KR101644939B1 - 효소의 고정화 방법 및 이에 의한 고정화 효소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 담체에 효소를 고정화하는 방법 및 담체에 고정화된 고정화 효소에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 본 발명은 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 상기 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조하는 단계; 키토산, 효소, 완충액을 포함하는 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 효소를 전처리하는 단계; 및 상기 활성화 담체를 상기 전처리된 혼합용액에 첨가하여 담체와 효소의 흡착 또는 공유결합을 유도하는 단계;를 포함하는 담체에 효소를 고정화하는 방법 및 상기 고정화 방법에 의해 제조되는 고정화 효소에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 키토산, 효소, 완충액을 포함하는 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 효소를 전처리하는 단계; 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 상기 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조하는 단계; 및 상기 활성화 담체를 상기 전처리된 혼합용액에 첨가하여 담체와 효소의 흡착 또는 공유결합을 유도하는 단계;를 포함하는 담체에 효소를 고정화하는 방법 및 상기 고정화 방법에 의해 제조되는 고정화 효소에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 담체에 고활성이 유지된 상태에서 효소를 안정되게 고정화할 수 있고, 장기에 걸쳐 연속효소 반응이 가능한 고정화 효소를 제공할 수 있다.

Description

효소의 고정화 방법 및 이에 의한 고정화 효소{METHOD FOR IMMOBILIZATION OF ENZYME AND IMMOBILIZED ENZYME USING THE METHOD}
본 발명은 담체에 효소를 고정화하는 방법 및 담체에 고정화된 고정화 효소에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 본 발명은 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 상기 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조하는 단계; 키토산, 효소, 완충액을 포함하는 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 효소를 전처리하는 단계; 및 상기 활성화 담체를 상기 전처리된 혼합용액에 첨가하여 담체와 효소의 흡착 또는 공유결합을 유도하는 단계;를 포함하는 담체에 효소를 고정화하는 방법 및 상기 고정화 방법에 의해 제조되는 고정화 효소에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 키토산, 효소, 완충액을 포함하는 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 효소를 전처리하는 단계; 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 상기 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조하는 단계; 및 상기 활성화 담체를 상기 전처리된 혼합용액에 첨가하여 담체와 효소의 흡착 또는 공유결합을 유도하는 단계;를 포함하는 담체에 효소를 고정화하는 방법 및 상기 고정화 방법에 의해 제조되는 고정화 효소에 관한 것이다.
효소는 생화학 반응에서 촉매작용을 하는 단백질을 일컫는데, 일반적으로 추출 후에는 불안정하여 유기용매에서나 고온에서 사용될 수 없다. 그래서 흔히 효소반응은 상온에서 기질과 가용성 효소를 섞어 배양하는 단순 회분공정을 통해 이루어져 왔다. 그러나 이러한 방법에서는 반응조건을 일정하게 유지하면서 신선한 효소를 보급하거나 반응 후에 효소를 회수하는 조작 등이 현저하게 복잡할 뿐더러 반응생성물의 분리, 정제도 현저하게 번잡한 조작이 된다.
이와 같은 문제점을 해소하기 위하여 근래 효소를 수용성 담체에 고정화하여 효소반응을 연속적으로 실행하는 것이 검토되고 있다.
효소를 담체에 고정화시키는 방법은 흡착법, 이온결합법, 가교법, 포획법, 공유결합법 등이 있다. 이러한 고정화방법 중 공유결합법이 담체와 효소와의 결합력이 강하기 때문에 산업적 공정에 적용하기가 적합하다. 공유결합법은 효소가 담지되는 담체를 화학제품으로 표면처리하여 전자친화적 관능기가 고정되어 있는 상태로 변경한 후, 글루타르알데히드(Gluataraldehyde)와 같은 가교 결합물질을 이용하여 담체와 효소 중의 아미노기를 결합시키는 방법으로 사용된다.
그러나 공유결합법은 효소와 담체의 결합 시 효소의 활성부위가 화학물질과 결합하면서 활성이 감소하여 다른 고정화방법과 동일한 효율을 나타내기 위해서는 많은 양의 효소를 필요로 하며, 이에 따라 고정화비용이 상승하는 단점이 있다. 특히 효소와 담체의 결합이 무작위(random)하게 발생하므로 효소의 활성부위가 담체에 결합할 수 있는 확률이 높아져 효소의 활성부위를 일부 잃게 된다. 따라서 고정화되지 않은 상태의 효소와 동일한 효과를 얻기 위해서는 더 많은 양의 효소를 담체에 고정화시켜야 하며 이는 효소시스템의 비용상승과 효소반응기 규모를 증가시키는 결과를 초래한다.
따라서, 고활성의 효소를 고정화시켜 장기간 활성을 유지할 수 있으며, 더 안정되고 장기간에 걸쳐 사용할 수 있는 새로운 구조의 고정화 효소에 대한 개발이 요청되고 있는 실정이다.
한편, 키틴, 키토산 및 그 유도체가 면역증강, 항암 및 항균활성, 체내 콜레스테롤 개선작용, 고혈압 억제 작용 등 여러 가지 생리활성이 보고됨에 따라 기능성 신소재로서의 연구가 활발히 진행 중에 있다.
특히, 키틴 및 키토산 분해효소들에 의해 생성되는 저분자량의 키토올리고당은 다양하고, 높은 생리활성으로 국내·외적으로 많은 관심을 받고 있으며, 키토올리고당은 기능성 올리고당 중 면역활성증강 및 다양한 생리활성 측면에서 가장 뛰어난 약리·생리활성을 나타내고, pentamer 이상의 고중합도 oligomer들이 현재 식품 및 의약품의 중간 소재로 이용되고 있다.
현재 키토올리고당의 제조방법은 강산을 사용하는 화학적 분해방법과 키토산 분해효소를 이용하는 생물학적 방법이 있으나, 화학적 분해방법에서 키토산올리고당은 일반적으로 키토산을 진한 염산으로 가수분해하여 제조하는데, 이는 생성물의 안전성뿐만 아니라 환경오염 유발, 고중합도 올리고당의 저수율 등의 문제점이 있다.
본 발명과 관련된 종래기술로는 한국등록특허 제1994-0005581호에는 담체 표면의 아미노 작용기와 효소 분자 중의 아미노 작용기 사이에서 다관능성 가교제에 의한 축합반응에 의하여 시프 염기를 형성시키는 방법이 개시되어 있다. 그러나 상기의 방법에 의하여 제조된 담체는 표면적이 적어 고활성의 고정화 효소를 만들기어렵다는 문제점이 있었다.
이에 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 효소의 고정화 방법에 있어 효소의 활성부위가 담체 또는 화학물질에 결합되는 것을 방지하여 고활성 및 장시간 사용하는 경우에도 계속 반복적으로 효소활성을 나타낼 수 있는 효소의 고정화 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 고정화 방법에 의해 제조되는 고정화 효소를 제공하는 데 있다.
상기와 같은 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명은, 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 상기 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조하는 단계; 키토산, 효소, 완충액을 포함하는 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 효소를 전처리하는 단계; 및 상기 활성화 담체를 상기 전처리된 혼합용액에 첨가하여 담체와 효소의 흡착 또는 공유결합을 유도하는 단계;를 포함하는 담체에 효소를 고정화하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 키토산, 효소, 완충액을 포함하는 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 효소를 전처리하는 단계; 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 상기 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조하는 단계; 및 상기 활성화 담체를 상기 전처리된 혼합용액에 첨가하여 담체와 효소의 흡착 또는 공유결합을 유도하는 단계;를 포함하는 담체에 효소를 고정화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 담체는 실리카겔, 다공성 글라스, 제올라이트 또는 벤토나이트인 것을 기술적 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면 상기 아미노알킬실란 유도체는 β-아미노에틸-γ-아미노프로필메틸디메톡시실란, 아미노프로필메틸디에톡시실란, γ-아미노프로필트리메톡시실란 및 γ-아미노프로필트리에톡시실란 중에서 선택되는 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에 따르면 상기 다관능성 가교제는 글루타르알데히드, 숙신산알데히드, 포름알데히드 및 덱스트린알데히드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에 따르면 상기 혼합용액은 키토산을 0.5 내지 2%(w/v)의 농도로 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에 따르면 상기 혼합용액의 pH는 4 내지 6인 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에 따르면 상기 효소는 키토사나제 또는 키티나아제인 것을 기술적 특징으로 한다.
또한 본 발명의 다른 구성은 상기 고정화 방법에 의해 제조되는 고정화 효소를 제공한다.
본 발명에 의하면 담체에 고활성이 유지된 상태에서 효소를 안정되게 고정화할 수 있고, 장기에 걸쳐 연속효소 반응이 가능한 고정화 효소를 제공할 수 있다.
따라서 본 발명의 고정화 효소를 사용하면, 효소반응에 의해 얻어지는 생산물의 순도향상, 효소 사용량의 저감, 효소반응기의 경량화가 도모된다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 고정화 효소의 활성도를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 제1 태양은 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 상기 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조하는 단계; 키토산, 효소, 완충액을 포함하는 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 효소를 전처리하는 단계; 및 상기 활성화 담체를 상기 전처리된 혼합용액에 첨가하여 담체와 효소의 흡착 또는 공유결합을 유도하는 단계;를 포함하는 담체에 효소를 고정화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제2 태양은 키토산, 효소, 완충액을 포함하는 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 효소를 전처리하는 단계; 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 상기 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조하는 단계; 및 상기 활성화 담체를 상기 전처리된 혼합용액에 첨가하여 담체와 효소의 흡착 또는 공유결합을 유도하는 단계;를 포함하는 담체에 효소를 고정화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 담체에 효소를 고정화하기 위해서는 먼저 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 과정이 필요하다.
즉, 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시키면 담체의 표면에 존재하는 히드록시기 등의 관능기와 아미노알킬실란 유도체간의 실란 커플링 반응에 의해 아민기가 도입된 담체를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 담체를 아미노알킬실란 유도체가 첨가된 유기용매 속에 넣고 40~60℃에서 1~3시간 동안 반응시키면 실란 커플링반응에 의하여 아민기가 도입된 활성화 담체가 제조된다.
본 발명에 사용되는 담체는 실리카겔, 다공성 글라스, 제올라이트, 벤토나이트 등을 사용할 수 있으며, 본 발명에 사용되는 아미노알킬실란 유도체는 β-아미노에틸-γ-아미노프로필메틸디메톡시실란 (β-aminoethyl-γ-aminopropylmethyldimethoxy silane), 아미노프로필메틸디에톡시실란 (aminopropylmethyldiethoxy silane), γ-아미노프로필트리메톡시실란 (γ-aminopropyltrimethoxy silane), γ-아미노프로필트리에톡시실란 (γ-aminopropyltriethoxy silane) 등의 화합물을 사용할 수 있다.
이어서 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 다관능성 가교제 용액에 아민기가 도입된 담체 및 완충액을 첨가한 뒤 10~30℃에서 1~3시간 동안 반응시키면 활성화 담체를 제조할 수 있다.
본 발명에 사용되는 다관능성 가교제는 글루타르알데히드, 숙신산알데히드, 포름알데히드, 덱스트린알데히드 등의 폴리알데히드류를 사용할 수 있고, 이 중 글루타르알데히드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 완충액은 인산염(phosphate), MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), MES (2-(Nmorpholino)ethanesulfonic acid), McIlvaine 등의 완충액(buffer)을 사용할 수 있으며, 바람직한 pH 범위는 7 내지 9이다.
이어서 키토산, 효소, 완충액을 포함하는 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 효소를 전처리한다.
상기 전처리 공정에 의하여 효소의 활성부위를 보호함으로써, 추후 효소의 고정화 단계에서 효소가 담체 또는 화학물질과 결합하는 것을 방지할 수 있다.
상기 키토산은 효소의 활성부위에 경쟁적으로 결합하므로 고정화 단계 이전에 효소를 키토산으로 전처리하면 효소의 활성부위가 담체 또는 화학물질과 결합되는 확률을 감소시킨다. 즉, 효소의 활성부위는 담체와 결합하기 전에 키토산과 결합하며, 활성부위가 아닌 다른 부위의 아민기가 담체와 결합하게 된다.
본 발명에서 사용가능한 키토산의 중량평균 분자량은 150,000 내지 360,000이 될 수 있다. 키틴은 N-아세틸-D-글루코사민 단위체가 무수히 결합하여 이루어진 다당류 고분자 물질이고, 키토산은 키틴의 탈아세틸화에 의해 얻어진다. 그러나, 탈아세틸화는 완전하지 못해 일반적으로 키토산은 키틴과 탈아세틸화된 키틴이 혼합된 고분자이다. 따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 상기 키토산의 탈아세틸화 정도는 70 내지 90%, 바람직하게는 75 내지 85%이다.
본 발명에 사용되는 효소는 산화환원효소, 가수분해 효소, 전이 효소, 이성화 효소 등을 사용할 수 있으며, 상기 가수분해 효소의 일 예로는 키토사나제(chitosanase) 또는 키티나아제(chitinase)를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 효소의 전처리 단계는 pH에 영향을 받으므로 완충액이 중요하며, 상기 완충액은 초산 완충액이 바람직하다.
즉, 효소의 활성부위와 반응기질인 키토산과의 반응을 원활히 하기 위해 완충액을 사용하고, 본 발명의 효소 혼합용액의 pH는 4 내지 6인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 반응액의 pH는 효소의 활성이 저하되지 않는 범위에서 이루어져야 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 효소의 활성부위가 담체와 결합하는 것을 방지하기 위해 전처리되는 키토산의 농도는 0.5 내지 2%(w/v)인 것을 특징으로 한다. 이때 키토산이 0.5%(w/v) 미만으로 존재하면 효소의 활성부위가 담체와 결합하는 것을 방지하는 효과가 크지 않으며, 2%(w/v)를 초과하여 존재하면 반응용액의 점도가 상승하기 때문에 효소와 키토산과의 반응이 감소하여 효소의 활성부위 보호효과가 낮아지는 문제점이 있다.
본 발명의 효소 전처리단계는 효소가 활성을 가진 상태에서 고정화될 수 있도록 40℃ 이하의 온도를 유지하며, 바람직하게는 35 내지 39℃를 유지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 고정화 반응은 3 내지 5℃에서 10 내지 14시간 동안 반응시키면 담체와 효소간에 흡착 또는 공유결합이 형성되어 이루어진다.
상기 고정화 반응 후에는 적당한 완충액으로 효소가 고정화된 담체를 충분하게 세정하여, 활성부위와 결합된 키토산을 제거함으로써 고활성의 효소를 담체에 고정화할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 언급한 고정화 방법에 의해 제조되는 고정화 효소에 관한 것이다.
이하 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시 예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 활성화 담체의 제조
실리카겔 1g을 0.75M (3-aminopropyl)triethoxysilane이 첨가된 아세톤 용액 20mL에 첨가하여 50℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 실리카겔을 증류수로 세척한 다음 60℃에서 2시간 동안 건조시킨 후, 2.6M glutaraldehyde 용액 1.6mL에 건조된 실리카겔 및 100mM sodium phosphate buffer(pH 8.0) 18.4mL를 첨가한 뒤 20℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 뒤 실리카겔을 증류수로 세척한 다음 60℃에서 2시간 동안 건조하여 활성화된 실리카겔 담체를 제조하였다.
실시예 2 : 전처리한 효소의 제조
100mM sodium acetate buffer(pH 5.0)에 chitosan 1%(w/v)와 chitosanase 3,500U을 첨가하여 혼합액 20mL를 제조하였다. 이 반응액을 37℃, 100 rpm에서 30분간 반응시켜 chitosanase를 전처리하였다.
비교예 1 : 전처리하지 않은 효소의 제조
100mM sodium acetate buffer(pH 5.0)에 chitosan 1%(w/v)와 chitosanase 3,500U을 첨가하여 혼합액 20mL를 제조하였다.
실시예 3 : 전처리한 효소의 고정화
실시예 1에서 제조된 활성화된 실리카겔 담체를 실시예 2에서 제조한 전처리한 효소 혼합액에 첨가하여 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 여과 및 100mM sodium acetate buffer(pH 5.0)로 세척한 뒤 실온에서 건조하여 고정화된 효소를 제조하였다.
비교예 2 : 전처리하지 않은 효소의 고정화
실시예 1에서 제조된 활성화된 실리카겔 담체를 비교예 1에서 제조한 전처리하지 않은 효소 혼합액에 첨가하여 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 여과 및 100mM sodium acetate buffer(pH 5.0)로 세척한 뒤 실온에서 건조하여 고정화된 효소를 제조하였다.
실험예 1 : 고정화 효소의 활성도 측정
100mM sodium acetate buffer(pH 5.0) 5mL에 chitosan 1%(w/v)와 실시예 3 및 비교예 2에서 제조된 고정화된 chitosanase 0.1g을 첨가하여 37℃, 100 rpm에서 30분간 반응시켰다. 1N NaOH 1mL를 첨가하여 반응을 중단시키고, 원심분리하여 상등액 1mL를 발색시약 1mL(0.5 M sodium carbonate(anhydrous) 1L에 0.5g potassium ferricyanide 첨가 용액)와 반응시켜 15분간 끓인 후 식혀 420nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과는 표 1에 나타내었다.
Chitosanase 활성 1U은 1분당 환원당 1μmol을 유리시키는 효소의 양으로 정의하였고, 유리된 환원당은 D-glucosamine의 표준시약을 사용하였다.
표 1에 의하면, 키토산아제를 전처리하지 않고 고정화시킨 비교예 2의 활성도는 10.6 U/g matrix인 반면, 키토산으로 전처리를 수행한 뒤 고정화시킨 실시예 3의 키토산아제의 활성도는 16.7 U/g matrix이었으며, 이것은 활성도가 57.5% 증가된 것으로 본원발명 효소 전처리 단계에 의하여 활성도가 월등히 증가되었음을 확인할 수 있었다.
구분 활성도
(U/g matrix)
비교예 2 10.6
실시예 3 16.7
실험예 2 : 고정화 효소의 단백질량 측정
실리카겔에 고정화된 chitosanase의 단백질량은 고정화 전 효소용액(실시예 2 및 비교예 1)과 고정화 후 효소용액(실시예 3 및 비교예 2) 내의 단백질량 차이에 의해 측정하였고, 그 결과는 표 2에 나타내었다.
브래드포드 용액 3mL에 chitosanase 용액을 첨가하여 1분간 교반한 뒤, 10분간 실온에서 방치하여 발색반응을 안정화시킨 후 595nm에서 흡광도를 측정하였다.
구분 담체에 고정화된 단백질량
(mg/g matrix)
비교예 2 0.33
실시예 3 0.31
실험예 3 : 고정화 효소의 재사용
고정화 효소를 10회 재사용한 후 활성도를 측정하였고, 그 결과는 도 1 및 표 3에 나타내었다.
실험예 1과 같이 100mM sodium acetate buffer(pH 5.0) 5mL에 chitosan 1%(w/v)와 실시예 3 및 비교예 2에서 제조된 고정화된 chitosanase 0.1g을 첨가하여 37℃, 100 rpm에서 30분간 반응시켰고, 단일 반응이 끝난 후, 고정화된 chitosanase는 원심분리에 의해 수거되었다. 수거된 고정화 chitosanase는 100mM sodium acetate buffer(pH 5.0)로 수 차례 세척한 뒤, 다음 반응에 재사용되었다.
표 3에서 확인한 바와 같이, 고정화 효소를 10회 재사용하였을 경우, 키토산아제를 전처리하지 않고 고정화시킨 비교예 2의 초기 활성도는 10.3 U/g matrix이었고, 10회 재사용하였을 경우 활성도는 8.1 U/g matrix이었다. 반면 키토산으로 전처리를 수행한 뒤 고정화시킨 키토산아제의 초기 활성도는 16.2 U/g matrix이었고, 10회 재사용 후 활성도는 13.3 U/g matrix이었다.
따라서 본원발명 효소 전처리 단계에 의하면 고정화 효소의 초기 활성도를 향상시킬 뿐 아니라 연속 재사용에 의한 활성도의 감소가 현저히 둔화되었음을 확인할 수 있었다.
구분 초기 활성도
(U/g matrix)		 10회 재사용 후 활성도
(U/g matrix)
비교예 2 10.3 8.1
실시예 3 16.2 13.3

Claims (9)

  1. 담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계;
    상기 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조하는 단계;
    키토산 및 완충액으로 이루어진 용액에 키토사나제 및 키티나아제 중 어느 하나 이상의 것이 혼합된 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 상기 혼합용액을 전처리하는 단계; 및
    상기 활성화 담체를 상기 전처리된 혼합용액에 첨가하여 담체와 상기 키토사나제 또는 키티나아제의 흡착 또는 공유결합을 유도하는 단계;를 포함하는 담체에 효소를 고정화하는 방법.
  2. 키토산 및 완충액으로 이루어진 용액에 키토사나제 및 키티나아제 중 어느 하나 이상의 것이 혼합된 혼합용액을 35 내지 39℃에서 80 내지 120rpm의 속도로 교반하면서 20 내지 30분간 반응시켜 상기 혼합용액을 전처리하는 단계;
    담체에 아미노알킬실란 유도체를 반응시켜 담체의 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계;
    상기 아민기가 도입된 담체에 다관능성 가교제를 반응시켜 활성화 담체를 제조하는 단계; 및
    상기 활성화 담체를 상기 전처리된 혼합용액에 첨가하여 담체와 상기 키토사나제 또는 키티나아제의 흡착 또는 공유결합을 유도하는 단계;를 포함하는 담체에 효소를 고정화하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 담체는 실리카겔, 다공성 글라스, 제올라이트 또는 벤토나이트인 것을 특징으로 하는 담체에 효소를 고정화하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노알킬실란 유도체는 β-아미노에틸-γ-아미노프로필메틸디메톡시실란, 아미노프로필메틸디에톡시실란, γ-아미노프로필트리메톡시실란 및 γ-아미노프로필트리에톡시실란 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 담체에 효소를 고정화하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다관능성 가교제는 글루타르알데히드, 숙신산알데히드, 포름알데히드 및 덱스트린알데히드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 담체에 효소를 고정화하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼합용액은 키토산을 0.5 내지 2%(w/v)의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 담체에 효소를 고정화하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼합용액의 pH는 4 내지 6인 것을 특징으로 하는 담체에 효소를 고정화하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항 또는 제2항의 방법으로 제조된 고정화된 효소 복합체.
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