KR100883206B1 - 실라카 비드를 포함하는 생물 촉매 고정화용 담체, 및 이의용도 - Google Patents

실라카 비드를 포함하는 생물 촉매 고정화용 담체, 및 이의용도 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 실라카 비드를 포함하는 생물 촉매 고정화용 담체, 상기 담체를 이용한 고정화 효소 및 이의 이용방법에 관한 것이다. 본원 발명에 따른 생물 촉매 고정화 담체 및 이에 고정화된 효소는 인체에 무해하며 재사용이 가능하고 안정성이 증가되며 반응성, pH 및 온도 조절이 용이할 뿐만 아니라, 식품 또는 의약관련 산업에 널리 사용될 수 있다.
담체, 고정화

Description

실라카 비드를 포함하는 생물 촉매 고정화용 담체, 및 이의 용도{Support for immobilizing a biocatalyst comprising silica bead and use thereof}
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 고정화 효소와 유리 효소의 전분가수분해활성에 미치는 pH의 영향을 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 고정화 효소와 유리 효소의 전분가수분해활성에 미치는 온도의 영향을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 고정화 효소와 유리효소의 열안정성을 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 고정화 효소와 유리효소의 경시적 활성 변화를 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 고정화 효소의 재사용에 따른 활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 고정화 효소와 유리효소의 보관 안정성을 4 ℃의 조건에서 측정하여 비교한 그래프이다.
[발명이 속하는 기술분야]
본원 발명은 실리카 비드를 이용한 생체 촉매 고정화용 담체, 상기 담체를 이용한 고정화 효소, 상기 고정화 효소의 제조방법 및 이의 이용방법에 관한 것이다.
[종래기술]
효소 고정화의 기본개념은 효소를 이용한 생물화학공정의 효소의 활용기술에 관한 분야로서 효소의 생물학적 활성을 개량하는 기술 분야와 그 활성을 안정화시키고 경제적으로 활용하는 기술 분야로 구분할 수 있는데 전자는 유전공학적인 방향으로 연구가 진행되는데 비하여 후자는 고정화법을 중심으로 발전되어 왔다.
효소를 고정화시키는 중요한 목적은 효소를 쉽게 회수하여 재이용할 수 있기 때문에 효소 반응공정의 경제성을 높여줄 수 있으며, 반응양식을 회분식 또는 연속식으로 다양하게 적용할 수 있다는 데 있다. 따라서 자연 효소를 생물화학 공정에서 효과적으로 이용하기 위해서는 효소를 고정화 시켜야 하는데, 일반적인 효소의 고정화 방법은 물리적 흡착방법 또는 화학적 방법이다. 상기 물리적 흡착방법은 주로 이온 교환(ion-exchange) 방법을 이용하는데, 상기 이온 교환 방법은 비독성이라는 장점이 있으나 그 결합력이 약하다는 문제점이 있다. 또한, 상기 화학적 방법은 화학 반응에 의해 공유결합을 형성시켜 효소를 고정시키기 위하여 시약을 사용하는 것으로, 상기 방법은 가교 결합력이 강하기는 하지만 상기 효소의 고정화를 위해 사용하는 시약이 독성이 있기 때문에 식품 또는 의약 관련 산업에는 사용하기가 힘들다는 단점이 있다.
유기 혹은 무기담체에 효소를 결합시켜서 효소를 고정화하여 재사용과 연속처리를 하는 효소고정화는 잘 알려져 있다. 유기물(예 셀룰로스, 나일론, 폴리아크릴아미드)은 담체로서 불리한데, 왜냐하면 기계적 안정성이 좋지 않으며, 용매에 의한 부식, pH와 이온 강도에 따르는 변화와 미생물에 의한 침해로 인하여 효소와의 결합이 파괴될 수 있기 때문이다. 따라서 효소가 흡착 혹은 공유적으로 흡착하는 무기물 담체가 제안되었는데, 결합형태는 효소의 사용조건과 형태 및 기질의 특성에 따른다. 즉, 기질이 강한 염농도이면, 흡착된 효소의 불착이 일어나기 때문에 흡착법은 적용될 수 없다. 따라서 효소의 공유결합이 우선한다. 담체의 표면은 효소의 결합을 유도하는 특이한 기능기를 포괄하여야 한다. 대부분 담체는 기능기를 포괄할 수 없기 때문에, 표면의 전처리가 필요하다.
공유결합에 의한 고정화는 담체의 표면과 효소를 결합제 혹은 교각으로 공유결합시키는 방법으로 담체를 표면처리하거나 효소에 작용기를 도입하여야 하며, 지지된 효소의 활성소가 차폐되지 않도록 하여야 한다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본원 발명은 높은 활성을 갖는 생체 촉매 고정화용 담체 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본원 발명의 또 다른 목적은 상기 생체 촉매 고정화용 담체를 이용하여 제조한 고정화 효소, 상기 고정화 효소의 제조방법 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본원 발명은 실리카 비드, 및 상기 실리카 비드의 외면에 키토산 및 카세인이 가교결합으로 결합된 생체 촉매 고정화용 담체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 본원 발명은 키토산과 카세인의 혼합용액에 실리카 비드를 침지한 후, 건조하고, 상기 건조된 비드를 에피클로로히드린 용액에 반응시켜 제조된 것인 생체 촉매 고정화용 담체일 수 있으며, 상기 혼합용액에 포함된 키토산과 카세인의 농도는 0.1 % 내지 10 %(w/v)일 수 있다.
본원 발명은 또한 상기 생체 생체 촉매 고정화용 담체에 생체 촉매를 고정시킨 고정화 효소 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 생체 촉매 고정화 효소는 상기 생체 촉매 고정화용 담체와 효소가 아미드결합으로 결합된 고정화 효소일 수 있으며, 상기 고정화 효소는 생체 촉매 고정화용 담체와 효소를 트랜스글루타미제(transglutaminase)의 존재 하에 반응시켜 제조된 것일 수 있다. 상기 생체 촉매는 바람직하게는 효소일 수 있고, 더욱 바람직하게는 알파-아밀라아제, 예컨데 내열성 알파-아밀라아제일 수 있다.
또한, 본원 발명은 상기 생체 촉매 고정화용 담체에 효소를 고정시킨 고정화 효소를 이용하여 전분을 분해하는 방법에 관한 것이다.
본원 발명에 따른 실리카 비드를 키토산-카세인의 혼합용액으로 처리하여 제조한 생체 촉매 고정화용 담체는 트랜스글루타미제(transglutaminase)를 이용하여 효소를 고정화할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 상기 효소가 알파-아밀라아제와 같이 식품 또는 의료 관련 산업에 많이 사용되고 있는 경우에는, 화학시료 대신 인 체에 무해한 비독성의 효소인 트랜스글루타미제를 사용하여 효소를 고정화할 수 있다는 점에서 산업적으로 매우 유용하다.
또한, 상기 생체 촉매 고정화용 담체에 트랜스글루타미제를 이용하여 고정화된 효소는 화학시료 대신 인체에 무해한 비독성의 효소를 사용한 것이므로 식품 또는 의약 관련 산업에 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 재사용이 가능하고, 안정성이 증가되며, 반응성을 조절하기 수비고, 온도와 pH 조절이 자유롭다는 장점이 있다.
이하 본원 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
본원 발명은 실리카 비드의 외층에 키토산 및/또는 카세인이 가교결합으로 결합된 생체 촉매 고정화용 담체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 키토산과 카세인의 혼합용액에 실리카 비드를 침지한 후 건조하고, 상기 건조된 비드를 에피클로로히드린 용액에 반응시켜 제조된 것인 생체 촉매 고정화용 담체일 수 있다.
본원 발명에 따른 담체에 포함되는 실리카 비드는 우수한 열안정성을 가진다. 상기 실리카 비드는 바람직하게는 실리카 겔 비드 또는 복합 실리카 겔 비드일 수 있다. 일 예로, 상기 복합실리카겔 비드는 TiO2 복합 실리카겔 비드, Al2O3 복합 실리카겔 비드 또는 ZrO2 복합 실리카겔 비드일 수 있다. 체적 당 효소활성을 높이고자 담체의 표면적을 크게 확보하고, 효소 고정화를 위한 충분한 기공 공간을 제공하고자, 상기 실리카 비드의 기공의 크기를 50 Å 내지 1000 Å로 설정하는 것이 바람직하다. 상기 실리카 비드의 입자크기는 10 메쉬(mesh) 내지 80 메쉬, 바람직하게는 30 메쉬 내지 70 메쉬, 더욱 바람직하게는 35 메쉬 내지 60 메쉬일 수 있다.
상기 키토산은 갑각류에 함유되어 있는 키틴을 인체에 흡수가 쉽도록 가공하여 제조한 물질일 수 있고, 상세하게는 상기 키틴을 탈아세틸화하여 제조한 물질일 수 있다. 상기 생체 촉매 고정화용 담체는 종래 고정화 효소의 문제점을 해결하기 위하여, 트랜스글루타미네이즈를 이용하여 생체 촉매 고정화용 담체와 생체 촉매의 글루타민(glutamine)과 리신(lysine)간에 아미드 결합(amide bond)을 형성시키기 위하여 생체 촉매 고정화용 담체에도 아실기(acyl group)가 요구된다. 상기 생체 촉매 고정화용 담체는 상기 키토산에 의해 강도와 안정성이 부여될 수 있을 뿐만 아니라, 카세인에 의해 아실기가 공급되기 때문에, 트랜스글루타미네이즈를 이용하여 상기 담체와 상기 효소가 아미드결합(amide bond)으로 결합된 고정화 효소의 제조에 사용될 수 있다.
상기 담체의 표면처리를 위하여 카세인 또는 카세인염을 사용할 수 있으며, 상기 카세인염은 바람직하게는 카세인 나트륨(Sodium Caseinate, Na Caseinate)일 수 있다. 상기 카세인 나트륨은 식품에 널리 사용되는 첨가물로 인체에 무해하다. 상기 카세인은 상기 고정화 담체의 강도와 안정성을 향상시키고 고밀도로 고정화 지지체를 코팅시킬 수 있으므로, 상기 카세인이 첨가된 고정화 담체는 강하고 안정한 생체 촉매 고정화용 담체일 수 있다.
상기 키토산과 카세인의 혼합용액에 포함되는 상기 키토산과 카세인의 함량은 실리카 비드와 키토산 및 카세인의 접촉 기회를 충분히 제공하여 상기 생체 촉매 고정화용 담체의 제조 수율을 확보하고, 제조비용을 최소화하기 위하여, 실리카 비드 100 중량에 대하여 각각 0.1 중량부 내지 10 중량부, 바람직하게는 1 중량부 내지 7.5 중량부, 더욱 바람직하게는 3 중량부 내지 6 중량부일 수 있다.
상기 혼합용액에 포함된 키토산과 카세인의 농도는 각각 0.1 % 내지 10 %(w/v), 바람직하게는 0.5 % 내지 5 %, 가장 바람직하게는 0.75 % 내지 2.0 % 일 수 있다.
상기 생체 촉매 고정화용 담체는 상기 실리카 비드를 키토산 및 카세인으로 표면 처리함으로써 상기 실리카 비드의 외층에 키토산 및 카세인을 가교결합시켜 제조할 수 있다. 일 예로, 상기 실리카 비드의 외층에 키토산 및 카세인이 가교결합으로 결합된 생체 촉매 고정화용 담체는 키토산과 카세인의 혼합용액에 실리카 비드를 침지한 후 건조하고, 상기 건조된 비드를 에피클로로히드린 용액에 반응시켜 제조할 수 있다.
본원 발명은 또한 상기 생체 촉매 고정화용 담체에 생체 촉매를 고정시킨 고정화 생체 촉매에 관한 것이다. 상기 고정화 생체 촉매는 상기 생체 촉매 고정화용 담체와 상기 생체 촉매간에 아미드결합(amide bond)으로 결합된 고정화 촉매일 수 있다. 일 예로, 상기 고정화 촉매는 상기 생체 촉매 고정화용 담체와 효소를 트랜스글루타미제(transglutaminase)의 존재 하에 반응시켜 제조된 고정화 효소일 수 있다.
상기 생체 촉매는 촉매활성을 나타낼 수 있는 어떠한 것이라도 적용할 수 있다. 예를 들면, 살아있거나 가공된 미생물 배양액, 미생물 농축액, 미생물 분말, 미생물 슬러지 또는 생물체 유래의 효소 또는 조효소 추출액, 효소 또는 조효소 농 축액, 효소 또는 조효소 분말을 적용할 수 있으며, 바람직하게는 효소이다. 상기 생체 촉매 고정화용 담체에 고정화 가능한 효소는 모든 종류의 효소를 포함하며, 예컨대, 가수분해효소(예, 아밀라아제, 글리코시다제, 프로테아제), 산화환원효소 (글루코스옥시다제, 카탈라제), 이성화효소(글루코스이소머라제) 및 전이효소(덱스트란수크라제) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 상기 효소는 알파-아밀라아제(α-amylase)이고, 더욱 바람직하게는 내열성 알파-아밀라아제이이며, 일 예로, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 내열성 알파-아밀라아제일 수 있다.
상기 생체 촉매의 함량은 고정화 효율을 고려하여 생체촉매의 포화 용해도 이하이고 충분한 농도인 것인 바람직하며, 구체적으로는 상기 생체 촉매 고정화용 담체 1 g 에 대하여 100 unit 내지 5000 unit 일 수 있고, 바람직하게는 500 unit 내지 3000 unit 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1000 unit 내지 2000 unit, 더더욱 바람직하게는 1400 unit 내지 1600 unit 일 수 있다. 일 예로, 내열성 알파-아밀라제의 경우 상기 1 unit은 60 ℃ 및 pH 7.0의 조건에서 1 분간에 1 μmole의 환원당(글루코스)을 생산하는 효소 양이다. 상기 환원당의 양의 측정은 DNS(3,5- dintrosalicylic acid reagent) 정량법으로 측정할 수 있다. 일 예로, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 내열성 알파-아밀라아제를 이용하는 경우에는 고정화 담체 1 g에 용액 1 ml 당 상기 알파-아밀라아제 0.54 mg이 포함되어 있는 효소 용액 3 ml를 첨가하여 고정화효소를 제조하였으며, 상기 효소 용액의 효소 활성은 1500 unit이었다.
상기 트랜스글루타미제는 글루타민(glutamine)과 리신(lysine)간에 아미드결 합(amide bond)을 형성하는 효소이다. 본원 발명에서 트랜스글루타미제는 상업적으로 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있고, 생산 균주 또는 상기 트랜스글루타미제의 코딩 유전자를 도입한 재조합 미생물에서 생산한 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 미생물 유래 트랜스글루타미제일 수 있다. 일례로서, 상기 트랜스글루타미제는 스트렙토베르티킬리움 모바리인세(Streptoverticillium mobaraense) 유래 트랜스글루타미제일 수 있다. 상기 스트렙토베르티킬리움 모바리인세 유래 트랜스글루타미제는 상기 스트렙토베르티킬리움 모바리인세의 배양물로부터 추출한 후, 찬 에틸 알코올로 처리하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 트랜스글루타미제는 백색~엷은 황색~진한 갈색의 분말, 입상, 덩어리 또는 투명~진한 갈색의 액체로 된 것일 수 있으며, 상기 스트렙토베르티킬리움 모바리인세에서 추출한 트랜스글루타미제의 최적 pH는 pH 6 내지 pH 7이고, 최적온도는 50 ℃ 내지 55 ℃이다.
본원 발명은 또한 상기 고정화 촉매를 제조하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본원 발명은 a) 실리카 비드를 키토산 및/또는 카세인으로 표면 처리하여 생체 촉매 고정화용 담체를 제조하는 단계; 및
b) 트랜스글루타미제(transglutaminase)를 이용하여 상기 생체 촉매 고정화용 담체에 생체 촉매를 고정화시키는 단계를 포함하는 고정화 촉매 제조방법에 관한 것이다.
a) 고정화용 담체 제조
상기 생체 촉매 고정화용 담체를 제조하는 단계는 상기 실리카 비드를 상기 키토산 및/또는 카세인으로 표면 처리하여 상기 실리카 비드의 외층에 키토산 및/ 또는 카세인을 가교결합시켜 제조할 수 있다. 바람직하게는, 상기 생체 촉매 고정화용 담체를 제조하는 단계는 a-1) 키토산 및/또는 카세인의 혼합 용액에 실리카 비드를 침지하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 a-2) 상기 혼합물을 에피클로로히드린 용액에 첨가하여 실리카 비드를 키토산 및/또는 카세인으로 가교결합을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 키토산 및/또는 카세인의 혼합 용액에 실리카 비드를 침지하여 혼합물을 제조하는 단계는 일 예로 상기 키토산 및/또는 카세인의 혼합 용액에 실리카겔 비드를 침지하고 10 시간 내지 24 시간, 바람직하게는 18 시간 내지 20 시간, 15 ℃ 내지 30 ℃, 바람직하게는 20 ℃ 내지 25 ℃에서 유지하여 수행할 수 있다.
상기 키토산 및/또는 카세인의 혼합용액에 실리카 비드를 침지하여 혼합물을 제조하는 단계는 추가로 상기 혼합물을 건조시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 건조 단계는 감압 건조, 진공 건조 또는 가열 건조 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 키토산 및/또는 카세인의 혼합용액에 있어서, 상기 키토산 및/또는 카세인을 용해시킨 용매는 아세트산 용액, 바람직하게는 아세트산 수용액 또는 아세트산 완충용액일 수 있다. 상기 키토산 및/또는 카세인의 혼합용액에 포함되는 키토산과 카세인의 농도는 각각 0.1 % 내지 10 %(w/v), 바람직하게는 0.5 % 내지 5 %, 가장 바람직하게는 0.75 % 내지 2.0 % 일 수 있다.
한편, 상기 키토산과 카세인의 혼합용액에 포함되는 상기 키토산과 카세인의 함량은 실리카 비드와 키토산 및 카세인의 접촉 기회를 충분히 제공하여 상기 생체 촉매 고정화용 담체의 제조 수율을 확보하고, 제조비용을 최소화하기 위하여, 실리카 비드 100 중량에 대하여 각각 0.1 중량부 내지 10 중량부, 바람직하게는 1 중량부 내지 7.5 중량부, 더욱 바람직하게는 3 중량부 내지 6 중량부일 수 있다.
상기 혼합물을 에피클로로히드린 용액으로 반응시켜 가교결합을 형성하는 a-2) 단계는 상기 에피클로로히드린 용액에 상기 키토산 및/또는 카세인의 혼합 용액에 실리카 비드를 침지하여 제조한 상기 혼합물을 첨가하고 30 ℃ 내지 90 ℃, 바람직하게는 50 ℃ 내지 75 ℃, 더욱 바람직하게는 55 ℃ 내지 65 ℃ 및 pH 7.5 내지 pH 11, 바람직하게는 pH 8.5 내지 pH 10, 더욱 바람직하게는 pH 9.5 내지 pH 10에서 2 시간 내지 16 시간, 바람직하게는 4 시간 내지 12 시간, 더욱 바람직하게는 6 시간 내지 8 시간 반응시켜 수행할 수 있다.
상기 에피클로로히드린 용액의 에피클로로히드린의 농도는 0.01 M 내지 1 M, 바람직하게는 0.05 M 내지 0.5 M, 더욱 바람직하게는 0.75 M 내지 1.25 M 일 수 있고, 상기 에피클로로히드린을 용해시키는 용매는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)일 수 있으며, 바람직하게는 DMSO에 추가로 0.1 M의 NaOH를 포함한 것일 수 있다. 상기 에피클로로히드린은 수산기(OH group)와 수산기, 아민기(NH2 group)와 아민기 및 수산기와 아민기 간에 결합을 형성할 수 있고, 상기 키토산 및 카세인은 수산기와 아민기를 모두 가지고 있다. 따라서, 상기 실리카에 키토산 및 카세인을 첨가하고 에피클로로히드린으로 반응시키는 경우, 상기 실리카에 키토산 및 카세인으로 표면처리 즉, 상기 키토산 및/또는 상기 카세인의 가교결합을 형성시켜 상기 실리카를 코팅시킬 수 있다
상기 실리카 비드를 키토산 및/또는 카세인으로 표면 처리하는 단계는 상기 에피클로로히드린 용액으로 반응시키는 단계를 수행한 후, 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척하는 단계는 NaCl 용액 또는 증류수, 바람직하게는 증류수를 이용할 수 있으며, 일 예로 증류수를 이용하여 세척한 후에, filter paper를 이용하여 회수하는 과정을 3 내지 5회 반복하여 세척할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
b) 담체에 생체 촉매를 고정화하는 단계
상기 생체 촉매 고정화용 담체에 생체 촉매를 고정하시키는 b) 단계는 트랜스글루타미제(transglutaminase)를 이용하여 상기 생체 촉매 고정화용 담체와 상기 생체 촉매의 글루타민(glutamine)과 리신(lysine)간에 아미드결합(amide bond)으로 결합시키는 단계일 수 있고, 상기 생체 촉매 및 트랜스글루타미제가 포함되어 있는 용액에 상기 생체 촉매 고정화용 담체를 첨가하고 반응을 진행시켜 수행할 수 있다.
상기 생체 촉매 및 트랜스글루타미제가 포함되어 있는 용액에 상기 생체 촉매 고정화용 담체를 첨가하고 반응을 진행시켜 상기 생체 촉매 고정화용 담체와 상기 생체 촉매의 글루타민(glutamine)과 리신(lysine)간에 아미드결합(amide bond)으로 결합시키는 단계는 교반함으로써 이루어진다. 상기 반응을 수행한 후에는, 적당한 완충액으로 효소가 고정화된 담체를 충분하게 세정하여, 불충분한 결합을 하고 있어 이탈하기 쉬운 효소 및 잉여의 효소와 트랜스글루타미제를 제거하는 것 이 바람직하다. 본원 발명의 바람직한 반응 pH는 pH 7이므로, 추가적인 완충액을 사용하지 아니할 수 있으며, 상기 완충액으로 증류수를 사용할 수 있다. 상기 트랜스글루타미제(transglutaminase)를 이용하여 상기 생체 촉매 고정화용 담체에 생체 촉매를 고정화시키는 단계는 트랜스글루타미제는 역가조정, 품질보존 등을 위하여 추가로 희석제 또는 안정제 등을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 생체 촉매 및 트랜스글루타미제가 포함되어 있는 용액량은 고정화용 담체의 함량에 비하여 용액량이 너무 적으면 트랜스글루타미제를 이용한 반응시 진탕 또는 교반에 의해 담체의 파손이 생길 수 있고, 용액량이 너무 많아지면 고정화 반응율이 감소될 수 있다. 일 예로, 상기 생체 촉매 및 트랜스글루타미제가 포함되어 있는 용액량과 상기 생체 촉매 고정화용 담체의 함량은 상기 생체 촉매 및 트랜스글루타미제가 포함되어 있는 용액량 10 ml를 기준으로 상기 생체 촉매 고정화용 담체의 함량 0.5 g 내지 3 g, 바람직하게는 1 g 내지 1.5 g일 수 있다.
상기 생체 촉매의 함량은 고정화 효율 관점에서 효소의 포화 용해도 이하이고 충분한 농도인 것인 바람직하다. 구체적으로는, 상기 생체 촉매 고정화용 담체 1 g 에 대하여 담체 1 g 에 대하여 100 unit 내지 5000 unit 일 수 있고, 바람직하게는 500 unit 내지 3000 unit 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1000 unit 내지 2000 unit, 더더욱 바람직하게는 1400 unit 내지 1600 unit 일 수 있다. 일 예로, 내열성 알파-아밀라제의 경우 상기 1 unit은 60 ℃ 및 pH 7.0의 조건에서 1 분간에 1 μmole의 환원당(글루코스)을 생산하는 효소 양이다. 상기 환원당의 양의 측정은 DNS(3,5- dintrosalicylic acid reagent) 정량법으로 측정할 수 있다. 일 예 로, 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 내열성 알파-아밀라아제를 이용하는 경우에는 고정화 담체 1 g에 상기 알파-아밀라아제 1500 unit 및 트랜스글루타미제 180 unit을 혼합하여 37 ℃에서 4 시간 동안 반응시켜 고정화 효소를 제조한다.
상기 트랜스글루타미제(transglutaminase)를 이용하여 상기 생체 촉매 고정화용 담체에 생체 촉매를 고정화시키는 단계의 반응 조건 및 반응 수행 시간은 생체 촉매 및 트랜스글루타미제의 종류에 따라 변형될 수 있으며, 바람직하게는 상기 트랜스글루타미제 또는 생체 촉매가 실활되지 아니하는 온도 범위 및 상기 트랜스글루타미제 또는 상기 촉매가 변성되지 아니한 pH 범위내의 반응 조건에서 수행할 수 있다. 상기 pH 범위를 트랜스글루타미제 또는 상기 촉매가 변성되지 아니한 pH 범위내로 조정하기 위하여, 완충액을 사용할 수 있고, 상기 완충액은 아세트산 완충액, 인산 완충액 또는 트리스염산 완충액 등일 수 있다.
또한, 본원 발명은 상기 생체 촉매 고정화용 담체에 생체 촉매를 고정시킨 고정화 효소의 이용방법을 제공하는 것이다. 상기 고정화 효소는 바람직하게는 상기 고정화 효소는 상기 생체 촉매 고정화용 담체와 알파-아밀라아제를 트랜스글루타미제의 존재 하에 반응시켜 제조된 것일 수 있으며, 상기 알파-아밀라아제는 바람직하게는 내열성 알파-아밀라아제일 수 있다.
본원 발명의 생체 촉매 고정화용 담체에 효소는 기존의 유리된 효소와 동일한 반응 조건에서 고활성이 유지될 수 있을 뿐만 아니라 효소의 재사용성 및 보관성과 안정성에서도 우수한 효과가 있으므로 장기간에 걸쳐서 연속 효소반응이 가능 한 고정화 효소를 제조할 수 있는 유리한 효과가 인정된다. 또한, 상기 고정화 효소를 이용하는 경우에는 효소반응에 의하여 얻어지는 생산물의 순도향상, 효소사용량의 저감, 반응용기의 축소화란 측면에서 산업적으로 매우 큰 효과가 인정된다.
상기 고정화 효소를 이용하는 방법은 바람직하게는 상기 고정화 효소를 이용한 전분 분해 방법일 수 있다.
본원 발명의 전분 분해 방법은 효소를 이용하는 통상의 전분 분해 방법일 수 있으며, 구체적으로는 본원 발명의 생체 촉매 고정화용 담체를 말토 올리고당, 전분, 사이클로덱스트린, 플루란, 아카보오스 및 파라-나이트로페닐 말토펜타오사이드로 이루어진 군에서 선택된 1 이상이 용해되어 있는 용액, 바람직하게는 말토 올리고당, 전분 또는 이들의 혼합물이 용해되어 있는 용액에 접촉시키고 pH 4 내지 pH 8, 바람직하게는 pH 5 내지 pH 7 및 30 ℃ 내지 90 ℃, 바람직하게는 50 ℃ 내지 80 ℃, 더욱 바람직하게는 60 ℃ 내지 75 ℃에서 반응시키는 방법일 수 있다.
상기 전분 분해 방법에 의해서, 글루코TM, 말토오스, 말토테트라오스, 말토트라이오스, 판노오스, 아카비오신-글루코오스, 파라-나이트로페닐 글루코사이드, 파라-나이트로페닐 말토사이드 및 이들의 혼합물, 바람직하게는 글루코TM, 말토오스, 말토테트라오스, 말토트라이오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 당화합물을 제조할 수 있다.
하기 실시예를 들어 본원 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본원 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
[실시예]
실시예 1: 고정화 효소의 제조
1-1: 키토산-카세인이 코팅된 실라카 비드 제조
1% 키토산과 1% 카세인을 1M 아세트산 용액에 용해하여 키토산-카세인 혼합용액을 제조하였다. 5 g의 실라카 겔 비드를 상기 혼합용액에 담그고 하룻밤 동안 반응시켰다. 상기 하룻밤 동안 반응시킨 상등액을 부어 버리고 진공조건하에서 상기 실리카 겔 비드를 건조하였다. 0.1M 에피클로로히드린이 첨가된 DMSO에 상기 비드를 재현탁하고 60 ℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 후에, 상기 0.1M 에피클로로히드린이 첨가된 DMSO에서 반응을 수행한 상기 비드를 증류수로 세척하였다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실험을 키토산 및 카세인의 농도를 다양하게 하여 실험을 반복하여 수행하였고, 얻어진 시료 1 내지 5를 얻었다.
구체적으로, 상기 키토산-카세인이 코팅된 실리카 비드는 하기와 같은 방법으로 제조하였다. 본 실시예에 사용한 실리카 겔 비드는 담체의 입자크기가 35 메쉬(mesh) 내지 60 메쉬이고, 상기 담체의 기공의 크기가 60 Å이며, 99 %인 silica gel(DavisilTM, grade 636, Sigma 236802, Sigma, USA)을 사용하였다. 상기 실리카겔 비드의 제조를 위한 혼합용액(silica buffer solution)은 1 % chitosan(Sigma, Medium molecular weight, USA) 및 1 % sodium casein(Sigma C8654, Casein sodium salt from bovine milk, USA)을 포함하는 1 M 아세트산 용액(acetic acid)을 첨가 한 100 ml 증류수에 실리카겔 5 g을 혼합하여 제조하였으며, 상기 키토산 및 카세인이 코팅된 실리카 비드는 상기 실리카겔 비드의 제조를 위한 혼합용액 100 ml를 하룻밤 동안, 구체적으로 18 내지 20시간 실온에 방치하고, 건조(증발) 공정으로 건조분말상태로 제조한 후에, 상기 건조분말을 50 ml DMSO(Dimethyl sulfoxide, pH 10)와 에피클로로히드린(Sigma E1055, USA)를 첨가하여 pH 10 및 60 ℃에서 키토산, 카세인과의 반응을 유도하여, 6 시간 반응시키고, 증류수로 세 번 세척하여 제조하였다.
1-2: 상기 코팅 실라카 비드에 알파-아밀라아제의 고정화
상기 실시예 1-1에서 얻은 코팅 실라카 비드를 알파-아밀라아제 용액에 첨가한 후에, 트랜스글루타미나제 용액(pH 7.0)을 첨가하여 6시간동안 반응시켰다. 상기 얻어진 효소 고정화 비드를 여과하고 증류수로 세척하였다. 상기 실험은 실시예 1-1에서 얻은 시료 1 내지 5 각각에 대해서 수행하였다.
구체적으로는, 알파-아밀라아제(7500 unit) 및 트랜스글루타미나제(225 unit)를 PBS(phosphate buffer solution, pH 7.0)에 첨가하여 제조한 알파-아밀라아제 용액과 트랜스글루타미나제 용액을 혼합한 후, 전체 부피가 10 ml가 되도록 PBS(phosphate buffer solution, pH 7.0)를 추가로 첨가하고, 상기 혼합액에 5 g의 비드를 첨가한 후에, 37 ℃에서 6 시간 동안 반응을 수행하였다. 상기 반응을 수행한 후에, 제조된 효소 고정화 비드에 대해 여과 및 세척(filtering, waterman NO2)을 3번 수행하고 활성을 측정하였다.
상기 알파-아밀라제의 경우 상기 1 unit은 60 ℃ 및 pH 7.0의 조건에서 1 분간에 1 μmole의 환원당(글루코스)을 생산하는 효소 양으로, 상기 환원당의 양의 측정은 DNS(3,5- dintrosalicylic acid reagent) 정량법으로 측정하였다.
상기 알파-아밀라아제는 시판용 균주인 Bacillus licheniformis(ATCC 1450) 균주를 배양하여, 상기 균주가 배양 중에 분비하는 아밀라아제를 수득하여 사용하였고, 상기 트랜스글루타미나제는 Streptomyces mobaraensis(ATCC 29032) 균주를 배양하여, 상기 균주가 배양 중에 분비하는 아밀라아제를 수득하여 사용하였다.
Figure 112007045029191-pat00001
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 트랜스글루타미나제의 기질 즉, 가교결합을 형성시키는 카세인과 키토산의 최적화 조건을 찾기 위하여 다양한 비율로 고정화 담체를 코팅한 결과 키토산 1 %(w/v)과 카세인 1 %(w/v)의 비율로 코팅한 고정화 담체를 이용하여 알파-아밀라아제를 고정한 경우 가장 높은 효소활성이 얻어짐이 확인되었다.
실시예 2: 고정화 효소의 특성
2-1: 고정화 효소의 pH 특성
상기 실시예 1-2에서 제조한 고정화 효소 및 유리 효소의 pH에 따른 효소활성 측정은 하기와 같이 수행하였다.
pH 7.0 의 PBS 완충액에 1%의 전분을 첨가하여 본 실험의 반응에 이용할 기질인 전분용액(soluble starch solution)을 제조하였다. 상기 실시예 1-2에서 제조된 고정화 효소 1 g(236 unit) 및 실시예 1-2에서 수득한 0.5 mL(250 unit) 유리 아밀라아제를 각각 상기 제조된 1% 전분 용액 2 ml에 첨가한 후, 60 ℃에서 10분간 반응을 수행하였다. 상기 반응을 수행한 후에, 효소 활성으로 인해 생성된 환원당의 측정은 반응 후의 반응액 0.5 ml를 2 ml의 DNS 용액에 첨가한 후 100 ℃에서 10 분간 반응시키고, 상기 환원당에 의한 발색을 540 nm에서 측정하는 DNS 환원당정량법에 의해 검토하였다.
상기의 방법으로 여러 가지 pH 조건하에서 고정화 효소와 유리 효소의 전분 가수분해 활성을 측정하였다. 효소활성에 있어 pH가 미치는 영향은 도 1의 그래프로 나타냈다.
상기 도 1에 나타낸 바와 같이, pH 조건에 따른 전분 가수분해시 고정화 효소(●)는 유리 효소(○)와 같이 pH 6에서 가장 높은 효소 활성을 나타내었다. 본원발명의 고정화된 효소의 특징은 효소와 활성이 같거나 혹은 활성이 떨어지는 경향이 있지만 한 번의 반응에만 이용 가능한 유리 효소와 비교하여 효소 활성이 유지 되는 한 회수하여 재사용이 가능하다는 점에서 유리한 효과가 있는 것으로 확인되었다. 상기 도 1에 기재된 활성은 최고 활성을 100%로 하였을 때, 측정된 상대적 활성(Relative activity)으로, 고정화 효소의 경우 유리 효소에 비하여 넓은 범위의 pH에 대해 더 높은 잔존 활성을 보이는 것이 확인되어 pH에 대한 안정성이 매우 우수한 것으로 확인되었다.
2-2: 고정화 효소의 온도 특성
상기 실시예 1-2에서 제조한 고정화 효소 및 유리 효소의 온도에 따른 효소활성 측정은 pH를 pH 7.0으로 하고, 온도 조건을 30 ℃ 내지 90 ℃의 범위에서 특정 온도르 하여 반응을 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 온도 조건에 따른 전분 가수분해시 고정화 효소(●)와 유리 효소(○)의 활성은 모두 70 ℃에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 본원발명의 고정화된 효소는 고정되지 않은 상태의 유리 효소와 기본적으로 같은 온도 특성을 나타내었고, 고정화 효소의 활성은 유리 효소의 활성과 같거나 유리 효소의 활성에 비하여 다소 낮은 경향이 확인되었지만 한 번의 반응에만 이용 가능한 유리 효소와 비교하여 효소 활성이 유지 되는 한 회수하여 재사용이 가능하다는 점에서 유리한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
2-3: 고정화 효소의 열안정성
상기 실시예 1-2에서 제조한 고정화 효소(●)와 상기 실시예 2-1의 유리 효소(○)를 60 ℃부터 100 ℃ 범위에서 1 시 간동안 열처리를 한 후, 회수하여 알파-아밀라아제의 잔류 활성을 상기의 2-1에 기재된 방법으로 측정하였다. 상기 잔류 활성의 측정은 pH 7.0 및 60 ℃의 조건에서 측정하였으며, 상기 효소의 열안정성을 나타내는 잔류 활성의 측정 결과는 도 3에 나타내었다.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 각 온도에서 한 시간 동안 열처리를 한 결과 80 ℃까지는 고정화 효소와 유리효소 모두 본래 효소 활성의 90% 이상을 유지하는 높은 안정성을 나타내었으나, 90 ℃ 이상의 온도에서 열처리를 한 경우에는 효소의 온도 안정성이 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 경향에도 불구하고, 상기 고정화 효소는 상기 유리 효소에 비하여 100 ℃의 온도에서 열처리한 경우에도, 80% 이상의 잔존 효소 활성을 보이는 것으로 확인되어 유리 효소에 비하여 높은 안정성을 보이는 것으로 확인되었다.
2-4: 고정화 효소와 유리효소의 효소활성 비교
상기 실시예 1-2에서 제조한 고정화 효소 및 유리효소의 시간 경과에 따른 효소 활성의 변화 측정을 하기와 같이 수행하였다.
pH 7.0 의 PBS 완충액에 2%의 전분을 첨가하여 본 실험의 반응에 이용할 기질인 전분용액(soluble starch solution)을 제조하였다. 상기 실시예 1-2에서 제조된 고정화 효소 220 unit과 상기 실시예 2-1의 유리 아밀라아제 220 unit을 각각 상기 제조된 2% 전분 용액 4 ml에 첨가한 후, 60 ℃에서 8시간 동안 반응을 수행하면서, 각 시간 별로 반응액을 수득하여 효소 활성을 상기 실시예 2-1의 DNS 환원당정량법으로 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 고정화 효소(●)와 유리 효소(○)의 활성을 비교한 결과, 반응을 시작한 후 1 시간이 경과한 시점에서는 고정화 효소와 유리효소가 거의 동일한 활성을 보였으나, 2시간이 경과한 시점부터는 유리효소는 효소 활성이 포화 상태에 도달하였음을 확인할 수 있었다. 이에 반하여, 고정화 효소는 계속 활성이 증가하여 6시간이 경과한 시점 이후에야 효소 활성이 포화 상태에 도달함을 확인할 수 있었다. 6시간이 경과한 시점에서 측정한 결과, 고정화 효소의 효소 활성은 유리 효소에 비하여 약 2.5배 정도 높은 것으로 확인되었다.
상기한 결과는 고정화에 의해 높아진 효소의 온도 안정성에 기인하여 효소 활성이 계속 지속된 것과 함께, 고정화 담체에 고정화 되어있는 효소들 중 중합도가 긴 본래의 기질과 접촉에 있어 방해를 받던 효소들이 반응시간이 길어짐에 따라 생성된 중합도가 짧아진 기질들과 접촉하여 반응할 수 있는 형태를 가지기 때문인 것으로 검토되어졌다.
2-5: 고정화 효소의 재사용성에 대한 검토
상기 실시예 1-2에서 제조한 고정화 효소의 재사용성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 재사용성을 측정하였다.
상기 실시예 1-2에서 제조된 고정화 효소 1 g을 상기 실시예 2-1에서 제조한 1% 전분용액 2 mL에 첨가한 후, 60 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 상기 반응 후에, 고정화 효소를 회수하여 PBS 완충용액(pH 7.0)으로 세척한 후, 상기와 같은 방법으로 효소 반응을 다시 수행하였으며, 이와 같은 방법으로 계속해서 동일한 반응을 12회 수행하였다. 상기 각 반응 후에, 회수된 반응액을 시료로 이용하여 생성된 환원당량을 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 DNS 환원당정량법을 수행하여 효소 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도 5에 나타낸 것과 같이, 상기 고정화 효소는 12회를 재사용한 경우에도 상기 고정화 효소의 효소 활성의 70% 이상의 효소 활성을 유지하는 것이 확인되었다. 상기 결과로부터 본원 발명에 의해 제조된 고정화된 효소는 효소의 재사용성이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
2-6: 고정화 효소의 보관 중의 안정성에 대한 검토
상기 1-2에서 제조된 고정화 효소의 보관중의 안정성을 검토하기 위해 유리효소와 함께 4 ℃에 보관하면서 매일 고정화 효소와 유리 효소의 활성을 2-1의 방법으로 측정하여 보관중의 안정성을 검토하였다.
상기 실시예 1-2에서 제조한 고정화 효소의 보관성 및 안정성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 재사용성을 측정하였다.
상기 실시예 1-2에서 제조된 고정화 효소는 1 g 씩, 상기 실시예 2-1의 유리 효소는 1 ml 씩 채취하여 각각 4 ℃에서 따로 용기에 보관하면서, 매일 각각의 효소의 활성을 상기 실시예 2-1에 기재된 방법으로 pH 7.0 및 60 ℃의 조건에서 측정하여, 시간 경과에 따른 보관 중의 안정성을 확인하였고 그 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 도 6에 나타낸 것과 같이, 상기 유리 효소의 경우, 보관 기간이 경과함에 따라 빠른 속도로 효소 활성이 감소되다가 보관 12일 째에는 효소 활성을 완전히 상실하였다. 반면에, 고정화 효소는 보관 기간이 경과하는 경우에도 효소 활성의 감소 폭이 미비하였으며, 12일이 경과한 경우에도 본래 활성의 90% 이상을 유지하는 높은 안정성을 나타내었다. 상기 결과로부터 본원 발명에 의해 제조된 고정화된 효소는 보관성 및 안정성이 매우 우수함을 확인되었으며, 상기한 결과로부터 실제 산업적인 측면에서도 높은 경제 효과가 있는 것으로 확인되었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본원 발명의 생체 촉매 고정화용 담체에 효소를 고정화하여 제조되는 고정화 효소는 기존의 유리된 효소와 동일한 반응 조건에서 고활성이 유지될 수 있을 뿐만 아니라 효소의 재사용성 및 보관성과 안정성에서도 우수한 효과가 있으므로 장기간에 걸쳐서 연속 효소반응이 가능한 고정화 효소를 제조할 수 있는 유리한 효과가 인정되었다. 또한, 상기 고정화 효소를 이용하는 경우에는 효소반응에 의하여 얻어지는 생산물의 순도향상, 효소사용량의 저감, 반응용기의 축소화란 측면에서 산업적으로 매우 큰 효과가 있을 것으로 기대된다.

Claims (8)

  1. 실리카 비드 및 상기 비드의 외층에 키토산　및 카세인이 가교결합으로 결합된 생체 촉매 고정화용 담체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 실리카 비드는 기공크기가 50 Å 내지 1000 Å인 생체 촉매 고정화용 담체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 담체는 키토산과 카세인의 혼합용액에 실리카 비드를 침지한 후 건조하고, 상기 건조된 비드를 에피클로로히드린 용액에 반응시켜 제조된 것인 생체 촉매 고정화용 담체.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 혼합용액은 키토산과 카세인이 실리카 비드 100 중량에 대하여 각각 0.1 중량부 내지 10 중량부로 혼합된 것인 생체 촉매 고정화용 담체.
  5. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 생체 촉매 고정화용 담체와 효소가 아미드결합으로 결합된 고정화 효소.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 생체 촉매 고정화용 담체와 효소를 트랜스글루타미제(transglutaminase)의 존해 하에 반응시켜 제조된 것인 고정화 효소.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 효소는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 알파-아밀라아제인 고정화 효소.
  8. 제 7항에 따른 고정화 알파-아밀라아제를 이용하여 전분을 분해하는 방법.
KR1020070061110A 2007-02-05 2007-06-21 실라카 비드를 포함하는 생물 촉매 고정화용 담체, 및 이의용도 KR100883206B1 (ko)

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JPS59213390A (ja) 1983-05-19 1984-12-03 Asahi Denka Kogyo Kk 固定化酵素及びその製造方法
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