JPH0466094A - 澱粉含有材料の酵素分解方法によるオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は澱粉含有材料の酵素加水分解方法に関する。

〈従来の技術〉 オリゴ糖は、従来より主に血清中のアミラーゼ活性測定
用の生化学試薬として利用され、また水溶性食物繊維や
腸内細菌の栄養素としての食品素材として知られており
、特にα−マルトペンタオースはその利用価値が高い。

従来のオリゴ糖の工業的生産方法は、澱粉含有材料を澱
粉加水分解酵素を用いて反応系が水系で加水分解する方
法であった。

〈発明が解決しようとする課題〉 しかし、従来の方法では反応系が水系での酵素加水分解
反応のため次のような欠点が見られた。

■澱粉の加水分解速度が遅（、長い反応時間を要し、ま
た生成したオリゴ糖が低濃度でしか得られなかった。

■生澱粉の直接加水分解が困難であるため、生澱粉を加
熱蒸煮して糊化した後に加水分解する必要があった。

■加水分解反応後、水を濃縮するためオリゴ糖の単離に
時間を費やした。

■反応系を滅菌する必要があった。

これらの欠点を解決する方法として、反応系が水−疎水
性有機溶剤の分散系で澱粉含有材料を酵素加水分解する
ことにより、オリゴ糖を製造する方法が考えられる。

ところが、前述の方法では酵素と有機溶媒が直接接触す
るために、反応過程での酵素活性の低下が問題になる。

すなわち、前述の方法では水系と比較して高濃度のオリ
ゴ糖の生産が可能であるが、反応を十分進行させるため
の酵素安定性に問題があった。

本発明は上記の点を解決するものであり、加水分解反応
が速く、短い反応時間でオリゴ糖、特にマルトペンタオ
ースが高濃度で得られ、酵素活性の低下がなく、長時間
経過しても反応を十分進行させることができ、加熱蒸煮
等の前処理による澱粉の糊化な必要とせず、更に反応系
を滅菌する必要もな（、簡単に単離できるオリゴ糖の製
造方法を提供することを目的とするものである。

く課題を解決するための手段〉 本発明は、水−疎水性有機溶剤系中において、固定化し
た加水分解酵素による酵素反応で澱粉含有材料なオリゴ
糖に加水分解することを特徴とするオリゴ糖の製造方法
を提供するものである。

本発明は、反応系が水−疎水性有機溶剤の分散系であり
、かつ固定化した加水分解酵素を用いることに特徴を有
するものである。

本発明において、オリゴ糖はグルコースが２個〜５個α
−１，４−グルコシド結合した多糖類とするが、本発明
においては、グルコースも得ることができる。

本発明において、疎水性有機溶剤としては、水と相溶性
のないものであれば、いずれも使用可能であるが具体的
には、ｎ−ペンタン、２−メチルブタン、ｎ−ヘキサン
、２−メチルペンタン、２゜２−ジメチルブタン、２，
３−ジメチルブタン、ヘプタン、オクタン、２−メチル
へブタン、２．２．３−トリメチルへブタン、２．２．
４−トリメチルへブタン、ノナン、デカン、ウンデカン
、ドデカン等の鎖状飽和炭化水素系溶剤；シクロペンタ
ン、メチルシクロブタン、シクロヘキサン、メチルシク
ロヘキサン等の環状飽和炭化水素系溶剤；ベンゼン、ト
ルエン、０−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、
エチルベンゼン、クメン等の芳香族炭化水素系溶剤；石
油エーテル、軽ベンジン、リグロイン等の石油留分とし
て得られる溶剤ニジクロルメタン、クロロホルム、四塩
化炭素、１．２−ジクロルエタン、１，１，２．２−テ
トラクロルエタン、トリクロルエチレン、クロルベンゼ
ン、２．６−ジクロルベンゼン等のハロゲン化炭化水素
系溶剤等が使用できるが、好ましくは、ペンタン、ヘキ
サン、ヘプタン、オクタン、２−メチルへブタン、ドデ
カン等の鎖状飽和炭化水素系溶剤である。

水−疎水性有機溶剤系における水の割合は、３〜５０ｖ
ｏ１％が好ましく、３ｖｏ１％以下になると酵素が失活
しやすく、５０ｖｏ１％を超えると得られる生成物の量
が低下する。

澱粉加水分解酵素としては、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓ
ｅ）が好適なものとして挙げられ、アミラーゼとして例
えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｎｉｇｅｒ）　、バチルス・チルフランス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ズブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、アス
ペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒ
ｙｚａｅ）等由来のアミラーゼ等があり、入手しやすく
、かつ、安価なものが使用できる。

また酵素の固定化の方法としては、不溶性の担体に共有
結合、イオン結合、疎水結合、生化学的特異結合等を介
して固定化する担体結合法、酵素分子間で架橋して固定
化する架橋法、タンパク質や多糖類のような天然高分子
や種々の合成高分子のゲルの中に生体触媒を閉じ込める
格子型、および半透膜性の高分子被膜によって包み込む
マイクロカプセル型の包括法、および複合法があるが、
本発明では、素材の入手が容易であり、また固定化が簡
便かつ緩和な条件下で行なえるため、酵素活性を損なう
おそれが少ないことから、アルギン酸カルシウムゲルに
よる格子型包括法が好ましく、例えば、アルギン酸ナト
リウム水溶液に酵素水溶液を加えて撹拌後、塩化カルシ
ウムのようなゲル化剤の水溶液に滴下して、アルギン酸
カルシウムのゲルビーズを調製し、凍結乾燥後、粉砕し
て使用する。

固定化した澱粉加水分解酵素の使用量としては、酵素含
有量が水に対して０．１−０．５ｗｔ％が好ましい、　
０．１ｗｔ％未満では得られるオリゴ糖の量が少な（，
０，，５ｗｔ％を超えると、加水分解反応に関与しない
不要な酵素が増加する。

基質の澱粉材料としては、可溶性デンプン、コーンスタ
ーチ、ジャガイモ澱粉、小麦澱粉、ライ麦澱粉等の澱粉
が使用できるが、生澱粉は加熱蒸煮等の前処理を必要と
せずそのまま使用することが出来る。

澱粉含有材料の使用量としては、水に対して５〜３０ｗ
ｔ％の割合で使用するのが好ましい。５ｗｔ％未満では
得られる生成物の量が少なく、３０ｗｔ％を超えると目
的とするオリゴ糖の交換率が低下する。

酵素反応の至適温度は水系では５０〜６０℃の範囲であ
るが、本発明では、使用する疎水性有機溶剤の沸点以下
の広い範囲で反応が進み、好ましくは４０〜６０℃の範
囲である。水の使用割合が少ないと０℃以下でも水は凍
ることがないため、例えば、−１０℃でも反応を進める
ことが可能である。これは、疎水性溶媒中にある水が不
凍水状態で系内に存在するためと考えられる。

本発明の酵素反応に都合のよいｐＨは、４，０〜８．０
であるが使用する酵素の至適ｐＨに応じて適宜選択でき
る。このｐＨ値の範囲にするには、緩衝溶液が使用され
る。

反応は、例えば、疎水性有機溶剤中に撹拌しながら澱粉
含有材料を分散し、次いで所定のｐＨ値の緩衝溶液と固
定化したアミラーゼを前記の有機溶剤中に添加して所定
の温度にて撹拌しながら分散させることにより行われる
。

反応後、撹拌を止めると自動的に有機層と水層とが相分
離するので、その水層を濃縮することにより生成物を含
有する濃厚液を得る。

従来、このような処理は雑菌の侵入を排除するために密
閉系で行わねばならなかったが、本発明では疎水性有機
溶剤を用いるため反応系の滅菌の必要がなくなり、反応
系が系外の菌から遮断され雑菌による汚染が防止される
。また有機溶剤を使用するため水系よりも使用する水量
が減少し。

後処理時の水の濃縮が簡単となる。

また、加水分解酵素を固定化すると、酵素は固定化担体
全体に均一に分布し、主に、担体表面の酵素が澱粉に作
用して反応が進行する。この固定化担体は親水性である
ため、有機溶剤は担体内部に侵入せず、担体前面で酵素
と接触する・ため、担体表面の酵素は失活しやすい。と
ころが、固定化担体であるアルギン酸カルシウムゲルの
網目構造が有機溶剤によってゆるみ、担体内部の酵素が
徐々に担体表面に漏出するため、結果的に酵素が長時間
作用できるので反応を十分に進行させることができ、高
いオリゴ糖の変換率を得ることができる。

なお、有機溶剤臭を除（ために分離された水層な活性炭
や活性白土等の吸着処理剤による脱臭処理を施しても良
い、生成した反応混合物から未反応物を除くには、例え
ば、液体クロマトグラフィー、カーボンセライトクロマ
トグラフィーゲル濾過クロマトグラフィーの技術を利用
して単離することが出来る。

〈実施例〉 次に本発明を実施例、比較例を挙げて説明する。

実施例１ （酵素の固定化） アルギン酸ナトリウム（関東化学製）３％ｗ／ｖ水溶液
とバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉ１ｉｓ　）由来のα−アミラーゼ（和光紬薬工業製）
の１．５％（ｗ／ｖ）とを撹拌しながら加え、アルギン
酸ナトリウムの濃度が最終的に２％ｗ／ｖとなるように
調製した。この溶液を釘付の注射器に吸入し、塩化カル
シウムの２％ｗ／ｖ水溶液中に撹拌しながら室温で静か
に滴下した。滴下終了後、約１時間室温でゆるやかに撹
拌し、その後、４℃の恒温槽中で一昼夜保持した。得ら
れたゲルビーズを濾過し、凍結乾燥機にて完全に乾燥さ
せた後、乳針でパウダー状に粉砕して粉末の固定化酵素
を得た。

３００ａ＋１三角フラスコにドデカン９０ｍ１と可溶性
デンプン（和光紬薬工業製　以下基質と記す）２ｇを加
えて撹拌しながら分散させた。リン酸緩衝溶液（ｐＨ６
，０，イオン強度５０ｍＭ　）　１０ｍ１と上記固定化
酵素０．０４ｇを上記三角フラスコに添加して４０℃で
撹拌速度６００ｒｐｍで所定時間撹拌しながら酵素反応
を行なった。

生成したオリゴ糖の生成濃度（ｇ／ｄｉ）および変換率
の経時変化を調査した。なお、オリゴ糖の生成濃度には
グルコースの生成濃度も含まれるものとし、また、高速
液体クロマトグラフィー（カラム；　Ａｓａｈｉｐａｋ
　Ｇ５−２２０ＨＸ　２本、カラゝム温度；６０℃）で
定量した。その結果を第１表に示す。

比較例１ ３００ｍｌ三角フラスコに、実施例１のリン酸緩衝溶液
１００ｍ１と基質２０ｇを加えて撹拌しながら分散させ
た。上記三角フラスコに、実施例１の固定化酵素０．４
ｇを添加して４０℃で撹拌速度６００ｒｐｍで所定時間
撹拌しながら酵素反応を行なった。

実施例１と同様に生成したオリゴ糖の生成濃度（ｇ／ｄ
ｉ）および変換率の経時変化を調査した。なお、オリゴ
糖生成濃度にはグルコースも含まれるものとする。その
結果を第１図に示す。

比較例２ 実施例１において、固定化酵素のかわりにα−アミラー
ゼ０．１２５ｍｇを使用する以外は実施例１と同様に酵
素反応を行なった。

実施例１と同様に生成したオリゴ糖の生成濃度（ｇ／ｄ
ｉ）および変換率の経時変化を調査した。なお、オリゴ
糖生成濃度にはグルコースも含まれるものとする。その
結果を第１図に示す。

第１図より、実施例１のオリゴ糖の生成濃度は比較例１
．２と比べて非常に高く、かつ長時間経過しても反応は
十分に進行し、高い変換率を得ることができる。

実施例２ 実施例１において、５％Ｗ／Ｖのα−アミ−ラーゼ水溶
液を使用する以外は実施例１と同様にして粉末の固定化
酵素を得た。

３００ｍ１の三角フラスコに各々ドデカン９０ｍ１゜８
０ａ＋１．５０ｍ１と実施例１のリン酸緩衝溶液１０ｍ
１゜２０ｍ１．５０ｍ１．１００ｍ１を加えて溶剤量が
ｌｏＯｍｌとなるようにし、水に対するバレイショ澱粉
の濃度が１０％ｗ／ｖとなるように、各々１　ｇ、　２
　ｇ、　５　ｇ、　１０ｇを加えて撹拌しながら分散さ
せた。さらに上記三角フラスコに上記粉末の固定化酵素
を各々０．３３ｇ。

０、６６ｇ、　１．６６ｇ、　３．３３ｇを添加して、
４０’Ｃで撹拌速度６００ｒｐｍで撹拌しながら酵素反
応を行なった。各水含有量におけるＧ、（マルトペンタ
オース）の変換率の経時変化を実施例１と同様にして調
査した。その結果を第２図に示す。

また、１１７時間後のＧｉ（マルトース）、Ｇ３（マル
トトリオース）およびＧ、（マルトペンタオース）の変
換率と水含有量の関係を実施例１と同様にして調査した
。その結果を第３図に示す。

第２図において、水含有量が１０％、２０％および５０
％の場合には、Ｇ５自身は分解されず、″長時間経過し
ても反応が進行しており、高いＧ５の変換率を得ること
ができたが、水含有量が１００％の場合には、４３時間
後にはＧ、は完全に加水分解されてＧ！やＧ、の変換率
が増加していた。

〈発明の効果〉 以上の説明で明らかなように、本発明のオリゴ糖の製造
方法によれば、加水分解の反応速度が速く、かつ固定化
により酵素活性の安定性を保持することができ、長時間
経過しても十分に反応を進行させることができるので、
オリゴ糖、特にマルトペンタオースを高収率で得ること
ができる。・また、固定化により酵素を連続的、あるい
は繰り返し使用できる。また、反応後の反応操作が簡単
となり、また前処理することなしに澱粉含有材料を直接
反応させることができる。さらに、有機溶剤を用いるた
め、反応系の滅菌の必要がなくなり、反応系が菌から遮
断され、殺菌による汚染が防止される。従って、本発明
はオリゴ糖を従来法よりも工業的に簡単に高収率で得ら
れるため、大量生産が可能となり、生化学試薬のみなら
ず機能性食品としての用途が広がることが期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例および比較例１．２の酵素反応における
オリゴ糖の生成濃度および変換率の経時変化を示すグラ
フ、第２図は実施例２の水含有量のＧｓの変換率の経時
変化を示すグラフ、第３図はＧｉ、ＧｓおよびＧ、の変
換率と水含有量の関係を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 水−疎水性有機溶剤系中において、固定化した加水分解
   酵素による酵素反応で澱粉含有材料をオリゴ糖に加水分
   解することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。