotoimalla ennen entsyymin liittämistä siihen. Diatsotointivaihetta kuvataan esimerkissä 6, ja sen mukaan kondensaatiotuotetta (kantaja + glutaarialdehydi + 1,3-fenyleenidiamiini) käsitellään natriumnitriitillä 30 kloorivetyhapon läsnäollessa klassisessa diatsoniumsuolan muodostusreaktiossa:

ArNH2 + NaN02 + 2HC1 -> ArNH2+Cl" + NaCl + 2H20 35 US-patentti julkaisun 4 186 053 mukaan vasta diatso- niumsuola saatetaan reagoimaan entsyymin kanssa. Tämän 5 92074 keksinnön mukaisesti diatsoniumsuolaa ei muodosteta ennen entsyymin liittämistä kantajaan.

Todettakoon lisäksi, että em. US-patenttijulkaisussa kuvattu menetelmä kondensaatiotuotteen muodostamiseksi 5 myös reaktio-olosuhteiltaan poikkeaa tässä kuvatusta. Julkaisun esimerkeissä 1 ja 2 kuvataan vain amiinin ja glu-taarialdehydin kondensaatiota ilman kantajaa. Amiini liuotetaan orgaaniseen liuottimeen kondensaatiotuotteen muodostamiseksi, kun taas tämän keksinnön mukaisesti ei or-10 gaanista liuotinta käytetä.

Perustavaa laatua oleva ero keksinnön ja tämän tunnetun tekniikan välillä on se, että US-patenttijulkaisun 4 186 053 mukaisessa menetelmässä amiini lisäksi aktivoidaan muodostamalla siitä diatsoniumsuola ennen entsyymi-15 käsittelyä. Keksinnön mukaisessa menetelmässä taas ei glu-taarialdehydin ja amiinin muodostaman kondensaatiotuotteen aktivointi ole tarpeen entsyymiin liittämistä varten.

US-patenttijulkaisussa 4 141 857 kuvattu immobili-sointisysteemi muistuttaa tässä kuvattua, mutta kantajaa 20 käytetään -alumiinioksidia, piioksidia, zirkoniumoksidia, piioksidi/magnesiumoksidia, piioksidi/zirkoniumoksidi/-alumiinioksidia tai piioksidi/alumiinioksidia. Kuten edellä todettiin, on piimää edullisempi kantajamateriaalina kuin alumiinioksidi, jota taas todennäköisesti voidaan 25 pitää suhteellisen hyvänä edustajana ja kantajana em. julkaisussa luetelluista melko eksoottisista kantajista.

Tämä keksintö koskee menetelmää immobilisoidun entsyymikon jugaat in valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että se sisältää seuraavat vaiheet: 30 a) saatetaan huokoinen, rakeinen piimää kosketuk seen polyamiinin liuoksen kanssa, jonka liuoksen pH on 9 - 9,9 ja jolloin polyamiinin molekyylipaino on 500 -100 000 ja polyamiinilla on vapaita amiiniryhmiä, jolloin polyamiini kiinnittyy piimäähän; 35 b) poistetaan liuotin ja siinä mahdollisesti oleva kiinnittymätön polyamiini kosketuksesta piimään kanssa ja 6 92074 saatetaan näin käsitelty piimää kosketukseen amiinin kanssa reagoimaan kykenevän aineen liuoksen kanssa, joka aine on multifunktionaalinen aldehydi, multifunktionaalinen orgaaninen halogenidi, multifunktionaalinen anhydridi, mul-5 tifunktionaalinen atsoyhdiste, multifunktionaalinen iso-tiosyanaatti tai multifunktionaalinen isosyanaatti, jolloin yksi reaktiokykyisistä ryhmistä reagoi vapaiden amii-niryhmien kanssa ja amiinin kanssa reagoimaan kykenevä osa jää saataville lisäreaktiota varten; 10 c) poistetaan liuotin ja siinä mahdollisesti liuen neena oleva reagoimaton, amiinin kanssa reagoimaan kykenevä aine kosketuksesta piimaakantajamateriaalin kanssa, joka saatetaan kosketukseen liuoksen kanssa, jossa on vähintään yksi immobilisoitava entsyymi, jolloin entsyymin 15 tai entsyymien amiiniryhmät saatetaan reagoimaan reagoimattoman, amiinin kanssa reagoimaan kykenevän osan kanssa muodostaen kovalenttisia sidoksia näiden välille, jolloin entsyymi tai entsyymit immobilisoituvat.

Keksintö koskee myös inunobilisoitua entsyymikonju-20 gaattia, jolle on tunnusomaista, että se sisältää huokoista, rakeista piimaata, johon on kiinnitetty reaktiotuote, jonka ovat muodostaneet polyamiini, jonka molekyylipaino on 500 - 100 000 ja jossa on vapaita amiiniryhmiä, ja amiinin kanssa reagoimaan kykenevä aine, joka on multi-. . 25 funktionaalinen aldehydi, multifunktionaalinen orgaaninen halogenidi, multifunktionaalinen anhydridi, multifunktionaalinen atsoyhdiste, multifunktionaalinen isotiosyanaatti tai multifunktionaalinen isosyanaatti, jonka reagoimattomien, amiinin kanssa reagoimaan kykenevien ryhmien on an-30 nettu reagoida entsyymin tai entsyymien vapaiden amiini-ryhmien kanssa, jolloin entsyymi tai entsyymit ovat kiinnittyneet siihen.

Tässä keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa GDE:tä (rakeista piimaata). Hyvin sopiva 6DE on hiukkas-35 kooltaan edullisesti noin 0,32 - 1,118 mm US-seulasarjässä. Huokosten koko on edullisesti säteinä annettuna noin 7 92074 35 - 1000 Angströmiä, ja pinta-ala on edullisesti noin 20 - 60 m2/gramma.

Esimerkeissä käytetty huokoinen rakeinen piimää (toimittanut Eagle Pitcher Ind., Inc.) on mekaanisesti 5 lujaa ja kestää hyvin kuumuutta ja happamia ja emäksisiä liuoksia. Sen fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet ovat seuraavat:

Fysikaaliset ominaisuudet (tyypilliset): hiukkaskoko 0,32 - 1,118 mm 10 irtotiheys 575 kg/m3 muoto käytännöllisesti kat soen pallomainen murskausvastus noin 17,6 - 18,6 kg/cm2 hiukkasia 454 grammaa 15 kohti (0,85/1,118 mm) 13 miljoonaa hiukkasia 454 grammaa kohti (0,32/0,85 mm) 1 miljoona väri vaalea kullanruskea keskimääräinen pinta-ala 40 m2/gramma 20 keskimääräinen huokostilavuus 0,16 ml/gramma keskimääräinen huokosen läpimitta 155 Angströmiä

Kemialliset ominaisuudet (likimääräiset): piidioksidia (Si02) 90 % alumiinioksidia (A1203) 6,5 % 25 rautaoksidia (Fe203) 2,3 % kalkkia (CaO) 0,2 % magnesiumoksidia (MgO) 0,3 % muita oksideja 0,3 % hehkutushäviö (kosteuden lisäksi 30 105°:ssa) 0,4 % pH liuoksessa 6,5 - 7,0 kosteuspitoisuus vähemmän kuin 1,0 % rakenne pääasiallisesti amorfista piimaata 35 « 8 92074

Kemiallisen stabiiliuden, fysikaalisen lujuuden ja alhaisen hinnan johdosta tämä huokoinen GDE on erinomainen kantajamateriaali käytettäväksi pylväsreaktoreissa.

Erityisiä esimerkkejä polyamiineista, jotka sovel-5 tuvat käytettäviksi tässä keksinnössä ovat polyeteenidi-amiini, polyeteeni-imiini, kuten esimerkiksi polydieteeni-triamiini, polytrieteenitetramiini, polypentaeteeniheksa-miini tai polyheksametyleenidiamiini. Voidaan käyttää myös Betz 1180®; ää. Tämä on vesiliukoinen epihalogeenihydrii-10 nin ja polyamiinin kopolymeeri, ja sitä myy Betz Laboratories, Inc., Trevose, Pennsylvania. Muita sopivia poly-amiineja ovat polymetyleenidisykloheksyyliamiini, polyme-tyleenidianiliini, polytetraeteenipentamiini ja polyfeny-leenidiamiini. Vaikka polyamiinin molekyylipainoa ei pi-15 detä kriittisenä, pidetään parhaina polymeerejä, joiden molekyylipainoalue on 500 - 100 000. Ne polyamiinit, jotka ovat vesiliukoisia, lisätään GDE:hen vesiliuoksistaan, kun taas veteen liukenemattomat polymeerit lisätään orgaanisista liuottimista. Sopivia liuottimia ovat, mutta ne ei-20 vät rajoitu näihin, metyylialkoholi, etyylialkoholi, pro-pyylialkoholi, isopropyylialkoholi, t-butyylialkoholi, asetoni, metyylieetteri, etyylieetteri, propyylieetteri, isopropyylieetteri, tolueeni, bentseeni, ksyleeni, heksaa-ni, syklopentaani ja sykloheksaani.

25 Vaikka tarkkaa mekanismia ei tiedetä, uskotaan, että antamalla GDE:n olla kosketuksessa polyamiiniliuok-sen kanssa, jonka pitoisuus on yleensä suurin piirtein 1 -100 grammaa polyamiinia litraa kohti liuotinta, saadaan polyamiini kiinnittymään GDE-hiukkasen pintaan ja mahdol-30 lisesti jäämään loukkuun hiukkasen huokosiin. Siten, vaikka osan polymeeristä oletetaan adsorboituvan GDE-hiukkasen pinnalle, osan myös oletetaan joutuvan huokoisen kantaja-materiaalin huokosiin siten, että makromolekyyli työntyy esiin huokosesta jättäen saataville funktionaalisia ryhmiä 35 (aminoryhmiä) lisäreaktioita varten. Tämä menetelmä eroaa « 9 92074 jyrkästi aikaisenunasta menetelmästä, joka on kuvattu jo mainitussa US-patentissa 3 796 634, jossa hiilijauhetta käsitellään polyeteeni-imiinin liuoksella sen pintavarauk-sen muuttamiseksi ja siten entsyymin saamiseksi absorboi-5 tumaan muunnettuun kantaja-aineeseen. Tämä aikaisempi menetelmä perustuu varausten keskinäisiin vaikutuksiin, mikä ei ole ollenkaan niin tavoiteltavaa kuin kovalenttiset sidokset, joita muodostuu tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä. Käsitelty GDE poistetaan kosketuksesta polyamii-10 niliuoksen kanssa esimerkiksi dekantoimalla tai suodattamalla ja pestään edullisesti aikaisemmin mainitulla liuottimena, kuten esimerkiksi deionisoidulla (DI) vedellä, kaiken kiinnittymättömän polymeerin poistamiseksi.

Polyamiinilla käsiteltyä GDE:tä käsitellään seu-15 raavaksi liuoksella, jossa on sellaista multifunktionaa-lista amiinin kanssa reagoimaan kykenevää ainetta kuin glutaarialdehydi, bis-diatsobentsidiini-2,2'-disulfoni- happo, 4,4'-difluori-3,3'-dinitrodifenyylisulfoni, dife-nyyli-4,4'-ditiosyanaatti-2,2'-disulfonihappo, 3-metoksi-20 difenyylimetaani-4,41-di-isosyanaatti, tolueeni-2-isosya- naatti-4-isotiosyanaatti,tolueeni-2,4-di-isotiosyanaatti, diatsobentsidiini, diatsobentsidiini-3,3'-dianisidiini, N,N'-heksametyleenibisjodiasetamidi, heksametyleenidi-iso-syanaatti, syanuurikloridi ja 1,5-difluori-2,4-dinitro-25 bentseeni, antamalla sen olla kosketuksessa liuoksen kanssa, joka sisältää edullisesti noin 1 - 100 grammaa amiinin kanssa reagoimaan kykenevää ainetta litraa kohti. Sellaiset amiinin kanssa reagoimaan kykenevät aineet, jotka ovat vesiliukoisia, lisätään GDE:hen vesiliuoksistaan, kun taas 30 veteen liukenemattomat aineet lisätään orgaanisista liuottimista. Sopivia liuottimia ovat, mutta ne eivät rajoitu näihin, metyylialkoholi, etyylialkoholi, propyylialkoholi, isopropyylialkoholi, t-butyylialkoholi, asetoni, metyyli-eetteri, etyylieetteri, propyylieetteri, isopropyylieette-35 ri, tolueeni, bentseeni, ksyleeni, heksaani, syklopentaani ja sykloheksaani.

10 92074

Sen Jälkeen kun reaktion on annettu tapahtua riittävän kauan, niin että amiinin kanssa reagoiva aine on ehtinyt muodostaa johdoksia polyamiinin vapaista amiini-ryhmistä, poistetaan käsitelty GDE amiinin kanssa reagoi-5 maan kykenevän aineen liuoksesta ja pestään edullisesti useita kertoja deionisoidulla vedellä. Tässä käytettynä tarkoitetaan termillä "muodostaa johdos" reaktiotuotteen muodostumista GDE:hen sidotun polyamiinimolekyylin reak-tiokykyisen aminoryhmän ja amiinin kanssa reagoimaan kyke-10 nevän aineen vapaan amiinin kanssa reagoivan ryhmän välillä.

Mikä tahansa entsyymi, joka sisältää aminoryhmän, joka kykenee reagoimaan vapaan amiinin kanssa reagoivan ryhmän kanssa, voidaan immobilisoida tämän menetelmän 15 avulla. Voidaan myös samanaikaisesti immobilisoida kaksi tai useampia entsyymejä. Näihin entsyymeihin sisältyvät esimerkiksi trypsiini, papaiini, heksakinaasi, fisiini, bromeliini, laktaattidehydrogenaasi, laktaasi, glukoosi-isomeraasi, glukoamylaasi, kymotrypsiini, pronaasi, asy-20 laasi, invertaasi, beta-amylaasi, alfa-amylaasi, pullula-naasi, transglukosidaasi, glukoosioksidaasi, pepsiini, renniini ja sieniproteaasi. GDE-johdos sekoitetaan entsyymin (entsyymien) liuoksen kanssa, jotta entsyymin immobi-lisoituminen tapahtuisi. Entyymi voi olla vesiliuoksessa 25 ja/tai liuottimessa, joka sopii yhteen entsyymin kanssa. Immobilisointi voidaan suorittaa kertamenetelmätyyppisesti tai, teollisessa mittakaavassa, pylväsreaktorissa. Poistamalla GDE entsyymiliuoksesta, edullisesti pesten sitä sen jälkeen vedellä, saadaan GDE:hen immobilisoitu entsyy-30 mi, jota voidaan käyttää biokatalyyttisissa konverisoissa.

Eräs odottamaton tämän keksinnön mukaiseen entsyymin immobilisointimenetelmään liittyvä havainto on, että GDE:hen immobilisoidut entsyymit ovat yleensä parempia sikäli, että ne kestävät kauemmin ja sietävät paremmin 35 lämpöä kuin hiileen immobilisoidut entsyymit, jotka on valmistettu US-patentin 4 438 196 mukaisesti. Tätä ominai- 11 92074 suutta, joka on hyvin tärkeä heterogeenisen biokatalyytin kohdalla, kuvaavat tuonnempana seuraavat esimerkit.

Eräs toinen haluttu ominaisuus tässä immobilisoin-timenetelmässä on, että aikaisemmin käytettyä GDE-kantaja-5 materiaalia voidaan käyttää uudelleen immobilisointiin sen jälkeen kun se on regeneroitu yksinkertaisella menetelmällä, joka käsittää emäshappo-pesun. Tyypillisessä tapauksessa käytetty kantajamateriaali sekoitetaan löysäksi lietteeksi (1) veteen, (2) 0,5 N NaOH:iin, (3) veteen, (4) 10 0,5 N HCl:iin ja sitten (5) veteen. Tämä menetelmän omi naisuus on merkittävä, koska se poistaa käyttäjältä jät-teidenkäsittelyongelman ja on myös taloudellisesti edullista.

Vielä yksi tavoiteltu ominaisuus liittyy suoritus-15 muotoon, jossa samanaikaisesti immobilisoidaan useampia kuin yksi entsyymi, kuten on kuvattu esimerkeissä V ja VI.

Tätä keksintöä käytäntöön sovellettaessa piimaa-hiukkaset pestään edullisesti vedellä, kunnes tämä jää kirkkaaksi ja sen jälkeen poistetaan ilma imun avulla.

20 Polyamiini, edullisesti vesiliuoksessa oleva polyeteeni-imiini (MP 500 - 100 000), lisätään sitten pestyyn GDE:hen, edullisesti suhteessa noin 10 ml GDE:tä noin 50 ml kohti polyeteeni-imiinin (PEI) vesiliuosta. PEI:n vesiliuoksen pitoisuuksia, jotka ovat noin 0,1 - 0,5 % 25 (paino/tilavuus), on käytetty menestyksellä ja vielä edullisemmin lisätään noin 0,15 - 0,20 % (pH mitattu 9,0 -9,9:ksi) PEI:n (MP 40 000 - 60 000) vesiliuosta GDE:hen. Tehokas reaktioaika voi vaihdella ollen noin 0,5 - 8 tuntia noin 20 - 30 °C:ssa, hiukan sekoittaen, ja sopivimpana 30 pidetään reaktioaikaa, joka on noin 2-5 tuntia huoneen lämpötilassa. Ylimäärä PEI-liuosta voidaan poistaa dekan-toimalla ja pesemällä amiinilla käsiteltyä GDE:tä vedellä. Kun glutaarialdehydiä käytetään ristikytkentäaineena, se lisätään tyypillisesti PEI:llä käsiteltyyn GDE:hen suurin 35 piirtein samassa tilavuussuhteessa kuin PEI oli. Glutaari-aldehydipitoisuudet, jotka ovat noin 0,1 - 1,0 % (paino/- 12 92074 tilavuus), ovat tehokkaita tässä immobilisointimentelmäs-sä. Parhaana pidetty pitoisuus on noin 0,25 - 0,7 % (paino/ tilavuus) glutaarialdehydin vesiliuosta, joka sisältää 0,05 M natriumbikarbonaattia, jotta pH olisi halutun suu-5 ruinen, noin 7,9 - 8,3. Tyypillisesti glutaarialdehydi-bikarbonaattiliuoksen mitattu pH on 8,2. Ristikytkentä-reaktion annetaan tapahtua noin 20 - 30 °C:ssa noin 0,5 -20 tunnin ajan, edullisesti noin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa hiukan sekoittaen. Ylimäärä glutaarialdehydi-10 liuosta voidaan poistaa dekantoimalla ja pesemällä käsiteltyä GDE:tä vedellä. Entsyymin immobilisointi voidaan suorittaa lämpötilassa, joka on noin 4 - 30 °C, pH:ssa, joka sopii kulloinkin immobilisoitavalle entsyymille, noin 1-10 tunnin aikana, heikosti sekoittaen. Edulliset olo-15 suhteet ovat 4 tuntia sekoittamista huoneen lämpötilassa. Täten saatuja immobilisoituja entsyymejä voidaan säilyttää vedessä tai sopivassa puskuriliuoksessa, edullisesti kylmässä jääkaapissa, vielä edullisemmin 1-10 °C:ssa ja edullisimmin 4 °C:ssa käyttöön asti.

20 Tämän keksinnön mukaisen katalyytin kantajamate- riaalin on todettu soveltuvan hyvin yleensäkin entsyymien immobilisointiin. Tämän keksinnön mukaisesti immobilisoi-dut entsyymit kestävät lämpöä huomattavasti paremmin kuin solubilisoidut entsyymit tai US-patentin 4 438 196 mukai-25 sesti immobilisoidut entsyymit, ja siten, mikä on hyvin tärkeää, tämä keksintö sopii erityisen hyvin käytettäväksi, kun kysymyksessä ovat kuumuutta kestämättömät entsyymit.

Immobilisoidun entsyymin aktiivisuutta ml:aa kohti 30 kantajamateriaalia voidaan vaihdella ja säätää kantajama- teriaalin hiukkaskokojen ja entsyymillä (entsyymeillä)-kuormaamisasteen avulla.

Immobilisointimenetelmässä muodostuu entsyymin ja rakeisen piimään pinnalle absorboituneen polymeerin välil-35 le sidos, joka on epätavallisen stabiili, ja on todettu, • . . · 13 92074 että piimaahiukkanen ei päällysty eikä tahraannu proteiineilla tai muilla aineilla, kun nesteytetyn maissitärkke-lyksen raa'an liuoksen annetaan kulkea immobilisoidun entsyymin muodostaman kerrostuman läpi.

5 Tätä keksintöä kuvataan edelleen seuraavien esi merkkien avulla, joissa kaikki mesh-koot perustuvat US-standardiseulasarjaan. Esimerkkien tarkoitus on kuvata parhaina pidettyjä suoritusmuotoja eikä rajoittaa tällöin keksintöä.

10 Ellei esimerkeissä ole toisin mainittu, määritet tiin entsyymin tai entsyymien, joko immobilisoitujen tai solubilisoitujen, aktiivisuus seuraavasti. Määritys suoritettiin 50 °C:ssa käyttäen substraattina 50 ml 10 % (pai-no/tilavuus) Maltrin-150 (dekstroosiekvivalentti 10 - 12) 15 maissitärkkelystä, joka oli saatu yhtymältä Grain Process ing Company (Muscatine, Iowa), 0,05 M asetaattipuskuri-liuoksessa pH:ssa 4,2. Määrityksen suorittamista varten substraatti ja entsyymi pantiin ravisteltavaan pulloon ja inkuboitiin 30 minuutin ajan. Muodostunut glukoosimäärä on 20 määritetty Glucostrate-menetelmällä (General Diagnostics), jossa reaktioalkunopeus (jota myös kutsutaan alkunopeudeksi) glukoosin muodostumiselle minuutissa määritetään regressioanalyysin avulla. Yksi yksikkö entsyymiaktiivisuutta tarkoittaa entsyymimäärää, joka tuottaa 1 mikromoolin 25 glukoosia (tai glukoosiekvivalentin) 1 minuutissa kunkin entsyymimäärityksen olosuhteissa, ja ilmoitetaan seuraavasti: U/ml (aktiivisuusyksikköä millilitraa kohti kanta-jamateriaalia).

Esimerkeissä muodostunut sokerimäärä määritettiin 30 ferrisyaaniamidi-menetelmällä, kuten ovat kuvanneet Ghuy- sen et ai. julkaisussa Methods in Enzymology, osa VIII, s 685, Academic Press, New York (1966), jossa glukoosia käytettiin vertailuaineena.

f 14 92074

Esimerkki I

Glukoamylaasin immobilisointi PEI:llä päällystettyyn huokoiseen rakeiseen piimäähän 5 Ennen rakeisen piimään (GDE) käyttämistä immobili- sointiin se pestiin seuraavasti: 1. 100 ml hiukkaskooltaan 0,74 - 0,85 mm (US-seula) olevaa huokoista rakeista piimaata (Eagle Pitcher Industry, Inc.) sekoitettiin deionisoituun veteen. Käytettiin riittävästi 10 vettä, niin että piimää oli täysin veden alla.

2. Sen jälkeen kun piimää oli laskeutunut pohjaan, yllä oleva neste dekantoitiin pois.

3. Piimaasta poistettiin sitten ilma imun avulla ja jäljellä oleva vesi dekantoitiin pois.

15 Glukoamylaasi (AG) immobilisoitiin huoneen lämpö tilassa seuraavan menetelmän mukaan: 1. 500 ml 0,2 % (paino/tilavuus) PEI-600:n (Cordova Chemical Company, Muskegon, Michigan, polyeteeni-imiinin mole-kyylipainoalue 40 000 - 60 000) vesiliuosta, jonka pH oli 20 mitattu olevan 9,8, lisättiin 100 ml:n erään pestyä piimaata 1 litran erlenmeyer-pullossa ja ravisteltiin kevyesti 4 tunnin ajan.

2. Ylimäärä polyeteeni-imiini-liuosta dekantoitiin sitten pois ja käsitelty piimää pestiin runsailla määrillä vettä.

25 3. Piimäähän kiinnittyneen polymeerin vapaista amiiniryh- mistä tehtiin johdoksia glutaarialdehydillä lisäämällä 500 ml 0,5 % (paino-tilavuus) glutaarialdehydiliuosta, joka oli tehty 0,05 M natriumbikarbonaattiliuokseen saaden pH:ksi 8,2. Pulloa ravisteltiin kevyesti 2 tunnin ajan 30 huoneen lämpötilassa.

4. Glutaarialdehydiliuos dekantoitiin pois ja käsiteltyä piimaata pestiin deionisoidulla vedellä reagoimattoman glutaarialdehydin poistamiseksi. Tulokseksi saatiin kanta-jamateriaali, joka oli muodostunut piimaasta, polyeteeni- 35 imiinistä ja glutaarialdehydistä.

15 92074 5. 500 ml liuosta, joka sisälsi 12000 yksikköä glukoamy-laasla (Diazyme® l-200, yhtymän Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, tavaramerkki) ja jonka pH oli säädetty 7,0:ksi 0,02 M fosfaattipuskuriliuoksen avulla, lisättiin 5 johdoksia käsittävään kantajamateriaaliin ja sekoitettiin kevyesti 4 tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

6. Neste dekantoitiin pois ja immobilisoitu entsyymi pestiin deionisoidulla vedellä.

Immobilisoidun glukoamylaasin aktiivisuudeksi mää-10 ritettiin 110 aktiivisuusyksikköä ml:aa kohti kantajama-teriaalia.

Rakeiseen piimäähän immobilisoidun glukoamylaasin käyttö suuren dekstroosipitoisuuden omaavien siirappien tuottamiseen 15 50 ml:n näyte edellä kuvatulla tavalla valmistettua immobilisoitua glukoamylaasia pakattiin vaipalliseen lasi-pylvääseen, jonka halkaisija oli 2,5 cm ja korkeus 100 cm.

30 % entsyymin avulla nesteytettyä tärkkelystä (40 DE) (23,63 % glukoosia, 10,99 % maltoosia, 0 % isomaltoosia; 20 polymeroitumisaste: DP3 13,10 %, DP4 7,10 %, suurempia kuin DP4 45,18 %), puskuroituna pH:hon 4,2 5 mM asetaatin avulla, syötettiin jatkuvasti pylvääseen eri virtausnopeuksilla. Pylvään lämpötila pidettiin 50 °C:ssa. Tuotteet analysoitiin HPLC:n (korkeapaine-nestekromatografian) ja GC:n 25 (kaasukromatografian) avulla. Tulokset on esitetty seuraa-vassa taulukossa.

Taulukko I

Hiilihydraattikoostumus (%) 30 Virtaus- Glukoosia Maltoosia(*) Isomal- DP3 DP4 >DP4 nopeus toosia (ml/tunti)__ 25,4 94,3 1,1 0,8 0,4 0 3,5 13,3 95,7 1,3 1,5 0,4 0 1,2 35 11,0 96,6 1,1 1,8 0,3 0 0,2 9,1 94,1 1,4 3,8 0,7 0 hive- : nen verran 16 92074 (*) Maltoosikomponentti sisälsi pieniä määriä tunnistamattomia DP2-sokereita

Siten voidaan saavuttaa niinkin korkea maksimaali-5 nen glukoositaso kuin 96,6 %, mikä vahvistaa sen, että voidaan saavuttaa samanlainen dekstroositaso kuin sokeriksi muuttamisen tapahtuessa liukoisen glukoamylaasin avulla. Tämä korkea dekstroositaso 30 %:lla DS osoittaa, että entsyymi on hiukkasen pinnalla tai hyvin lähellä pin-10 taa, niin että sisäinen diffuusio ei ole tärkeä reaktioon vaikuttava tekijä. Myös suurimolekyylinen sokerifraktio (>DP3) voidaan helposti hydrolysoida immobi li soidun entsyymin avulla, mikä on lisäosoitus vähäisistä steerisistä esteistä tai substraatin helposta pääsystä entsyymin ak-15 tiiviseen kohtaan.

Esimerkki II

Rakeiseen piimäähän immobilisoitu glukoamylaasi verrattuna hiileen immobilisoituun glukoamylaasiin Lämmönkestävyys: 20 Lämmönkestävyystestit liukoiselle glukoamylaasil- le, US-patentin 4 438 196 esimerkin I mukaiselle hiileen immobilisoidulle glukoamylaasille ja GDE:hen immobilisoi-dulle glukoamylaasille, joka oli valmistettu kuten esimerkissä I yllä, suoritettiin 60 °C:ssa ja pH:ssa 4,2 (0,1 M 25 asetaattipuskuri) ilman substraattia. Tulokset on esitetty taulukossa ΙΙ-Ά.

Taulukko II-A

(Glukoamylaasin jäljellä oleva aktiivisuus prosentteina, sen jälkeen kun sitä on inkuboitu 30 ilmoitettu aika 60 °C:ssa ja pH:ssa 6,0) Jäljellä oleva aktiivisuus (%)

Aika (min)_30 60 120_180

Liukoinen 82,6 73,2 66,4 54,7 35 Hiileen immobilisoitu 87,0 72,4 54,7 51,4 GDEihen immobilisoitu 91,6 78,7 72,6 64,2 17 92074

Kuten taulukosta näkyy, paransi glukoamylaasin im-mobilisointi huokoiseen rakeiseen piimäähän entsyymin läm-mönkestävyyttä.

Stabiilius ja tuottavuus: 5 Yksi litra immobilisoitua glukoamylaasia, joka oli valmistettu kuten esimerkissä I yllä, pakattiin vaipalli-seen lasipylvääseen (5 cm x 100 cm). Virtauksen annettiin jatkua pylväässä koko ajan 50 °C:ssa syöttäen substraattina 30 % DS (kuivia kiinteitä aineita) kahdenlaisen entsyymin 10 avulla nesteytettyä maissitärkkelystä (35 DE), jonka pH oli 4,2 puskuroituna 2,5 mM asetaatilla ja joka sisälsi 250 miljoonasosaa S02. Lisäksi substraattia oli säilytetty kylmässä, 5 °C:ssa, ja sen oli sitten annettu kulkea pienen 70 °C:ssa olevan pylvään läpi, joka oli täytetty tavalli-15 sella rakeisella piimaalla, toimiakseen tarkistussuodatti- mena ennen substraatin syöttämistä entsyymipylvääseen. Tuotteiden glukoositasot olivat väliltä 94 - 96 %. Tämän pylvään puoliaika oli noin 125 päivää tuottavuuden ollessa noin 153 grammaa DS:ä ml:a kohti immobilisoitua glukoamy- 20 laasia.

Vertailun vuoksi testattiin hiileen immobilisoitua glukoamylaasia, joka oli valmistettu US-patentin 4 438 196 esimerkin I mukaisesti, pylväässä samalla tavalla kuin on kuvattu edellä olevassa kappaleessa (paitsi että DS oli 25 25 %). Vaikka alempi DS suosii saatavilla olevan tärkke lyksen täydellisempää muuttamista, ja saannon pitäisi siten olla parempi, olivat tuotteiden glukoositasot väliltä 92 - 93 %. Tämän pylvään puoliaika oli noin 67 päivää tuottavuuden ollessa noin 107 grammaa DS:ä ml:a kohti im-30 mobilisoitua glukoamylaasia.

Alla olevassa taulukossa 1I-B on esitetty yhteenveto kummassakin pylväässä eri virtausnopeuksilla saaduista hiilihydraattikoostumuksista.

18 92074

Taulukko IT—B

GDE:hen kiinnitetty AG

Hiilihydraattikoostumus (%)

Virtaus- DP^ Maltoosi Isanal- EF^ EP^ nopeus ja DP2 toosi 5 (pakatun kolonnin tilav/tunti) (*)

Substraatti 21,8 8,7 0 11,5 58,0 1,5 89,6 1,3 0,5 0,4 8,2 1.0 92,6 1,5 0,8 0,4 4,7 0,8 94,4 1,3 1,0 0,3 3,0 0,6 95,2 1,4 1,3 0,3 1,8 0,5 95,1 1,4 1,6 0,3 1,6 0,4 95,9 1,4 2,0 0,3 0,4 0,3 95,1 1,5 2,5 0,3 0,6 0,2 93,6 1,6 3,6 0,8 0,4

Substraatti 1,6 5,9 0 12,1 80,4 2.0 84,2 1,6 0,2 0,7 13,3 2Q 1,6 85,6 1,3 0,3 0,6 12,2 1.0 88,5 1,3 0,5 0,4 9,3 0,8 92,5 1,4 0,7 0,4 5,0 0,5 91,7 1,3 1,0 0,2 5,8 0,3 92,7 1,5 1,6 0,1 4,1 25 0,2 93,9 1,6 2,4 0,1 2,0 0,1 92,7 1,9 4,3 0,4 0,7 0,05 92,6 1,9 4,8 0,3 0,4 x) Pakatun kolonnin tilavuus/tunti on virtausnopeusarvo, joka on käänteisessä suhteessa reaktioaikaan.

30 Taulukosta II-B voidaan päätellä, että GDE:hen . kiinnitetty glukoamylaasi kykenee hydrolysoimaan tärkke lystä täydellisemmin kuin rakeiseen hiileen kiinnitetty glukoamylaasi. GDE:hen kiinnitetyllä glukoamylaasilla saavutetaan maksimaalinen dekstroositaso noin 96 % ja noin 35 95 %:n taso hiileen kiinnitetyllä glukoamylaasilla. Suu- • 19 92074 rentunut dekstroosisaanto voi olla osoitus siitä, että GDE:hen kiinnitetyllä AG:llä on vähemmän steerisiä esteitä tai että se on sitoutunut suuremmassa määrin hiukkasen pinnalle, niin että substraatilla on vähemmän diffuusio-5 vastusta. Toinen osoitus vähemmästä diffuusiovastuksesta GDErhen kiinnitetyn glukoamylaasin yhteydessä on kullakin dekstroositasolla muodostunut pienempi isomaltoosimäärä.

Esimerkki III

Glukoamylaasin immobilisointi suoritettiin aina 10 samalla tavalla kuin esimerkissä 1 vaihdellen GDE:n hiuk-kaskokoa ja immobilisoitavan glukoamylaasin määriä, jotta voitaisiin verrata glukoamylaasin aktiivisuutta glukoamylaasin määrään.

Alla olevassa taulukossa esitetyt tulokset osoitta-15 vat vaikutuksen, joka hiukkaskoolla ja entsyymillä kuormituksen runsaudella on entsyymikantajamateriaali-yhdistel-män aktiivisuuteen käytettäessä glukoamylaasia mallijärjestelmänä.

20 92074 m I α) χ C 3

C -H

P J5

X

O * O

(O CO

<0 0 > e P 0) ·*"> CC (0 _ 3 <0 X §

Ό (0 E

•HB) 0) O t'' H T* H CTi ® H « (Jl o Pm wc ...... ...... 3® •h -h ^ co co σ σ co in σ> io o co io in m ' >H E <#> co CO N H σ σ σ> r- co <n -h °

Ti c w > i £3 >i -H 1 OB) Ή ie 5 ®

H <D 10 O

“ 10 1 £ h di S S E o v a * g |

S S Ϊ5 II

H Ό w H m 5 B) £. (0 (rt "rt 3 io >i B) ίο vo co oo in ιο γη m in co in <n σ ^ 3 (0 -H 3 H ^ ^ ^ » »i ^ ^ ^ ^ ^

H i-l 3 Ih ^HvOCDlDOirH O' tn ^ 1Π Oi f e C

>i (0 B3 a) in p e* σϊ oo σ io co co σ> σ» σι 23 «r ro E <0 -H P H rH rH H rH H N N N (M UöB) « -H > (0 .S 2 (0 O H -H E 2 $ p ji o -h to 2 5 3 +! £ T? m ra 2

H lö ä Id Xi v D

O E <0 ^ 3 £ g g ®

H O -H

O O >

3 N S

© ao i ·* e +j Ή SO -H ,¾ M h e to h 2 φ ro U Ή W H dl £ £ rl i—( 3 ra -p r[ u e H (0 (0 (0 (0 ^ 5 φ rt <0 E io E 5 p

2 "H i-( iH (0 ' n. +J

y h O >1 τι OOOOOO OOOOOO *5 -H

3 Φ 3 E (0 ****** ****** «CW

• 5 +> 2* « P OOOOOO OOOOOO 5-h *3 *0 OC C** ^ O O O O c^^fioooo ® μ ro 3 E 4-> JO <0 H N Tf 00 d H N OO N +:3-1-) i® ro 3 3 J4 rH h 2 3 E-· -o μ r-l ~ =2 ra g ro o O) h ro 04 g p m e -h - ro C P P S (H C (0 ¢0 ro ro so o ro ro p ,-ι

ώ p t-ι ro ro p rH

Ό 3 *

Τ' > rH

o ro > ro 1 ro ra ro h 10 * E h ao 00

H CO 00 CO CO CO CO MP

•h in in in in in in pppppp ao O

Q( CO CO CO CO CO CO rH rH cH rH rH rH (0 SO

****** ****** p g ro

CO OOOOOO rH .H rH rH rH rH B)0)rH

(0 X 0 3 H

CO IIIIII tilli! a: ro o

•H X 3 E O

Φ I n n N n n n in in in in in in h Ih x e co co co en co co co co co co co co 3 O m ro E ****** ****** ro 3 ro OS -r OOOOOO OOOOOO HÄJi 21 92074

Esimerkki IV

100 ml:n määrää PEI-glutaarialdehydijohdoksia omaavaa GDE:tä, kuten esimerkissä I (mutta valmistettu käyttäen hiukkaskoon 0,85 - 1,118 mm käytettiin soija-beta-5 amylaasin (Hi-maltosin S, Hankyu Kyoei Bussan Co., Ltd., Osaka, Japani) immobilisointiin. Entsyymiliuoksessa, jota käytettiin johdoksia omaavan GDE:n käsittelyyn, oli 1 gramma (40 000 yksikköä/gramma) soija-beta-amylaasia 500 ml:ssa 0,02 M fosfaattipuskuriliuosta pH:ssa 7,0. Immobi-10 lisointimenetelmä suoritettiin kuten esimerkissä I. Tehtiin määrityksiä (pH:ssa 5,5) näin saadulla immobilisoi-dulla beta-amylaasilla, jossa oli tällöin 134 yksikköä ml:aa kohti kantajamateriaalia.

Rakeiseen piimäähän immobilisoidun beta-amylaasin 15 käyttö suuren maltoosipitoisuuden omaavien siirap pien tuottamiseen Näytteitä, joissa kussakin oli 50 ml 30 % DS Maltrin-150 (Grain Processing Corp.) 0,05 M asetaatti- liuoksessa pH:ssa 5,0, käsiteltiin ravisteltavissa pul-20 loissa 24 tunnin ajan 50 °C:ssa vaihtelevilla määrillä edellä kuvatulla tavalla valmistettua immobilisoitua beta-amylaasia suuren maltoosipitoisuuden omaavien siirappien tuottamiseksi. Tuotteiden hiilihydraattikoostumus analysoitiin HPLC:n avulla. Tulokset on esitetty seuraavassa 25 taulukossa.

• '

r Taulukko IV-A

Immobilisoitu beta-amylaasi Hiilihydraattikoostumus (%) (ml) DPX DP2 DP3 >DP3 30--- 0 1,2 3,5 2,8 92,5 0,2 1,2 37,0 11,2 50,6 0,4 1,2 42,4 12,7 43,7 0,9 1,1 47,2 12,8 38,9 35 1,8 1,1 51,8 12,7 34,3 3,5 1,2 53,8 12,7 32,4 7,0 1,1 55,2 12,4 31,3 22 92074

Taulukosta IV-A voidaan päätellä, että maksimaalinen deks-troositaso, joka voidaan saavuttaa, on suurin piirtein 55 %.

Rakeiseen piimäähän immobilisoidun beta-amylaasin 5 lämmönkestävyys Lämmönkestävyystestit liukoiselle beta-amylaasille, hiileen immobilisodulle beta-amylaasille, joka oli valmistettu US-patentin 4 438 196 esimerkin IV mukaisesti, ja tässä yhteydessä valmistetulle GDErhen kiinnitetylle beta-10 amylaasille suoritettiin 60 °C:ssa asetaattipuskuriliuok-sessa (0,1 M, pH 5,5) ilman substraattia. Tulokset on esitetty taulukossa IV-B:

Taulukko IV-B

15 (Beta-amylaasin jäljellä oleva aktiivisuus prosent teina, sen jälkeen kun sitä on inkuboitu 60 °C:ssa ja pH:ssa 6,0) Jäljellä oleva aktiivisuus (%) 20 Aika (min. )_30_60_120_180

Liukoinen 87,2 17,2 4,7 1,4

Hiileen immobilisoitu 84,2 58,6 46,0 43,2 GDE:hen immobilisoitu 100 100 91,5 86,6 25 GDE:hen kiinnitetyn beta-amylaasin lämmönkestävyys • ' oli dramaattisesti lisääntynyt. 1 tunnin kuluttua ei ollut havaittavissa käytännöllisesti katsoen ollenkaan aktiivisuuden vähenemistä GDE:hen immobilisoidulla entsyymillä, mutta vähemmän kuin 60 % hiileen immobilisoidun 30 entsyymin aktiivisuudesta ja vähemmän kuin 20 % liukoisen entsyymin aktiivisuudesta oli jäljellä. Jopa vielä kolmen tunnin kuluttua 60 °C:ssa oli yli 85 % GDE:hen immobilisoi-dusta beta-amylaasista vielä aktiivista verrattuna vähempään kuin 45 %:iin hiileen immobilisoidusta entsyymistä ja 35 vähempään kuin 5 %:iin liukoisesta entsyymistä.

23 92074

Esimerkki V

Yhdessä immobilisoitujen glukoamylaasi/pullulanaa-sin valmistus 100 ml:n määrää johdoksia omaavaa GDE:tä kuten esi-5 merkissä 1 (mutta valmistettu käyttäen hiukkaskokoa 0,85 -1,118 mm) käytettiin immobilisointiin. Johdoksia omaavaa GDE:tä käsiteltiin 500 ml:11a pH:n 6,0 puskuriliuosta (0,1 M asetaatti), joka sisälsi 12000 yksikköä glukoamy-laasia (Diazyme L-200, Miles Laboratories, Inc.) ja 12000 10 yksikköä pullulanaasia (Promozyme'** 200L, Novo Ind., Inc.), jolloin entsyymit immobilisoitiin yhdessä huokoiseen GDE-kantajamateriaaliin esimerkissä I kuvatun menetelmän mukaan. Tehtiin määrityksiä näin saadulla yhdessä immobili-soidulla glukoamylaasi/pullulanaasi-yhdistelmällä, jossa 15 oli 54,5 yksikköä/ml glukoamylaasiaktiivisuutta ja 12,3 yksikköä/ml pullulanaasiaktiivisuutta, käyttäen substraattina 1 % (paino/tilavuus) pullulaania.

Yhdessä glukoamylaasi/pullulanaasi-yhdistelmän käyttö suuren dekstroosipitoisuuden omaavien sii-20 rappien tuottamiseen

Suuren dekstroosipitoisuuden omaavia siirappeja valmistettiin käsittelemällä 50 ml:n näytteitä liuosta, jossa oli 30 % DS entsyymillä nesteytettyä maissitärkke-lystä (40 DE) 0,05 M asetaatissa pH:ssa 4,2, ravistelta-25 vissa pulloissa 24 tunnin ajan 50 °C:ssa vaihtelevilla määrillä yhdessä immobilisoitua, edellä kuvatulla tavalla valmistettua glukoamylaasi/pullulanaasi-yhdistelmää. Hii-lihydraattikoostumukset on esitetty seuraavassa taulukossa.

24 92074 m rs es in h h in

A V

Q in co o h .h o Λ ^ (0 μ

H

Q) μ 0) O? T» n ^ o « in o Q SS*.»*.*. _ w CO M r-l r-l O O , N V, a

Q

•H JS

en -h

§ I

h n Ti τ> in +j

~ g o o’ o" o" o' O E

* o JS

h (0 en

H -H

* H C

~ 3 C

en φ μ 1 ~ e «

3 jt ·· *H

μ J u μ m ^ o xo O rs co in co co xo

O _| ssssss XÖ E

X m (N O (N i-H i-l t-f 4-> •Hn ^ N P «

£ O ® -H

T- *P e 2 H e®

(0 m ·· -H

^ ^ s o a

> Ό Ä J

_ >i A XO

o .e s xo ÄH 4->

X H (N CV H σ' VO CO XO I—I

3 -h W s..... X xo h ha oocsininTOCs 0)en 3 SCO h vo σ\ σ> στ σ> en h <o en . ** >1 : μ h * μ μ Φ μ - μ e 3 1 η φ μ «ο μ e H H Χ0 Ο 0 3 xo a «n η ε ε Η ι—I Ο Η 3 mx Η α 3 Η Λ h E tn ο μ 3 0 Ε <ο η μ ο . ε (0 ~ μ «μ Η Η Η μ Ο Η >ι ε φ o to χο ε — to ^ s en <ο μ «η ο Η μ φ χ «n en — •03(0 λ es m <ν en es. -s* Λ H <0 3*ssss <K4c >r Oi C oi h n in m oo ww 25 92074 Täten saadut siirapit sisältävät enemmän glukoosia ja vähemmän isomaltoosia kuin esimerkissä I saadut siirapit. Yhdistelmällä glukoamylaasi/pullulanaasi on erilainen hydrolyysiprofiili kuin glukoamylaasilla yksin, mikä teo-5 rian mukaan johtuu glukoamylaasin ja pullulanaasin samanaikaisesta vaikutuksesta.

Esimerkki VI

Yhdessä immobilisoidun beta-amylaasi/pullulanaasin valmistus 10 100 ml:n määrää johdoksia omaavaa huokoista GDE:tä, kuten esimerkissä I (mutta tehty käyttäen huokoskokoa 0,85 - 1,118 mm olevaa GDErtä) käytettiin immobilisoin- tiin. Valmistettiin liuos sekoittamalla yksi gramma beta- amylaasia (Hi-Maltosin S) ja 20 ml pullulanaasia (Pulluzy- (S) 15 mew 750L, ABM Chemicals Limited, Woodley Stockport Cheshire, (Englanti), 0,05 M asetaattipuskuriliuoksessa pH:ssa 5,5. Beta-amylaasi ja pullulanaasi immobilisoitin sitten yhdessä huokoiseen GDE:hen esimerkissä I esitetyllä menetelmällä.

20 Rakeiseen piimäähän yhdessä immobilisoitujen beta- amylaasin/pullulanaasin käyttö suuren maltoosipi-toisuuden omaavien siirappien tuottamiseen Suuren maltoosipitoisuuden omaavia siirappeja tuotettiin hydrolysoimalla 50 ml:n näytteitä liuosta, jossa 25 oli 30 % DS Maltrin-150:tä 0,05 M asetaatissa pH:ssa 5,5, ravisteltavissa pulloissa 24 tunnin ajan 50 °C:ssa vaihte-levien määrien avulla edellä kuvatulla tavalla valmistettua, yhdessä immobilisoitua beta-amylaasi/pullulanaasia. Seuraavassa taulukossa on esitetty HPLC:n avulla määrite- 30 tyt tuotteiden sokerikoostumukset.

♦ t 26 92074

Taulukko VI

Yhdessä immobi-lisoitu beta- 5 amylaasi/pullu- HPLC:n avulla saatu sokerikoostumus (%) lanaasi (ml) DPX DP2 DP3 >DP3 0 1,2 3,5 2,8 92,5 0,4 2,8 46,9 15,2 35,1 10 0,9 2,8 53,1 13,3 30,8 1,8 2,8 57,9 13,4 25,9 3,5 2,9 62,6 14,1 20,5 7,0 3,0 67,3 13,3 16,4 15 Tulokset osoittavat, että suuren maltoosipitoisuu- den omaavien siirappien, jotka on valmistettu yhdessä im-mobilisoidun beta-amylaasi/pullulanaasin avulla, koostumukset ovat parempia kuin pelkästään imobilisoidun beta-amylaasin avulla tuotetut (esimerkki IV), so, yhdistelmän 20 avulla tuotetuissa on enemmän maltoosia ja vähemmän suuremman molekyylipainon omaavia sokereita. Kuten esimerkissä V tämä johtuu teorian mukaan beta-amylaasin ja pullula-naasin samanaikaisesta vaikutuksesta.

Esimerkki VII

25 100 ml:n määrää PEI-glutaarialdehydijohdoksia omaa vaa GDE:tä, kuten esimerkissä I (mutta tehty käyttäen hiukkaskokoa 0,85 - 1,118 mm olevaa GDE:tä) käytettiin pullulanaasin (Pulluzyme 750L) immobilisointiin. 500 ml 0,05 M asetaattia pH:ssa 5,5, joka sisälsi 24 ml entsyy-30 miä, käytettiin johdoksia omaavan GDE:n käsittelemiseen. Immobilisointimenetelmä suoritettiin kuten esimerkissä I. Tehtiin määrityksiä näin saadulla immobilisoidulla pullu-lanaasilla (pH:ssa 6,0), jossa oli tällöin 32 yksikköä ml:aa kohti kantajamateriaalia.

27 92074

Immobilisoidun kiinnitetyn pullulanaasin lämmön-kestävyys

Tehtiin lämmönkestävyystestejä liukoiselle pullula-naasille ja edellä kuvatulla tavalla valmistetulle 6DE:hen 5 kiinnitetylle pullulanaasille 60 °C:ssa ja pH:ssa 6,0 (0,1 M asetaatti) ilman substraattia. Tulokset on esitetty taulukossa VII.

Taulukko VII

10 (Pullulanaasin jäljellä oleva aktiivisuus prosent teina, sen jälkeen kun sitä on inkuboitu ilmoitettu aika 60 °C:ssa ja pHrssa 6,0) Jäljellä oleva aktiivisuus (%) 15 Aika (min. )_30_60_120_180

Liukoinen 19,7 6,0 0 0 GDE:hen immobilisoitu 51,4 42,2 42,2 38,4

Kuten taulukosta VII näkyy, kesti immobilisoitu 20 pullulanaasi lämpöä huomattavasti paremmin kuin liukoinen entsyymi. 0,5 tunnin kuluttua GDE:hen immobilisoidun pullulanaasin aktiivisuudesta oli vielä yli 50 % jäljellä, kun taas liukoisen pullulanaasin aktiivisuus oli jo alle 20 %. 2 tunnin kuluttua GDE:hen immobilisoidun pullulanaa-25 sin aktiivisuudesta oli vielä jäljellä noin 42 %, mutta liukoisen pullulanaasin aktiivisuus oli jo alentunut 0 %:iin.

Esimerkki VIII

Immobilisoidun laktaasin valmistus 30 100 ml:n määrää PEI-glutaarialdehydijohdoksia omaavaa GDE:tä, kuten esimerkissä I (mutta tehty käyttäen hiukkaskokoa -24 - +35 mesh), käytettiin laktaasin immobi-lisointiin. Yksi gramma laktaasia (20 000 yksikköä), joka oli peräisin A. oryzae'sta, liuotettiin 500 ml:aan 0,02 M 35 natriumfosfaattipuskuriliuosta (pH 7,0) ja immobilisoitiin » 28 92074 6DE:hen samalla menetelmällä, joka on esitetty esimerkissä I. Laktaasin aktiivisuus määritettiin 50 °C:ssa ja pH:ssa 4,5 käyttäen substraattina 5 % (paino/tilavuus) laktoosia. Vapautunut glukoosi määritettiin glucostrate-menetelmän 5 avulla. Yksi yksikkö laktaasiaktiivisuutta on määritelty entsyymimääräksi, joka tuotti yhden mikromoolin glukoosia minuutissa 50 °C:ssa 4,5. Tehtiin määrityksiä näin saadulla immobilisoidulla laktaasilla, jossa oli tällöin 106,7 yksikköä ml:aa kohti kantajamateriaalia.

10 Rakeiseen piimäähän immobilisoidun laktaasin käyttö laktoosin hydrolysointiin 50 ml:n näytteen, jossa oli 15 % (paino/tilavuus) laktoosia (0,05 M natriumasetaatti, pH 4,5), hydrolyysin immobilisoidun GDE:hen kiinnitetyn laktaasin avulla annet-15 tiin tapahtua ravistettavissa pulloissa 24 tunnin ajan 50 °C:ssa. HPLC:n avulla määritetyt hydrolysoitujen tuotteiden sokerikoostumukset on esitetty seuraavassa taulukossa.

20 Taulukko VIII-A

Immobili- soitu lak- HPLC:n avulla määritetty sokerikoostumus (%) taasi (ml) Glukoosi Galaktoosi Laktoosi DP3 DP4 25 -- 0 - - 100,0 0,9 34,4 25,4 31,2 7,3 1,7 1,8 42,6 37,1 16,6 3,3 0,4 3,5 47,2 45,0 5,2 1,6 30 5,2 48,6 47,7 2,9 0,8 7,0 48,8 48,3 2,4 0,5 10,4 48,9 48,5 2,6

Laktoosin hydrolysoitumisaste oli yli 97 %, mikä 35 osoittaa, että immobilisoitu, GDE:hen kiinnitetty laktaasi oli melkoisen aktiivista.

29 92074

Immobilisoidun laktaasin lämmönkestävyys Lämmönkestävyystestejä suoritettiin liukoiselle laktaasille ja edellä kuvatulla tavalla valmistetulle huokoiseen GDE:hen kiinnitetylle laktaasille 60 °C:ssa ja 5 pH:ssa 4,5 (0,1 M natriumasetaatti) ilman substraattia. Tulokset on esitetty taulukossa VIII-B.

Taulukko VIII-B

(Laktaasin jäljellä oleva aktiivisuus prosentteina, 10 sen jälkeen kun sitä on inkuboitu ilmoitettu aika 60 °C:ssa ja pH:ssa 4,5) Jäljellä oleva aktiivisuus (%)

Aika (min. )_30_60_120_180 15 Liukoinen 52,4 32,4 16,8 10,0 GDE:hen immobilisoitu 76,0 72,6 61,6 53,4

Esimerkki IX

Immobilisoidun transglukosidaasin valmistus 20 100 ml:n määrää PEI-glutaarialdehydijohdoksia omaa vaa GDE:tä, kuten esimerkissä I (mutta tehty käyttäen hiukkaskokoa 0,85 - 1,118 mm), käytettiin transglukosidaasin immobilisointiin. Käytettiin 500 ml 0,05 M asetaattia pH:ssa 5,5, joka sisälsi 500 yksikköä puhdistettua lämmön-25 kestävää, Talaromyces duponti'sta peräisin olevaa trans-glukosidaasia. Immobilisointi suoritettiin samalla menetelmällä, joka on esitetty esimerkissä I. Tehtiin määrityksiä näin saadulla immobilisoidulla transglukosidaasil-la, jossa oli tällöin 2,6 yksikköä ml:aa kohti kantajama-30 teriaalia. Transglukosidaasin aktiivisuus määritettiin menetelmällä, joka perustuu nestekromatografian avulla tapahtuvaan transglukosidaatiotuotteen, nimittäin panoo-sin, kvantitatiiviseen määrittämiseen inkubaatioseoksesta, jossa on entsyymiä ja maltoosia pH:ssa 4,5 ja 60 °C:ssa.

35 Yksi yksikkö transglukosidaasiaktiivisuutta on määritelty t « 30 92074 entsyymimääräksi, joka tuotti yhden mikromoolin panoosia tunnissa 20 % maltoosiliuoksesta pH:ssa 4,5 ja 60 °C:ssa.

Rakeiseen piimäähän immobilisoidun transglukosidaa-sin käyttö käymiseen sopimattomien sokereiden tuot-5 tamiseen Käymiseen sopimattomia sokereita (pääasiallisesti panoosia ja isomaltoosia) tuotettiin käsittelemällä 50 ml 30 % DS maltoosiliuosta (pH 4,5, 0,05 M asetaatti) ravisteltavassa pullossa 10 ml:11a immobilisoitua, edellä kuva-10 tulla tavalla valmistettua transglukosidaasia viiden päivän ajan 60 °C:ssa. Analysoitaessa tuote kaasukromatografian avulla saatiin esille seuraava sokerikoostumus: 28,3 % glukoosia, 34,8 % maltoosia, 7,4 % isomaltoosia, 22,1 % panoosia ja 7,5 % korkeampia sokereita. Tässä esi-15 merkissä tuotettu käymiseen sopimattomien sokereiden (al-6-sidos) kokonaismäärä oli noin 37 %.

Claims (10)

92074 31

1. Menetelmä immobilisoidun entsyymikonjugaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää 5 seuraavat vaiheet: a) saatetaan huokoinen, rakeinen piimää kosketukseen polyamiinin liuoksen kanssa, jonka liuoksen pH on 9 - 9,9 ja jolloin polyamiinin molekyylipaino on 500 -100 000 ja polyamiinilla on vapaita amiiniryhmiä, jolloin 10 polyamiini kiinnittyy piimäähän; b) poistetaan liuotin ja siinä mahdollisesti oleva kiinnittymätön polyamiini kosketuksesta piimään kanssa ja saatetaan näin käsitelty piimää kosketukseen amiinin kanssa reagoimaan kykenevän aineen liuoksen kanssa, joka aine 15 on multifunktionaalinen aldehydi, multifunktionaalinen orgaaninen halogenidi, multifunktionaalinen anhydridi, multifunktionaalinen atsoyhdiste, multifunktionaalinen isotiosyanaatti tai multifunktionaalinen isosyanaatti, jolloin yksi reaktiokykyisistä ryhmistä reagoi vapaiden 20 amiiniryhmien kanssa ja amiinin kanssa reagoimaan kykenevä osa jää saataville lisäreaktiota varten; c) poistetaan liuotin ja siinä mahdollisesti liuenneena oleva reagoimaton, amiinin kanssa reagoimaan kykenevä aine kosketuksesta piimaakantajamateriaalin kanssa, 25 joka saatetaan kosketukseen liuoksen kanssa, jossa on vä- hintään yksi immobilisoitava entsyymi, jolloin entsyymin tai entsyymien amiiniryhmät saatetaan reagoimaan reagoimattoman, amiinin kanssa reagoimaan kykenevän osan kanssa muodostaen kovalenttisia sidoksia näiden välille, jolloin 30 entsyymi tai entsyymit immobilisoituvat.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polyamiini on valittu ryhmästä, jonka muodostavat polyetyleenidiamiini, polyetyleeni-imii-ni, polyheksametyleenidiamiini, polymetyleenidisyklohek- 35 syyliamiini, polymetyleenidianiliini, polytetraetyleeni- fr » 32 92074 pentamiini, polyfenyleenidiamiini, polydietyleenitriamii-ni, polytrietyleenitetramiini, polypentaetyleeniheksamii-ni, polyheksametyleenidiamiini ja epihalogeenihydriinin ja polyamiinin kopolymeeri.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että amiinin kanssa reagoimaan kykenevä aine on bis-diatsobentsidiini-2,2’-disulfonihappo, 4,4'-difluori-3,3’-dinitrodifenyylisulfoni, difenyyli-4,4'-di-tiosyanaatti-2,2'-disulfonihappo,3-metoksidifenyylimetaa-10 ni-4,4'-di-isosyanaatti, tolueeni-2-isosyanaatti-4-iso- tiosyanaatti, tolueeni-2,4-di-isotiosyanaatti, diatsobent-sidiini, diatsobentsidiini-3,3'-dianisidiini, Ν,Ν'-heksa-metyleenibis-jodiasetamidi, heksametyleenidi-isosyanaat-ti, syanuurikloridi, 1,5-difluori-2,4-dinitrobentseeni tai 15 glutaarialdehydi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on glukoamylaasi, beta-amylaasi, pullulanaasi, transglukosidaasi, laktaasi, tryp-siini, papaiini, heksokinaasi, fisiini, bromeliini, lak- 20 taattidehydrogenaasi, glukoosi-isomeraasi, kymotrypsiini, pronaasi, asylaasi, invertaasi, alfa-amylaasi, glukoosiok-sidaasi, pepsiini, renniini, sieniproteaasi tai näiden seos.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-25 n e t t u siitä, että piimään hiukkaskoko on noin 0,32 - 1,118 mm, huokosten koko on säteenä annettuna 35 -1000 Angströmiä, ja pinta-ala on noin 20 - 60 m2/g.

6. Immobilisoitu entsyymikonjugaatti, tunnet-t u siitä, että se sisältää huokoista, rakeista piimaata, 30 johon on kiinnitetty reaktiotuote, jonka ovat muodostaneet polyamiini, jonka molekyylipaino on 500 - 100 000 ja :* jossa on vapaita amiiniryhmiä, ja amiinin kanssa reagoi maan kykenevä aine, joka on multifunktionaalinen aldehy-di, multifunktionaalinen orgaaninen halogenidi, multifunk-35 tionaalinen anhydridi, multifunktionaalinen atsoyhdiste, 33 92074 multifunktionaalinen isotiosyanaatti tai multifunktionaa-linen isosyanaatti, jonka reagoimattomien, amiinin kanssa reagoimaan kykenevien ryhmien on annettu reagoida entsyymin tai entsyymien vapaiden amiiniryhmien kanssa, jolloin 5 entsyymi tai entsyymit ovat kiinnittyneet siihen.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että piimään hiukkaskoko on noin 0,32 - 1,118 mm, huokosten koko on noin 35 - 1000 Angströ-miä säteenä annettuna ja pinta-ala on noin 20 - 60 m2/g, ja 10 polyamiini on valittu ryhmästä, jonka muodostavat polyety- leenidiamiini, polyetyleeni-imiini, polyheksametyleenidi-amiini, polymetyleenidisykloheksyyliamiini, polymetyleeni-dianiliini, polytetraetyleenipentamiini, polyfenyleenidi-amiini, polydietyleenitriamiini, polytrietyleenitetramii- 15 ni, polypentaetyleeni-heksamiini, polyheksametyleenidi- amiini ja epihalogeenihydriinin ja polyamiinin kopolymee-ri.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että amiinin kanssa reagoimaan ky- 20 kenevä aine on bis-diatsobentsidiini-2,2'-disulfonihappo, 4,4'-difluori-3,3'-dinitrodifenyylisulfoni, difenyyli-4,4'-ditiosyanaatti-2,2’-disulfonihappo, 3-metoksidife-nyylimetaani-4,4'-di-isosyanaatti, tolueeni-2-isosyanaat-ti-4-isotiosyanaatti, tolueeni-2,4-di-isotiosyanaatti, .25 diatsobentsidiini, diatsobentsidiini-3,3'-dianisidiini, N,N'-heksametyleenibis-jodiasetamidi, heksametyleenidi-isosyanaatti, syanuurikloridi, 1,5-difluori-2,4-dinitro-bentseeni tai glutaarialdehydi.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen konjugaatti, 30 tunnettu siitä, että entsyymi on glukoamylaasi, beta-amylaasi, pullulanaasi, transglukosidaasi, laktaasi, trypsiini, papaiini, heksokinaasi, fisiini, bromeliini, laktaattidehydrogenaasi, glukoosi-isomeraasi, kymotrypsii-ni, pronaasi, asylaasi, invertaasi, alfa-amylaasi, glu- 35 koosioksidaasi, pepsiini, renniini, sieniproteaasi tai näiden seos. 9 2 ϋ 7 4 34

10. Menetelmä immobilisoidun entsyymikonjugaatin valmistamiseksi ja tärkkelyksen muuttamiseksi sokeriksi sen avulla, tunnettu siitä, että se sisältää seu-raavat vaiheet: 5 a) saatetaan huokoinen, rakeinen piimää kosketuk seen polyamiinin liuoksen kanssa, jonka liuoksen pH on 9 - 9,9 ja jolloin polyamiinin molekyylipaino on 500 -100 000 ja polyamiinilla on vapaita amiiniryhmiä, jolloin polyamiini kiinnittyy piimäähän; 10 b) poistetaan liuotin ja siinä mahdollisesti oleva kiinnittymätön polyamiini kosketuksesta piimään kanssa ja saatetaan em. piimää kosketukseen amiinin kanssa reagoimaan kykenevän aineen liuoksen kanssa, joka aine on multi-funktionaalinen aldehydi, multifunktionaalinen orgaaninen 15 halogenidi, multifunktionaalinen anhydridi, multifunktio- naalinen atsoyhdiste, multifunktionaalinen isotiosyanaatti tai multifunktionaalinen isosyanaatti, jolloin yksi reagoimaan kykenevistä ryhmistä reagoi vapaiden amiiniryhmien kanssa ja amiinin kanssa reagoimaan kykenevä osa jää saa-20 taville lisäreaktiota varten; c) poistetaan liuotin ja siinä mahdollisesti liuenneena oleva reagoimaton, amiinin kanssa reagoimaan kykenevä aine kosketuksesta piimaakantajamateriaalin kanssa, joka saatetaan kosketukseen liuoksen kanssa, jossa on im-,25 mobilisoitava entsyymi tai entsyymit, jolloin näiden amii-niryhmät saatetaan reagoimaan reagoimattoman, amiinin kanssa reagoimaan kykenevän osan kanssa muodostaen kova-lenttisia sidoksia näiden välille, jolloin glukoamylaasi immobilisoituu, ja 30 d) saatetaan immobilisoitu entsyymi tai entsyymit kosketukseen nestemäisen tärkkelyksen kanssa tämän muuttamiseksi sokeriksi. 9 2 ϋ 74 35