JPS5974984A - 固定化酵素もしくは固定化微生物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はｆ４ｉ１定化酢累もしく１：【固定化微生物の
製造方法に関する。更に詳しくはアルギン酸ナトリウム
の水浴液にＩ巽素もしくは微生物および水溶性の多カチ
］ン性高分子化合物を添加混合したのちカルシウムイオ
ン、：Ｉｌ）るいｉ１アルミニウムイオンを含有する水
溶液と接触、ゲル化させるか、或いはこうして得られた
固定化酵素もしくは固定化微生物を更に多′１能性の架
橋剤と反応させて表面処理することを特徴とする固定化
酵素もしくは固定化微生物の製造方法に関する。

近年、生体反応の触媒である酵素を食品や医薬あるいは
化学製品などの製造プロセスでの触媒として利用する目
的で酵素を不溶化して、固定化酵素とする研究はますま
す盛んとなり、工業的に重要な技術として注目されてい
るっ酵素活性を有する微生物菌体においても同様に固定
化微生物閑体として活用する方法や、更には微生物を生
き１こまま固定化し固定化増殖微生物としてオリ用する
技術も開発されつつある。

１６１定化酵素もしくは同定化微生物の製造方法として
はすでに多くの方法が報告されているか製造方法がｈ１
１単で、種々のｒ）Ｙ素もしくは微生物の固定化に適用
できる方法としで、アルギン酸あるいはカラキーナンな
どの多糖類のゲルによる固定化方法が知られている。し
かしながら、これらの多糖類による固定化では、アルカ
リ金属やアルカリ土類金属などのゲル化剤が必要であり
、また、これらのゲル化剤によるゲル化が可逆的である
ｊコめに、固定化後、固定化酵素や固定化微生物をゲル
化剤を含まない液や、脱ゲル化剤を含む液などと接触さ
せるとゲルが溶解し、固定化酵素もしくは固定化微生物
が破壊してしまうという重大な問題があったつ アルギン酸ナトリウムを用いる酵素もしくは微生物の固
定化方法は既に公知である（エフ。

ワーグナー、「ユーロビア　ジャナル　オブアプライド
　マイクロバイオロジーＪ　１巻２９１頁、１９７５年
）。この方法においてはゲル化剤としてはカルシウムイ
オンやアルミニウムイオンが使用されているが、得られ
た固定化酵素もしくは固定化微生物を用いて反応を行な
う場合、反応液中にこれらのゲル化剤をかなりの濃度で
存在させる必要があり、又リン酸イオンのような、ゲル
化剤であるカルシウムイオンと反応する脱ゲル化剤が存
在すると、同定化酵素もしくは固定化微生物が溶解して
しまう欠点かあった。固定化酵素もしくは固定化微生物
による反応時にカルシウムイオンあるいはアルミニウム
イオンを反応液中にかなりの濃度で共存させることは、
酵素もしくは微生物の活性に不都合な影響を力える場合
があるばかりでなく、反応生成物の分離、精製において
も重大な問題となる。・・ 我々はこのようなアルギン酸ゲルによる固定化酵素もし
くは固定化微生物の欠点を克服すべき方法について鋭意
検討を重ねた結果、アルギン酸ナトリウムの水溶液に酵
素もしくは微生物および水溶性の多カチオン性高分子化
合物を添加混合した後、カルシウムあるいはアルミニウ
ムイオンを含有する水溶液と接触、ゲル化させて製造し
ｔコ固定化酵素もしくは固定化微生物はゲル化剤が存在
しなくても安定で十分実用に供することができることを
見い出し本発明を完成した３、更にこうして得られた固
定化酵素もしくは固定化微生物を多官能性の架橋剤と反
応させて表面処理することにより反応液中にゲル化剤が
なくても安定でかつゲル内部からの酵素もしくは微生物
の脱離がｊ（＜、長期間活性の安定した固定化酵素もし
くは固定化微生物が得られることを見い出し本発明を完
成した。

以下本発明について説明する。本発明に使用する酵素も
しくは微生物は特に限定されず、例えば酵素としてはア
ルコールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシターゼ
、カタラーセなどの酸化還元酵素、トランスケトラーゼ
、アデニレートキナーゼ、ヘキソキナーゼなどの転移酵
素、β−ガラクトシダーゼ、ペニシリナーゼ、リパーセ
、ニステラー十などの加水分解酵素、フマラーゼ、アス
パルターゼ、スレ１ニンアルドラーセ、β−チロシナー
セなどのリアーゼ酵素、グルコースイソメラーゼ、アラ
ニンイソメラーセなとの異性化酵素、グルタチオンシン
ターゼ、グルタミンシンターセなどのリアーゼ酵素など
か挙げられるっ又、微生物としても細菌、酵母、カビ、
放線菌など酵素活性を有する微生物であれば特に限定さ
れることはなく、酵素活性を有する細胞内小器官、細胞
画分あるいＩ」酵素もしくは微生物の処理物なども固定
化に使用することもできる。また、本発明特定の固定化
方法においては微生物を生きたまま固定化することも可
能であろう 本発明で使用するアルギン酸ナトリウムは市販の篠藻類
から抽出されｊコアルギン酸ナトリウ−ｚｌ＊ｙｔ度で
粘度５０〜Ｉ　ＱＱＱｃｐｓ　）テ十分である。

本発明で使用する水溶性の多カチオン性高分子化合物と
してはポリアルキレンイミン（例えばポリメチレンイミ
ン、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミンなど）
、キトサン及びこｔｌらの化合物の中和塩などが挙げら
れる。これらの水溶性の多カチオン性の萬分子化合物の
うち、ポリエチレンイミンが１０ないし８０　（Ｖｙ／
Ｖ、）％水溶ｉｌｌとしτキトサンと同様市販されでお
り容易に入手することができろ。

又、ケル化剤として使用１−るカルシウムイオンあるい
はアルミニウムイオンを含有する水溶液は、カルシウム
イオンあるいはアルミニウムイオンを含む水溶性の化合
物を溶解しＴコものであれば’）’＆に限定されること
はないが、塩化カルシウムあるいは塩化アルミニウムが
安価で使用上好ましい。

本発明で使用する多官能性の架橋剤としてはポリアルテ
ヒド類が適しており、ジアルデヒドテンブン、クリオキ
ザール、マロンアルテヒド、コハク酸アルデヒド、グル
タルアルデヒドなどか誉げられるが特にグルタルアルデ
ヒドが好ましい。これらの多り能性の架橋剤は固定化酵
素もしくは固定化微生物の表面においてゲル内に含まれ
ている各成分と架橋反応を起こし架橋物を形成し、ゲル
内より酵素もしくは微生物の脱離を防止するのに有効で
ある。。

本発明特定の製造方法について更に詳細に説明すると、
例えば、水または生理食塩水にアルギン酸ナトリウムを
溶解したのち加圧滅菌を行なう。放冷抜水溶性の多カチ
オン性高分子化合物を混合してよく攪拌した後、酵素も
しくは微生物の水溶液あるいは培養液を加えて混合溶液
とする。

酵素もしくは微生物を加えた混合溶液でのアルギン酸ナ
トリウムの濃度は０．５（≠）％ないし１０　（ｔｔ／
ｖ）　％　ｆ４ｑがよく、好しくは１　（Ｍ７’Ｖ）％
ないし６　（Ｗ／Ｖ）％濃度である。水溶性の多カチオ
ン性高分子化合物の濃度は０．０５　（ｗ／ｖ）％ない
し１０　（Ｖ′Ｖ）９４ＱＩ’ｌｌがよく、好Ｌ　＜　
＋、ｊ、　０．１　（ｖＶ）％ないし５　（Ｗ／Ｖ）粥
濃度である。アルギン酸ナトリウムに対する水溶性の多
カチオン性高分子化合物の量比はアルギン酸ナトリウム
１部に対して０．０５部ないし１．５部程度になるよう
に混合することが好ましい。酵素を固定化する場合、酵
素の濃度は０．０１（φ）％ないし５　（Ｗ／Ｖ）％濃
度の範囲が好ましく、微生物菌体を固定化する場合は、
微生物の濃度が０．０１（湿重量／Ｖ）％ないし５０（
湿重量／Ｖ　）％＃度の範囲が好ましい、生きたままの
微生物を固定化する場合には、固定化後適当ｆ、ｆ培地
で同定化微生物を培養することによりケル内の生菌数を
増大°ゝさせることができるので、固定化する時の微生
物の一度は幅広くとることが可能である。

このようにして調製した混合溶液をカルシウムイオンあ
るいはアルミニウムイオンを含有する水溶液と接触させ
ることによりゲル化させ、固定化酵素もしくは固定化微
生物を製造するカルシウムイオンあるいはアルミニウム
・イオンの濃度は０．０１Ｎケいし１．０部濃度が良く
、好し７くは０．０２Ｍないし０．５部濃度がよい。

ゲルの調製方法としては混合液をビペ７ト、注射器や高
圧自動注入ポンプを用いてカルシウムイオンあるいはア
ルミニウムイオンを含有する水溶液へ滴下することによ
りヒース状の固定化物が得られるっ或いは、また、混合
溶液をガラス板上にキャストしｔこのち、カルシウムイ
オンあるいはアルミニウムイオンを含有する水溶液を接
触させることによりフィルム状の固定化物が得られる。

アルギン酸ナトリウムはカルシウムイオンあるいはアル
ミニウムイオンと接触することにより可逆的なゲルを形
成するが、水溶性の多カチオン性高分子化合物が共存し
ているとゲル化により、アルギン酸と多カチオン性高分
子化合物のイオン結合が強化され、より安定なゲルが形
成される、混合溶液とカルシウムイオンあるいはアルミ
ニウムイオンを含有する水溶液との接触時間は０．５時
間ないし２０時間の範囲で十分であり、ＰＨはｐｎ、　
ａ、　０ないしｐＨ１１，０の範囲であればよく、また
温度は４℃ないし５０℃の範囲でよい。ｐＨ温度範囲共
に酵素もしくは微生物の活性に悪影響を与えない範囲で
接触させろと良い。このようにして製造した固定化酵素
もしくは固定化微生物はその後、カルシウムイオンやア
ルミニウムイオンの存在しない反応液中やリン酸イオン
の存在する水溶液に長時間浸漬させてもきオ）めで安定
で、ゲルの溶解はほとんど認められない。さらに、引続
いて、これらの固定化酵素もしくは固定化微生物を多官
能性の架橋剤と反応させて表面処理する場合、多官能性
の架橋剤の反、応濃度は０．００５（Ｖ／り粥ないし０
．５　（ｖ／ｖ）％濃度、好ましくはｏ、　ｏ　ｌ（ｖ
／ｖ）％ないし０．２　（ｖ／ｖ）　％濃度が適してい
るっ架橋反応の温度は２０°Ｃないし５０℃の範囲が好
ましく、反応時間は５分ないし１時間で十分であるが、
多′白能件の架橋剤の濃度に応じて決定することが好ま
しい。

この表面処理によって、カルシウムイオンやアルミニウ
ムイオンの存在しない反応液中やリン酸イ４ンの存在す
る水溶液に長時間浸漬させてもきわめて安定であるのみ
でなくゲル表面が強化された機械的強度の高い固定化酵
素もしくは固定化微生物が得られ、ゲル内部からの酵素
もしくは微生物の脱離を防止することができ長期間、安
定した活性が得られる。

以下実施例を挙げて説明するが、本発明はその趣旨を越
えない限り以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１ 生理食塩水２６ｍ１にアルギン酸ナトリウム（８０（ｌ
Ｏｐｓ）を１２溶解した後、１２０℃ｌ　Ｋｇ／ＣＭ２
で２０分間加圧滅菌を行なった。冷却後、ポリエチレン
イミン水溶液（８０（Ｗ／Ｖ、）９６）　’Ｉｔ：　０
．５　ｍｅ加えよく混合し、その後、グツにコース１％
、ヘフトン（１５９６、酵母エキス０．８％、麦芽エキ
ス０．８％を含む培地ｐＨ５，Ｑで３０℃、２４時間培
養したサツカロマイセス・・レレヒシェ（酒酵母協会７
月）の培養液５　ｍｌ　（Ｍ体温Ｍ（量０．　Ｂ　Ｐ　
）を加えて攪拌し、混合溶液を調製した。この混合溶液
をあらかしめ滅菌処理をした０、　１　Ｍ濃度の塩イじ
カルシラム水浴液にピペットで滴下しＩゲルビーズを調
製した後、２５℃で１時間攪拌を続はゲル化を完成させ
た。その後沖過して固定化酵１’Ｊ：　５３４　ｍｌを
得た。

この固定化酵母のピース２粒子（１粒子の体積は０．０
２５　ｍｅ　）を０．２Ｍ１ｉＨ３１ｔのリン酸第二カ
リウム水溶液２０　ｍｌに浸漬して、３０℃で８０　ｒ
、ｐ、ｎｌの８の字振とうを行なうことによりピースの
崩壊による濁度（６６０ｎｍにおける吸光度）の経時変
化を調べた。また参考例Ｉとし゛Ｃポリエチレンイミン
を添加しない以外は全て実施例１と同様の方法によって
固定化酵母を調製し、同様の方法で（１２Ｍリン酸第二
カリウム水溶液に浸漬して濁度を測定した。結果を表１
に示す。

実施例２ 実施例１で得られｔコ固定化酵母１７　ｍｌを使用して
多官能性架橋剤であるグルタルアルデヒドと反応を行な
った。固定化酵素１７ｒｎｅｆｅあらかじめ滅菌処理し
た生理食塩水１００　ｍｌに懸濁し、これに２５　（ｗ
／ｖ）　９６グルタルアルデヒド水溶液０．２　ｍｌを
添加し、３０℃でゆっくりビーズを攪拌しつつ１０分間
反応を行なわせる、反応後口過し、さらに滅菌水３００
ｍ１で洗浄してグルタルアルデヒド架橋反応した固定化
酵母を得た、。

この固定化酵母のビーズ２粒子（１粒子の体積は０．０
２５　ｍｌ　）を実施例１と同様の操作方法でビーズの
崩壊による濁度の経時変化を調べた。結果を表１に示す
。

表１ ポリエチレンイミンを添加することによってヒースの崩
壊はほとんどないことを示す。一方、ポリエチレンイミ
ンを添加してない参考例１では４８時間後にはビーズは
ほとんど崩壊し溶解している。

実施例３ 実施例１で哄製し１こ固定化酵母１０ｍ１を外套管つき
カラムにつめ培地としてグルコースｌＯ％、酵母エキス
０２％、塩化アンモニウム０２５％、塩化ナトリウム０
．１％、リン酸第二カリウム０．５５％、塩化マグネシ
ウム７Ｉ−１２００，０２５４、））　ｘ　ン酔０．８
　％　’ｉ？含む液体培地（ｐＬＩ　５．０）をカラム
下端よりＳ■＝０、５　ｈｒ’−１で連続的にチューブ
ポンプを使用して流した。外套管には８０℃の水を循環
させて保温しｊこ。２０日間、一定のＳＶで連続カラム
反応によるエタノール発酵を行ない、２０日日の流出液
中のエタノール濃度と生菌数及び固定化酵母のゲル内生
菌数を測定しｔコ。

なお流出液中のエタノール濃度はガスクロマトグラフィ
ー　（ＰＥＧ−１０００／シマライドＦ、１ｍカラム、
９０℃）で定量し、ゲル内生菌数はすり鉢中でピースを
つぶし適量の希釈用生理食塩水によく混合、懸濁させた
後、平板塗布法により測定した。結果を表２に示す。固
定化酵母の崩壊、溶解はほとんど認められなかつｔこ。

実施例４ 実施例２で調製した固定化酵旬１０ｍ１！を実施例８と
同様の操作、方法によって２０日間連続カラム反応によ
るエタノール発酵を行なった。結果を表２に示す。固定
化酵母の崩壊、溶解はほとんど認められなかった。

表　　２ 実施例５ アルキン酸ナトリウム（８０００ｐ８　）　１．２７・
を蒸留水３０−に溶解し、この溶液にアスペルギルス・
オリーゼを培養して得られｔこラクターセ（新日本化学
工業製、ｐＴｌｌＩ　４．５．８０℃における活性８２
．０００　ｕｎｉｔ１５’　）　０．２５　Ｆと８０　
（Ｗ／Ｖ）％のポリエチレンイミン水溶液を１　ｍｅ添
加しよく混合して混合溶液を調製する。この混合溶液を
０．１Ｍ９度の塩化カルシウム水溶液に高圧注入ポンプ
で滴下させてゲルヒースを調製しｔこ後、３０℃で２時
間攪拌を続はケル化を完成させ１こ。その後を過と水洗
をくり返【７て固定化ラクターゼ８２ｍ１を得ｔこ。固
定化ラクターゼの活性を’ｔ　ａ、　８　（Ｗ／Ｖ）％
濃度ラクトースを基質としてＩ）Ｈ４，５，８０℃で生
成するグルコース量を測定した結果、２６５ｕ旧ｔ／ｆ
ｉ／−固定化ラクターゼの活性を示した。活性収率は４
１．４％であった。なお、ここに示す酵素活性の表示は
１分間にｌ　７ｚｍｏｌｅのグルコースを生成する酵素
量を１ｕｎｉｔとする。また活性収率は以下の式によっ
て算出された。

実施例６ アルギン酸す）！Ｊウム（１００００ｐＳ　）６Ｐを蒸
留水２５ｔｎＣに溶解し、この溶液にリゾプス・デレマ
ー起源の乾燥粉末クルコアミラーセ（新日本化学制、ｐ
Ｈ４，５，４０℃における活性が１６．８００　ｕｎｉ
ｔ７７粉末）０３２を添加混合し、さらに８０　Ｃ＜Ａ
／Ｖ）％のポリエチレンイミン水溶液０．　Ｆ！　ｍｅ
相当を１ＮＨｃ７でＪ）１１７．０に中和した水溶液５
−を添加し、よく混合して混合溶液を調製する。この混
合溶液を０、　Ｉ　Ｍ　７１１度の塩化カルシウム水溶
液にピペットを用いて滴下しゲルヒースを調製した後、
３０℃で１時間攪拌を続けた。その後、沖過と水洗を行
なノで固定化グルコアミラーゼを：３’ａｍｌ得た。固
定化グルコアミラーゼの活性を２　（Ｗ／Ｖ、）％濃度
の可溶性澱粉（メルク社製）を基質として、ｐＪＪ４，
５、４０℃で生成するクルコース量を測定し１こ結果７
７．９　ｕ旧もＡト固定化りルコアミラーゼであった。

、活性収率は５１％であった。なお、ここに示す酵素活
性の表示および活性収率は実施例５に準じて定義、９出
した。

実施例７ アルキン酸ナトリウム２７〜を４０　ｍｌの水に溶解し
、１２０℃で２０分間加圧滅菌を行なった。この溶液に
８０　（ｗ／Ｖ）％のポリエチレンイミン水溶液１．２
　ｍｌを添加、混合しその後、この混合液にクルコース
１％、°酵母エキス０．５％、ペプトン１％、肉エキス
０．５％、混合ミネラル溶液（水１１！に（ＮＨｍ）２
Ｐ０４１８０５’、ＫＨ２ＰＯ４７ｏｙ、Ｍ２ＳＯ４−
７Ｈ２０８Ｐ、ＺｎＳＯ４・７Ｂ、２００．６５’、Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｅ２００．９ｙ−％０ｕＳＯ＋−５Ｈ２０
０，０５ｙ−１ＭｎＳＯ４・４Ｈ２００，ｌＦ。

Ｎａ０Ｊ　　１５’を含む）５％を含む液体培地（ｐＨ
７，０）で培養して得たプソイドモナス・フラギー　Ｉ
ＦＯ８４５８（７）培警液１ｏｎ（湿菌重量０．２　Ｐ
　）を加えて、均一になるように混合（・た。この混合
液を加圧自動注入ポンプによって滅菌処理をした０、１
Ｍ濃度の塩化カルシウム水溶液８００ｍ１・＼滴下し、
ゲルヒースを調製した。滴下後、２５℃で１時間攪拌し
た後２５　（Ｗ／Ｖ）％グルタルアルデヒド水溶液０．
６ｔｎｌ加えて、８０℃で１０分間攪拌をしながら反応
を行なったのち、ゲルヒースを沖過により回収し、その
後８００ｍ１の０．１　Ｍ　！Ｊン酸バッファーｐＨ７
，０と６００　ｍｌの滅菌水で洗浄を行ない径がｔ　−
１，５１１１１のビーズ状の固定化菌体を５４−得たつ
この同定化菌体２０　ｍｌを」二記の培地１００−に加
えて５００−フラスコ中で４８時間、３０℃、２２　Ｏ
ｒｐｍで培養を行なった。培養後の生菌数は５．７Ｘ１
０９個／　ｒｒｔ−ケルであった。この固定化増殖菌体
２０ｍ１を用いてフェニルグリオキシル酸メチルの還元
を行なった。還元反応は上記固定化増殖菌体を新ｔコに
上記の培地１００　ｍｌ中に懸濁させ、これにフェニル
グリオキシル酸メチルｌ−を添加し、８０℃、２２　Ｏ
ｒｐｍで２０時間振とう反応を行なった。反応生成物で
あるマンデル酸メチルの生成収率はガスクロマドクラフ
ィー分析（５ｙ５　ＤＥＧＳ、　１ｍ／　１５０℃）で
算出した。その結果マンデル酸メチルの収率は８７％で
あった。なお、反応液中には脱離菌はほとんど認められ
ず、ゲルヒースの崩壊、溶解もほとんど認められなかっ
た。

実施例８ ７　Ｊｌ／ギン酸すｌ−’ＩつＡ（８００ｃｐｓ）０．
６１ｉ’＆蒸Ｗ水８０＋＋＋ｇに溶解し、この溶液にア
スペルギルス・オリーゼを培養して得られｊこラクター
ゼ（新日本化学工業製；ｐＨ４，５，８０℃における活
性が８２，０００　ｕｎｉｔ／ｙ−’）　０．２５　！
ｉ’とキトサン（共和油脂■製品）０．８ｖ〜を添加、
混合し混合溶液を調製する。この混合溶液を０、１　Ｍ
濃度の塩化カルシウム水溶液１８０ｍ／に高圧注入ポン
プで滴下させゲルビーズを調製した後、２５℃で２時間
攪拌を続はゲル化を完成させた。その後この溶液に２５
　（ｗ／ｖ）％のグルタルアルデヒドを０．１５　ｍｌ
添加してグルタルアルデヒドによるゲル表面の架橋反応
処理を８０℃で１０分間行なった。反応後沖過と水洗を
くり返して固定化ラクターゼ３８ｍ１を得た。実施例５
と同様の操作、方法で固定化ラクターゼの活性及び活性
収率を測定、計算した結果、活性は２８ｇ　ｕｎｉｔ／
ｍｌ−固定化ラクターゼで活性収率は４５．１９６であ
つ１こ。

実施例９ アルギン酸ナトリウム（８００（＋ｐＳ）１．２１を生
理食塩水２５＋＋＋／に溶解しこの溶液にストレプトマ
イセス・フェオクロモゲナスを培養して得られ１こクル
コースイソメラーヤ含有凍結菌体（台同酒梢製；活性５
５０　ｕｎｉｔ／ｙ・−凍結菌体）６ｙ−と３０　（ｗ
／ｖ）％濃度のボＩＪＩチレンイミン水溶液ｌ−を添加
、混合し混合溶液を調製する。この混合溶液を０．１　
Ｍ濃度の塩化力ルシウノ・水溶液１．８０　ｍｅ中に高
圧注入ポンプで滴下させデルビーズを調製、その後、２
５℃で２時間攪拌を続はゲル化を完成させｔコ、ｒ過と
水洗をくり返して固定化放線菌８２ｍｅを得た。固定化
放線菌のクルフースイソメラーセ活性を２．０ｙ濃度の
グルコースｍ　ｌｌ’ｊを基質とし、て、６０°Ｃでの
フラクトース生成量で測定しｔこ結果、６８．４　ｕｎ
ｉｔ／ｍ１．−固定化放線菌であった。活性収率は６１
．５％であつ１こ。なおりルコースイソメラーゼ含［凍
結菌体の含水率は４０％であった。

手続補正書（自発） 昭和５７年ｌλ月３日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、　事件の表示 昭和５７年　特許願第１８５６４８号 ２”　発明０名称　　　　　　泡も 固定化酵素もしくは固定化放線菌の製造方法３　補正を
する者 事件との関係　　　　特前＋１−＋、１戸、住　所　　
大阪市東区北浜５丁目１５番地名　称　（２０９）住友
化学工業株式会社代表者　　　土　　方　　　　　武 ４、代理人 住　所　　大阪市東区北浜５丁目１５番地５、補正の対
象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、　　？ｉ′ｌｉ正の内容 （１）明細書をド記のとおり補正する。

１父ニ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　アルギン酸ナトリウムの水溶液に酵素もしく
   は微生物および水沼性の多カヂ］ン性高分イ化合物を添
   加混合し、ｊこのち、カルシウムイオンあるいはアルミ
   ニウムイオンを含有する水溶液と接触、ケル化さけるこ
   とによって酵素もしくは微生物を固定化せしめることを
   特徴とする同定化１１Ｆ紫もしくは同定化微生物の製造
   方法、。
2. （２）　　水溶性の多カチオン性高分子化自物がポリア
   ルキレンイミン、キトサンあるいはこれらの化合物の中
   和塩である特許請求の範囲第１項記載の同定化酵素もし
   くは固定化微生物の製造方法１、
3. （３）　　アルギン酸ナトリウムの水溶液に酵素もしく
   は微生物および水溶性の多カチオン性高分子化合物を添
   加混合したのち、カルシウムイオンあるいはアルミニウ
   ムイオンを含有する水溶液と接触、ゲル化さ七で酵素も
   しくは微生物を固定化せしめた後、これを多１能性の架
   橋剤と反応させて表１ｆｌＢ処理することを特徴とする
   同定化酵素もしくは固定化微生物の製造方法、。
4. （４）　　水溶性の多カチオン性高分子化合物がポリア
   ルキレンイミン、キト→ノンあるいはこれらの化合物の
   中和塩であろ特Ｆｔ’請求の範囲第３坦記載の固定化Ｐ
   ｌｉ？素もしくは固定化微生物の製造方法。