JP2873865B2 - 澱粉含有材料の酵素分解方法によるオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

澱粉含有材料の酵素分解方法によるオリゴ糖の製造方法

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【発明の詳細な説明】 <産業上の利用分野> 本発明は澱粉含有材料の酵素加水分解方法に関する。
<従来の技術> オリゴ糖は、従来より主に血清中のアミラーゼ活性測
定用の生化学試薬として利用され、また水溶性食物繊維
や腸内細菌の栄養素としての食品素材として知られてお
り、特にα−マルトペンタオースはその利用価値が高
い。従来のオリゴ糖の工業的生産方法は、澱粉含有材料
を澱粉加水分解酵素を用いて反応系が水系で加水分解す
る方法であった。
<発明が解決しようとする課題> しかし、従来の方法では反応系が水系での酵素加水分
解反応のため次のような欠点が見られた。
澱粉の加水分解速度が遅く、長い反応時間を要し、ま
た生成したオリゴ糖が低濃度でしか得られなかった。
生澱粉の直接加水分解が困難であるため、生澱粉を加
熱蒸煮して糊化した後に加水分解する必要があった。
加水分解反応後、水を濃縮するためオリゴ糖の単離に
時間を費やした。
反応系を滅菌する必要があった。
これらの欠点を解決する方法として、反応系が水−疎
水性有機溶剤の分散系で澱粉含有材料を酵素加水分解す
ることにより、オリゴ糖を製造する方法が考えられる。
ところが、前述の方法では酵素と有機溶媒が直接接触
するために、反応過程での酵素活性の低下が問題にな
る。すなわち、前述の方法では水系と比較して高濃度の
オリゴ糖の生産が可能であるが、反応を十分進行させる
ための酵素安定性に問題があった。
本発明は上記の点を解決するものであり、加水分解反
応が速く、短い反応時間でオリゴ糖、特にマルトペンタ
オースが高濃度で得られ、酵素活性の低下がなく、長時
間経過しても反応を十分進行させることができ、加熱蒸
煮等の前処理による澱粉の糊化を必要とせず、更に反応
系を滅菌する必要もなく、簡単に単離できるオリゴ糖の
製造方法を提供することを目的とするものである。
<課題を解決するための手段> 本発明は、水−疎水性有機溶剤系中において、固定化
した加水分解酵素による酵素反応で澱粉含有材料をオリ
ゴ糖に加水分解することを特徴とするオリゴ糖の製造方
法を提供するものである。
本発明は、反応系が水−疎水性有機溶剤の分散系であ
り、かつ固定化した加水分解酵素を用いることに特徴を
有するものである。
本発明において、オリゴ糖はグルコースが2個〜5個
α−1,4−グルコシド結合した多糖類とするが、本発明
においては、グルコースも得ることができる。
本発明において、疎水性有機溶剤としては、水と相溶
性のないものであれば、いずれも使用可能であるが具体
的には、n−ペンタン、2−メチルブタン、n−ヘキサ
ン、2−メチルペンタン、2,2−ジメチルブタン、2,3−
ジメチルブタン、ヘプタン、オクタン、2−メチルヘプ
タン、2,2,3−トリメチルヘプタン、2,2,4−トリメチル
ヘプタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン等の
鎖状飽和炭化水素系溶剤;シクロペンタン、メチルシク
ロブタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等の
環状飽和炭化水素系溶剤;ベンゼン、トルエン、o−キ
シレン、m−キシレン、p−キシレン、エチルベンゼ
ン、クメン等の芳香族炭化水素系溶剤;石油エーテル、
軽ベンジン、リグロイン等の石油留分として得られる溶
剤;ジクロルメタン、クロロホルム、四塩化炭素、1,2
−ジクロルエタン、1,1,2,2−テトラクロルエタン、ト
リクロルエチレン、クロルベンゼン、2,6−ジクロルベ
ンゼン等のハロゲン化炭化水素系溶剤等が使用できる
が、好ましくは、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オク
タン、2−メチルヘプタン、ドデカン等の鎖状飽和炭化
水素系溶剤である。
水−疎水性有機溶剤系における水の割合は、3〜50vo
l%が好ましく、3vol%以下になると酵素が失活しやす
く、50vol%を超えると得られる生成物の量が低下す
る。
澱粉加水分解酵素としては、アミラーゼ(amylase)
が好適なものとして挙げられ、アミラーゼとして例え
ば、アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)、
バチルス・チルクランス(Bacillus circulans)、バチ
ルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、アスペルギ
ルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)等由来のアミラ
ーゼ等があり、入手しやすく、かつ、安価なものが使用
できる。
また酵素の固定化の方法としては、不溶性の担体に共
有結合、イオン結合、疎水結合、生化学的特異結合等を
介して固定化する担体結合法、酵素分子間で架橋して固
定化する架橋法、タンパク質や多糖類のような天然高分
子や種々の合成高分子のゲルの中に生体触媒を閉じ込め
る格子型、および半透膜性の高分子被膜によって包み込
むマイクロカプセル型の包括法、および複合法がある
が、本発明では、素材の入手が容易であり、また固定化
が簡便かつ緩和な条件下で行なえるため、酵素活性を損
なうおそれが少ないことから、アルギン酸カルシウムゲ
ルによる格子型包括法が好ましく、例えば、アルギン酸
ナトリウム水溶液に酵素水溶液を加えて撹拌後、塩化カ
ルシウムのようなゲル化剤の水溶液に滴下して、アルギ
ン酸カルシウムのゲルビーズを調製し、凍結乾燥後、粉
砕して使用する。
固定化した澱粉加水分解酵素の使用量としては、酵素
含有量が水に対して0.1〜0.5wt%が好ましい。0.1wt%
未満では得られるオリゴ糖の量が少なく、0.5wt%を超
えると、加水分解反応に関与しない不要な酵素が増加す
る。
基質の澱粉材料としては、可溶性デンプン、コーンス
ターチ、ジャガイモ澱粉、小麦澱粉、ライ麦澱粉等の澱
粉が使用できるが、生澱粉は加熱蒸煮等の前処理を必要
とせずそのまま使用することが出来る。
澱粉含有材料の使用量としては、水に対して5〜30wt
%の割合で使用するのが好ましい。5wt%未満では得ら
れる生成物の量が少なく、30wt%を超えると目的とする
オリゴ糖の交換率が低下する。
酵素反応の至適温度は水系では50〜60℃の範囲である
が、本発明では、使用する疎水性有機溶剤の沸点以下の
広い範囲で反応が進み、好ましくは40〜60℃の範囲であ
る。水の使用割合が少ないと0℃以下でも水は凍ること
がないため、例えば、−10℃でも反応を進めることが可
能である。これは、疎水性溶媒中にある水が不凍水状態
で系内に存在するためと考えられる。
本発明の酵素反応に都合のよいpHは、4.0〜8.0である
が使用する酵素の至適pHに応じて適宜選択できる。この
pH値の範囲にするには、緩衝溶液が使用される。
反応は、例えば、疎水性有機溶剤中に撹拌しながら澱
粉含有材料を分散し、次いで所定のpH値の緩衝溶液と固
定化したアミラーゼを前記の有機溶剤中に添加して所定
の温度にて撹拌しながら分散させることにより行われ
る。
反応後、撹拌を止めると自動的に有機層と水層とが相
分離するので、その水層を濃縮することにより生成物を
含有する濃厚液を得る。
従来、このような処理は雑菌の侵入を排除するために
密閉系で行わねばならなかったが、本発明では疎水性有
機溶剤を用いるため反応系の滅菌の必要がなくなり、反
応系が系外の菌から遮断され雑菌による汚水が防止され
る。また有機溶剤を使用するため水系よりも使用する水
量が減少し、後処理時の水の濃縮が簡単となる。
また、加水分解酵素を固定化すると、酵素は固定化担
体全体に均一に分布し、主に、担体表面の酵素が澱粉に
作用して反応が進行する。この固定化担体は親水性であ
るため、有機溶剤は担体内部に侵入せず、担体表面で酵
素と接触するため、担体表面の酵素は失活しやすい。と
ころが、固定化担体であるアルギン酸カルシウムゲルの
網目構造が有機溶剤によってゆるみ、担体内部の酵素が
徐々に担体表面に漏出するため、結果的に酵素が長時間
作用できるので反応を十分に進行させることができ、高
いオリゴ糖の変換率を得ることができる。
なお、有機溶剤臭を除くために分離された水層を活性
炭や活性白土等の吸着処理剤による脱臭処理を施しても
良い。生成した反応混合物から未反応物を除くには、例
えば、液体クロマトグラフィー、カーボンセライトクロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーの技術を
利用して単離することが出来る。
<実施例> 次に本発明を実施例、比較例を挙げて説明する。
実施例1 (酵素の固定化) アルギン酸ナトリウム(関東化学製)3%w/v水溶液
とバチルス・ズブチリス(Bacillus Subtilis)由来の
α−アミラーゼ(和光純薬工業製)の1.5%(w/v)とを
撹拌しながら加え、アルギン酸ナトリウムの濃度が最終
的に2%w/vとなるように調製した。この溶液を針付の
注射器に吸入し、塩化カルシウムの2%w/v水溶液中に
撹拌しながら室温で静かに滴下した。滴下終了後、約1
時間室温でゆるやかに撹拌し、その後、4℃の恒温槽中
で一昼夜保持した。得られたゲルビーズを濾過し、凍結
乾燥機にて完全に乾燥させた後、乳針でパウダー状に粉
砕して粉末の固定化酵素を得た。
300ml三角フラスコにドデカン90mlと可溶性デンプン
(和光純薬工業製 以下基質と記す)2gを加えて撹拌し
ながら分散させた。リン酸緩衝溶液(pH6.0,イオン強度
50mM)10mlと上記固定化酵素0.04gを上記三角フラスコ
に添加して40℃で撹拌速度600rpmで所定時間撹拌しなが
ら酵素反応を行なった。
生成したオリゴ糖の生成濃度(g/dl)および変換率の
経時変化を調査した。なお、オリゴ糖の生成濃度にはグ
ルコースの生成濃度も含まれるものとし、また、高速液
体クロマトグラフィー(カラム;Asahipak GS−220H×2
本,カラム温度;60℃)で定量した。その結果を第1表
に示す。
比較例1 300ml三角フラスコに、実施例1のリン酸緩衝溶液100
mlと基質20gを加えて撹拌しながら分散させた。上記三
角フラスコに、実施例1の固定化酵素0.4gを添加して40
℃で撹拌速度600rpmで所定時間撹拌しながら酵素反応を
行なった。
実施例1と同様に生成したオリゴ糖の生成濃度(g/d
l)および変換率の経時変化を調査した。なお、オリゴ
糖生成濃度にはグルコースも含まれるものとする。その
結果を第1図に示す。
比較例2 実施例1において、固定化酵素のかわりにα−アミラ
ーゼ0.125mgを使用する以外は実施例1と同様に酵素反
応を行なった。
実施例1と同様に生成したオリゴ糖の生成濃度(g/d
l)および変換率の経時変化を調査した。なお、オリゴ
糖生成濃度にはグルコースも含まれるものとする。その
結果を第1図に示す。
第1図より、実施例1のオリゴ糖の生成濃度は比較例
1、2と比べて非常に高く、かつ長時間経過しても反応
は十分に進行し、高い変換率を得ることができる。
実施例2 実施例1において、5%w/vのα−アミラーゼ水溶液
を使用する以外は実施例1と同様にして粉末の固定化酵
素を得た。
300mlの三角フラスコに各々ドデカン90ml,80ml,50ml
と実施例1のリン酸緩衝溶液10ml,20ml,50ml,100mlを加
えて溶剤量が100mlとなるようにし、水に対するバレイ
ショ澱粉の濃度が10%w/vとなるように、各々1g,2g,5g,
10gを加えて撹拌しながら分散させた。さらに上記三角
フラスコに上記粉末の固定化酵素を各々0.33g,0.66g,1.
66g,3.33gを添加して、40℃で撹拌速度600rpmで撹拌し
ながら酵素反応を行なった。各水含有量におけるG5(マ
ルトペンタオース)の変換率の経時変化を実施例1と同
様にして調査した。その結果を第2図に示す。
また、117時間後のG2(マルトース)、G3(マルトト
リオース)およびG5(マルトペンタオース)の変換率と
水含有量の関係を実施例1と同様にして調査した。その
結果を第3図に示す。
第2図において、水含有量が10%、20%および50%の
場合には、G5自身は分解されず、長時間経過しても反応
が進行しており、高いG5の変換率を得ることができた
が、水含有量が100%の場合には、43時間後にはG5は完
全に加水分解されてG2やG3の変換率が増加していた。
<発明の効果> 以上の説明で明らかなように、本発明のオリゴ糖の製
造方法によれば、加水分解の反応速度が速く、かつ固定
化により酵素活性の安定性を保持することができ、長時
間経過しても十分に反応を進行させることができるの
で、オリゴ糖、特にマルトペンタオースを高収率で得る
ことができる。また、固定化により酵素を連続的、ある
いは繰り返し使用できる。また、反応系の反応操作が簡
単となり、また前処理することなしに澱粉含有材料を直
接反応させることができる。さらに、有機溶剤を用いる
ため、反応系の滅菌の必要がなくなり、反応系が菌から
遮断され、殺菌による汚染が防止される。従って、本発
明はオリゴ糖を従来法よりも工業的に簡単に高収率で得
られるため、大量生産が可能となり、生化学試薬のみな
らず機能性食品としての用途が広がることが期待され
る。
【図面の簡単な説明】
第1図は実施例および比較例1,2の酵素反応におけるオ
リゴ糖の生成濃度および変換率の経時変化を示すグラ
フ、第2図は実施例2の水含有量のG5の変換率の経時変
化を示すグラフ、第3図はG2,G3およびG5の変換率と水
含有量の関係を示すグラフである。

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】水−疎水性有機溶剤系中において、固定化
    した加水分解酵素による酵素反応で澱粉含有材料をオリ
    ゴ糖に加水分解することを特徴とするオリゴ糖の製造方
    法。
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CN111841504A (zh) * 2020-07-21 2020-10-30 上海交通大学 一种利用微生物代谢的生物除味剂及其制备方法

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