JP2011205933A - 高濃度糖化液の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】反応溶媒中に疎水性の炭化水素系溶媒、エーテル、エステル類、石油留分など有機溶媒を存在させ、セルロース系のバイオマス等にセルラーゼ、アミラーゼ等の酵素又はそれらの固定化酵素を作用させて多糖類をより低分子の糖類に加水分解し、燃料やマテリアルの製造・開発等に適した高濃度糖化液を製造する方法。
【選択図】図1
Description
まず、1.木材や草などの原材料を粉砕・加圧・加熱処理等を行った後、セルロースやヘミセルロースと言った多糖類を取り出す。次に、2.多糖類を酸や酵素などの触媒により加水分解すなわち糖化して、グルコースなどの単糖類を回収する。3.得られた単糖類は、酵母などの微生物の発酵によりエタノールに変換する。さらに、4.エタノールと共存する多量の水を除去するために、蒸留や脱水を行う。
また、ポリ乳酸などのマテリアルをバイオマスから生産する場合も、同様の工程を経て、得られたグルコースなどの単糖類を用いる。
斯かる状況に鑑み、本発明は工業的に安価かつ容易にバイオマスを酵素により糖化し、共存する水割合が少ない高濃度の糖化液を取得する方法を提供することを課題とする。
疎水性の有機溶媒が存在する反応溶媒中に、バイオマス及び酵素を添加して攪拌することにより、前記バイオマス中の多糖類をより低分子の糖類に加水分解する分解ステップと、
必要により前記分解ステップの最終段階で前記反応溶媒中に水系溶媒を添加して、前記分解されたより低分子の糖類を水系溶媒に抽出する抽出ステップと、
前記水系溶媒に抽出された糖類を糖化液として回収する回収ステップと、
を含むことを特徴とする糖化液を製造する製造方法である。
本発明における「水系溶媒」とは、水のみ、及び水を含む緩衝液等を含むが、水を含んでいればよい。
有機溶媒の種類、バイオマスの種類、バイオマスの粒径、有機溶媒と水系溶媒との配合比、反応溶媒とバイオマスとの混合比等の要因によってはバイオマスと反応溶媒との混合物がペースト状(高粘度流体)となる場合があり、このペースト状態ではバイオマスに対する酵素の接触頻度が低下して充分な加水分解速度を得難い(図1a)。
従って、これらの要因を適宜調整して、バイオマスを反応溶媒において分散させ、反応溶媒中の酵素がバイオマスに対して自由に接触できるようにする。
ここに、「前記水系溶媒は35容量%以下」とは、前記水系溶媒を含まない場合を含む。
この範囲を超えて水系溶媒を加えることも勿論可能であるが、アルコール回収時の蒸留量を考慮すると35容量%以下が適当と考えられる。なお、この範囲を大きく超えて水系溶媒を配合量すると、バイオマスと反応溶媒との混合物はペースト状になる可能性が高い。
[5]前記酵素は固定化酵素であることを特徴とする[1]〜[4]のいずれかに記載の方法である。
従来、バイオマスの糖化反応には加水するための水を分散溶媒として用いたが、本発明による方法では試料の水分、もしくは反応に最低限必要とされる水分を分散用の疎水性の有機溶媒に投入することにより行うことができる。酵素糖化反応時の水分量が糖類の抽出・回収に十分な量含まれている場合、抽出・回収時に水系溶媒の添加は必要でなくなる。なお、投入する水系溶媒の量は抽出用も含め、最大で前記反応溶媒の35容量%までが好ましく、1容量%以上〜30容量%以下がより好ましく、15容量%以上〜25容量%以下では、水系溶媒単独よりも酵素活性が顕著に高められるので、特に好ましい。水系溶媒―前記有機溶媒(前記反応溶媒)の100容量部に対して試料約5〜10重量部となることが好ましい。
鎖状飽和炭化水素系溶媒: n−ペンタン、2−メチルブタン、n−ヘキサン、へプタン、オクタンなど
環状飽和炭化水素系溶媒: シクロペンタン、シクロヘキサンなど
芳香族系炭化水素系溶媒: ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼンなど
その他(ハロゲン化炭化水素系溶剤、エーテル、エステル類、石油留分など) : クロロホルム、四塩化炭素、酢酸エチル、酢酸メチルなど
が用いられるが、酢酸メチルやトルエンなど水と完全に2層分離する溶媒が望ましい。
中でも、セルラーゼとしては、エンドグルカナーゼ EC3.2.1.4、エキソグルカナーゼ(セロビオヒドロラーゼ) EC 3.2.1.91及びβ-グルコシダーゼEC3.2.1.21の混合が望ましい。アミラーゼとしては、α-アミラーゼ EC 3.2.1.1、β-アミラーゼEC 3.2.1.2、グルコアミラーゼEC 3.2.1.3の混合が望ましい。
1.試料及び試薬
セルロース系バイオマス試料には結晶性セルロースのセオラスTG(旭化成(株))、トマトの葉茎の廃材及びスギを用いた。なお、トマトの葉茎及びスギは、乾式粉砕後に篩い分けを行い、45?mから90??mの分画サイズを用いた。セルロース糖化用酵素には、セルラーゼA「アマノ」3、セルラーゼT「アマノ」4、及びヘミセルラーゼ「アマノ」90 (全て、天野エンザイム(株)製)を同量混合して用いた。
試料の水分測定は105℃の乾燥機を用いて行った。105℃で恒量になるまで乾燥した試料の重量を用い、以下の式により試料の水分を算出した。
試料の水分(重量%)=(乾燥前の試料の重量(g) ― 105℃で乾燥した試料の重量(g))/(乾燥前の試料の重量(g))×100%
疎水性の有機溶媒の入ったガラス製容器に試料及び酵素を投入し、50℃の環境下において180rpmで3日間振とう・反応させた。なお、酵素量は試料1gあたり各20mg、前記有機溶媒は試料0.5gあたり10mLとした。反応時に水を投入する場合は、pH 5.0のMacIlvain緩衝液を用い、投入した前記緩衝液と同量の有機溶媒を除いて、溶液量を10mL に統一して試験に供した。
反応の最終段階でガラス容器にイオン交換水を投入し、密栓後1分間強く攪拌し低分子の糖類を水に抽出させた。抽出に使用した水の量は試料0.5gに対し2mLとした。なお、反応時に水を投入した系では、抽出用の水量を減らし、反応時の水と抽出用の水が併せて試料0.5gに対し2mL となるように統一した。
(D)成分分析
グルコースの定量分析は、グルコースCIIテストワコー(和光純薬(株)製)を用いて行った。全糖の分析はフェノール硫酸法を用いた。
1−1.スギ混濁液の粘度
密閉容器中のスギにMacIlvain緩衝液又はトルエンを投入したところ、前者は後者に比べ粘度が大きく上昇した。スギ2gに対し前記緩衝液9mLを加えた状態を図1aに示し、同じくトルエン9mLを加えた状態を図1bに示す。各々の粘度をB型粘度計で測定したところ、前記緩衝液を用いた試験区では2,400から3,000cP、トルエンを用いた試験区では625から750cPであった。
pH 5.0のMacIlvain緩衝液、酢酸メチル、n−ヘキサン、クロロホルム、及びトルエン中でスギ(0.5g)を酵素糖化反応させた。また、容積比で緩衝液:有機溶媒=1:9の溶液中でも同様の試験を行った。用いたスギの水分は12.1重量%であった。3日間の酵素糖化により生成した全糖のうち、抽出した水及び未抽出で使用した有機溶媒中に残った糖の割合、すなわち、各種有機溶媒中で糖化した後の水抽出全糖及び有機溶媒残存全糖の割合を表1に示す。全ての系において、90%以上の糖が水に抽出された。反応溶媒に緩衝液:有機溶媒=1:9の混合液を用いた場合、水中に回収される糖の量が多くなった。
1 pH 5.0のMacIlvain緩衝液のみ、
2 酢酸エチルのみ、
3 n−ヘキサンのみ、
4 クロロホルムのみ、
5 トルエンのみ、
6 前記緩衝液:酢酸エチル=1:9(容積比)の混合液、
7 前記緩衝液:n−ヘキサン=1:9(容積比)の混合液、
8 前記緩衝液:クロロホルム=1:9(容積比)の混合液、
9 前記緩衝液:トルエン=1:9(容積比)の混合液である(以下、図3〜5も同様)。
上記スギの試験と同様の試験方法で、トマトの葉茎(0.5g)を酵素糖化した。使用したトマトの葉茎に含まれる水分は8.7重量%であった。3日間反応後に抽出した水の全糖濃度を図4に示す。なお、有機溶媒を使用せずpH 5.0のMacIlvain緩衝液のみの試験区(1)は、反応後に水を加えることなく緩衝液の糖濃度を測定した。スギの場合と同様に、前記緩衝液中の糖化に比べ、有機溶媒中で糖化反応して水で抽出した試験区は、全て高い濃度の糖液が回収された。中でも、水:有機溶媒=1:9の溶液中で反応させた回収液の糖液濃度は高く、n−ヘキサン、クロロホルム、及びトルエンを用いた場合、MacIlvain緩衝液のみの試験区(1)の3.4mg/mLに比べ約6倍の20mg/mL以上になった。
60℃の恒温器中でセオラスTGを58時間減圧乾燥し、水分値を4.11重量%とした。乾燥後のセオラスTG(0.5g)をMacIlvain緩衝液とトルエンの比率を変えた様々な水分割合の溶液中で酵素糖化した。上記スギの試験と同様の試験方法で、3日間反応後に抽出した水中の全糖濃度を図6に、分解率を図7に示す。図6及び7中、
1 pH 5.0のMacIlvain緩衝液のみ、
2 トルエンのみ、
3 前記緩衝液:トルエン=0.4:9.6の混合液、
4 前記緩衝液:トルエン=0.6:9.4の混合液、
5 前記緩衝液:トルエン=0.8:9.2の混合液、
6 前記緩衝液:トルエン=1.0:9.0の混合液、
7 前記緩衝液:トルエン=1.5:8.5の混合液、
8 前記緩衝液:トルエン=2.0:8.0の混合液、
9 前記緩衝液:トルエン=2.2:7.8の混合液、
10 前記緩衝液:トルエン=2.5:7.5の混合液、
11 前記緩衝液:トルエン=3.0:7.0の混合液
であり、前記混合液は全て容積比で表す(以下、図8及び9も同様)。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (5)
- バイオマスから酵素を用いて糖化液を製造する方法であって、
疎水性の有機溶媒が存在する反応溶媒中に、バイオマス及び酵素を添加して攪拌することにより、前記バイオマス中の多糖類をより低分子の糖類に加水分解する分解ステップと、
必要により前記分解ステップの最終段階で前記反応溶媒中に水系溶媒を添加して、前記分解されたより低分子の糖類を水系溶媒に抽出する抽出ステップと、
前記水系溶媒に抽出された糖類を糖化液として回収する回収ステップと、
を含むことを特徴とする、糖化液を製造する製造方法。 - 前記分解ステップにおいて、前記反応溶媒は前記有機溶剤と水系溶媒との混合液であり、該混合液中に前記バイオマスは分散されていることを特徴とする請求項1に記載の糖化液の製造方法。
- 前記反応溶媒において前記水系溶媒は35容量%以下であることを特徴とする請求項2に記載の糖化液の製造方法。
- 前記分解ステップにおいて、反応開始時は前記反応溶媒として前記有機溶媒を用い、反応の途中で水系溶媒を添加することを特徴とする請求項1に記載の糖化液の製造方法。
- 前記酵素は固定化酵素である請求項1乃至4のいずれか一項に記載の糖化液の製造方法。
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