JPS5876089A - 酵素もしくは微生物の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素もしくは微生物の固定化方法に関し、よ如
詳しくは酵素もしく拡歓生物な１該酵素以外の水溶性蛋
白質および水溶性多糖類とともに水に不溶性の有機溶媒
中に分散させ九のち、分散状態を保ちながら多官能性の
架橋剤と反応させることによシ、活性が高く、かつ機械
的強度にもすぐれた固定化＊素もしくは固定化微生物を
与える酵素もしくは微生物め固定化方法に関する０ 辺部、生体反応の触媒でああ酵素を食品や医薬あるいは
化学製品などの製造プロセスでの触媒として使用する目
的で酵素を不溶化して固定酵素とする研究は着すます盛
んと表シ、工業的に重要な技術として注目・されている
。酵素活性を有すゐ微生物菌体において屯同様に固定化
微生物画体として活用する方法や、更には微生物を生き
たまま固定化し固定化増殖微生物として利用する技術も
開発されつつある。

・２一方、辷れまで知られている酵素もしくは微生物の
固定化方法の中で、固定化方法が簡単で数多くの酵素も
しくは微生物に巾広く適用することができ、また機械的
強度もよい固定化酵素もしくは固定化微生物を与える固
定化方法としては酵素もしくは微生物を架橋剤と反応さ
せて固定化する架橋法が知られている。（固定化酵素；
千畑一部編、講談社（／り７５年）１　しかしながら、
これまでの架橋法による酵素本しくは微生物の固定化方
法においては架橋剤と酵素もしくは微生物が直接反応す
るため、酵素活性がそこなわれ、得られた固定化酵素も
しくは同定化微生物の活性が低く、安定性が悪いなどＯ
問題がありた・このような問題点の改良法として酵素も
しくは微生物をフル１ミンなどの酵素以外の不活性な蛋
白質とともに架橋剤と反応させる方法も研究されている
が（クラウス、モスバッハ編、メνツズ・イン・エン望
イ畳ロジー、＋ｐ巻、λ４３頁アカデミツクプレス社（
／？７４年）１、この方法を用いた場合においても固定
化後、未反応の架橋剤の残留によシ固定化酵素もしく社
性が患いために活性が低いなどの欠点があう九〇又、架
橋剤による固定化方法においては固定化酵素もしくは固
定化微生物の形状をそろえるために造粒機、押し出し機
、あるい線切断機などの装置が必要であった。

本発明者らは架橋剤による固定化方法のこれらの欠点を
克服し安価で操作が簡単モあり、多くの酵素や微生物に
巾広く適用できる固定化方法について鋭意検討を重ねた
結果、酵素もしく祉微生物と尚該酵素以外の水溶性蛋白
質および水溶性多糖類とを混合して混合溶液とし、これ
を水に不溶性の有機溶媒に滴下して分散させたのち、攪
拌によって分散状態を保ちながら多官能性の架橋剤と反
応させると架橋剤による酵素もしくは微生物の活性の低
下が防止され、又固定化後、固定化酵素もしくは固定化
微生物に残ＩｉＩあるいは付着する未反応の架橋剤ある
いは有機溶媒量が少なく、活性が高く機械的強度にもす
ぐれた、安定な固定化酵素もしくは固定化微生物が簡単
に得られることを見い出し本発明を完成させた。

以下本発明について説明する。

本発明に使用する酵素もしくは微生物は特に限定されず
、例えは酵素としてはアルコールデヒドロゲナーゼ、Ｄ
−アミノ酸オキシターゼ、カタラーゼなどの酸化還元酵
素、トランスケトラーゼ、アデニレートキナーゼ、ヘキ
ソキナーゼなどの転移酵素、β−ガラクト枦ダーゼ、ぺ
二シリナーゼ、リパーゼ、エステラーゼなどの加水分Ｓ
＊素、フマラーゼ、アスパルターゼ、スレオニンアルド
ラーゼ、β−チロシナーゼなどのリアーゼ酵素、グルコ
ースイソメラーゼ、アラニンイソメラーゼなどの異性化
酵素、グルタチオンシンターゼ、グルタミンシンターゼ
、などのりガーゼ酵素などが挙けられる。

又、微生物としても細菌、酵母、カビ、放線菌など酵素
活性を有する微生物であれば限定されること社なく、酵
素活性を有する細胞内小慟管、細胞画分、あるいは酵素
もしくは微生物の処理物なども固定化に使用することも
できるＯ又、本発明特定の固定化方法においては、微生
物を生きたまま固定化することも可能である。

本発明に使用する水溶性の蛋白質としては卵アルブミン
、牛血清アルブミン、ゼラチンあるいは可溶化コラーゲ
ン表どが適しているが、卵アルブミンが安価で大食に入
手しやすく好ましい。これらの水溶性蛋白質は酵素もし
くは微生物を水溶性多糖類とともに水に不溶性の有機溶
媒に分散させたのち分散状態を保ちながら多官能性の架
橋剤と反応させた時に酵素もしくは微生物の活性が架橋
剤あるいは有機溶媒によって低下することを防止し、酵
素もしくは微生物を安定に固定化するのに有効であシ活
性が高く、安定な固定化微生物しくは固定化微生物を得
ることができる０ 本発明に使用する水溶性多糖類としては可溶性デンプン
、プルラン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）　
、キトサン、アルギン蒙、ペクチンなど常温で可溶性の
多糖類であればいずれも有効であるが、特にプルラン、
デキストラン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）
　、アルギン酸碌どの多糖−が好ましい０これらの水溶
性糸糖類を酵素もしくは微生物と氷浴性蛋白質とともに
水 に不溶性の有機溶媒に分散させたのち、多官能性の架橋
剤と反応させて固定化すると得られた同定化酵素もしく
は固定化微生物は水中でＯ膨潤性が高められ、固定化酵
素もしく線固定化微生物に残留あるいは付着している未
反応の架橋剤あるいは有機溶媒を洗浄によりて容易に除
去することが可能となシ固定化酵素もしくは固定化微生
物の活性の安定性が増大する。又、固定化酵素もしくは
固定化微生物の水中での、膨潤性が高められることによ
り反応基質の固定化酵素もしくは固・定化微生物内部へ
の浸透性が増大し活性の高い固定化酵素もしくは固定化
微生物を得ることができる。

本発明に使用する水に不溶性の有機溶媒としては脂肪族
炭化水素、芳香族炭化水素、脂珈式旋化水素あるいはエ
ステルなどの有機溶媒の中で水に不溶性で酵素もしくは
微生物の活性に重大な悪影響を与えず、酵素もしくは微
生物と水溶性蛋白質および水溶性多糖類が安定に分散す
るものであればよいが、特にシクロヘキサン、トルエン
、ジブチルフタレートなどが分散性、操作性などの点で
好ましい０又、これらの有機定性を高めるためにクロロ
ホルム、塩化メチレバン）、ポリオキシエチレンソルビ
クン脂肪酸エステル（例えばツイン）などの界面活性剤
を有機溶媒に加えて用いることも有効である。

本発明に使用される多官能性の架橋剤として紘ポリアル
デヒド類あるいはインシアネート類が適しておシジアル
デヒドデンブン、グリオキザール、マロンアルデヒド、
コハク酸アルデヒド、グルタルアルデヒド、７ジブアル
デヒド、ピメリジアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシ
アネート、ｐ−トルイレンジイソシアネートなどが挙け
られるが、特にグルタルアルデヒドが好ましい。

酵素もしくは微生物を当核酵素以外の水溶性蛋白質およ
び水溶性多糖類とともに水に不溶性の有機溶媒に分散さ
せたのち、多官能性の架橋剤を加えて攪拌しながら反応
させると架橋剤は酵素本しくは微生物と水溶性蛋白質お
よび水溶性多糖類との混合溶液の微細な分散粒子の表面
と接触して反応が進行するために、過剰の架橋剤が固定
化酵素もしくは固定化微生物の内部に残留したシ過度の
架橋反応が進行したりするζを防止することができる０
本発明特定の固定化方法によって得られる固定化酵素も
しく社固定化微生物は粒状でありその粒径は反応時の攪
拌速度を調節することによシ容易ＫｇＲえることができ
粒度のそろった固定化触媒もしく社固定化微生物を簡単
に得ることができる０ 本発明の固定化方法について、更に詳細に説明すると、
まず酵素もしくは微生物を水溶性蛋白質および水溶性多
糖類とを酵素もしくは微生物の活性に適゛した緩衝液に
加えて攪拌し混合溶液を調製する。混合溶液での酵素の
濃度としてはθ、／（Ｗ／Ｗ）−〜ｌｂ（ｗ、’ｗ　）
−濃度、好ましくはθ、ｊ（勢賀）チ〜ｊ、Ｏ（哉乍）
−濃度が良い。微生物濃度としては０．Ｑ（Ｗ／Ｗ）　
ｓ〜３θ（ＷＡＩ）−濃度、好ましくはθ、ｌ（φ）−
〜−〇（Ｗ／ｖ）−濃度が良く、本発明韓の固定化方法
により得られた固定化微生物を適轟な培地で培養すれば
固定化物内の微生物量を増大させることが可能である。

混合溶液中での水溶性蛋白質濃度は！　（Ｗ／Ｗ　）−
〜２　ｊ　（ｗ／Ｗ）チ濃度がよく、好ましくは／θ（
Ｗ／Ｗ　）−〜−〇（ｗ／Ｗ）−濃度が良い０酵素屯し
くけ微生物と水溶性蛋白質の総和の濃度は１０（φ）−
〜３θ（φ）チ濃度となるように調製することが好まし
い。混合溶液中での水溶性多糖類の濃度としてはθ、　
ｊ’　（Ｗ、Ａ’　）−〜／θ（Ｗ、Ａ’　）チ濃度が
よく、好ましくは／、θ（ｗ／ｖ）−〜ｊ　（ｗ／ｖ）
−濃度が良い。混合溶液中での水溶性多糖類の乾燥重量
は酵素もしくは微生物と水溶性蛋白質との総乾燥重量／
部に対して０．０２部〜θ、ｊ部の範囲が良く、特に４
０５〜０．２部の範囲が好ましい。混合溶液は微生物も
しくは微生物処理物を使用した場合には微生物などが溶
解せず懸濁液として得られるが本発明の爽施上何ら問題
はない０かくしてｖＩ４製した酵素もしくは微生物と水
溶性蛋白質および水溶性多Ｓ類との混合溶液を水に不溶
性の有機溶媒に有機溶媒を攪拌しながら滴下して分散さ
せる。

使用する有機□溶媒の容量は、分散させる混合溶液／部
に対して７部からに部の範囲が良く、特に７部から６部
の範囲が好ましい。有機溶媒を常に攪拌しつづけながら
混合溶液を滴下したのち、多官能性の架橋剤を混合溶液
が分散している有機溶媒に加え、更に攪拌をつづ叶て反
応を行なわせる。加える多官能性の架橋剤の乾燥重量は
酵素もしくは微生物との籾乾燥重量／部に対して０．０
２部〜／、ｊ部の範囲が良く、特に０．Ｑｊ部〜／部の
範囲が好ましい。多官能性の架橋剤が水溶性である場合
にはあらかじめ架橋剤をｊ（Ｗ／Ｗ　）−〜３θ（ｗ、
、’ｗ　）−濃度の水溶液としてから加えても良い。多
官能性の架橋剤による反応に要する時間はＳ分〜ｌＪ分
程度であシ、通常７０分〜６０分で十分である。反応温
度はｊ−ダθ℃が良く、好ましくは１０〜３０℃が適し
ている。

このようにして得られた酵素もしくは微生物と水溶性蛋
白質および水溶性多糖類との混合法有機溶媒と分離した
のち、水あるいは緩衝液なとて十分に洗浄を行ない、残
留あるいは付着している有機溶媒あるいは多官能性の架
橋剤を除去すると粒状の弾力性のある固定化微生物しく
け固定化微生物が得られる。本発明で得られ九固定化酵
素もしくは固定化微生物は凍結乾燥法あるいは減圧乾燥
法などにより乾燥物として、あるいは緩衝液中に湿潤状
態で安定に保存することが可能である。本発明特定の固
定化方法によれば、形状のそろった粒状の固定化酵素も
しくは固定化微生物を容易に得ることができ、得られた
固定化酵素もしくは固定化微生物は機械的強度が高く安
定で活性も高い。

以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はその
趣旨を越えないかぎり以下の実施例に限定されるもので
はない。なお酵素活性の表示は７分間に／μｍｏｌ・の
反応基質あるいは反応生成物を消費あるいは生成する酵
素量を／　ｕｎｉｔとする。また固定化酵素もしくは固
定化微生物の活性収率は以下の式によって算出し良。

活性収率（至） 実施例／ アスペルギルス−オリーゼを培養して得られたラクター
ゼ（新日本化学工業製：活性ｕｌｌ）Ｏｕｎｉｔ／Ｆ　
）　０．、どりと卵アルブミンータおよびカルボキシメ
チルセルロースθ、２りとを０．０６Ｍ濃度の酢酸緩衝
液（ｐＨＫｊ）−θｄに溶解し混合溶液を調製した。こ
の混合溶液をシクロへ牛サン７θｄ１塩化メチレンコθ
ｄ１スパンざｓ　　ｉ、ｓｗを含む有機溶媒中に攪拌し
ながら滴下して分散させたのち／θ（Ｗ／％Ｖ）−濃度
のグルタルアルデヒド溶液を！ｄ加えて３部°Ｃで３０
分間攪拌をつづけた。′□得られた固定化物を、２０メ
ツ°シ、の金網で濾過した後０．ガＭ濃変の酢酸緩衝液
３θθ−で３回洗浄を繰シ返して直径／、θ〜二〇−の
粒状の固定化ラクターゼを、２ｊｌｌ／得た。固定化ラ
クターゼの活性を／３．３　（Ｗ／ｓＮ）　％濃度ラク
トースを基質とルて３部°Ｃで生成するグＪｋコース量
を測定した結果Ｊｊ、Ｓ　（ｕｎｌｔ　７ｍ−固定化ラ
クターゼ）の活性を示した。活性収率は！／、ｇチであ
うた０ 実施例λ トリコデルマ・ビリデを培養して得られたセロビ７−ゼ
（β−グルコシダーゼ、活性３θθｕｎｉｔ／７　）　
／、θｆと卵アルブミンコタおよびプルランθ、ダタと
を０．０！；　Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ五〇）−〇−
に溶解し混合溶液を調製した。この混合溶液をジブチル
フタレートダθ−、クロｑホルム／Ｑｍ１．スパンざｊ
／、ｊ−を含む有機溶媒中に攪拌しながら滴下して分散
させたのち２　！；　（Ｗ／Ｗ）−濃度のグルタルアル
デヒド溶液、２−を加えて３部°Ｃで３部分間攪拌をつ
づけた。得られた固定化物を濾過したのち、θ、０．ｔ
Ｍ濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５，θ）、２０θ−で３回洗
浄を繰り返して直径θ、ｊｓ＋〜／０．５ｍの粒状の固
定化セロビアーゼを、２ｊｓ／得た。固定化セロビアー
ゼの活性を／、ｏ（ｗ／ｖ）チ濃度のセロビオース溶液
を用いてダθ°Ｃでのグルコース生成量で測定した結果
、工４１．２　（ｕｎｌｔ　／　Ｍ−固定化セロビオー
ス）　の活性を示した。活性収率は低−一であった。

実施例３ 大野製薬製のグルコースオキシダーゼ（ハイデラーゼ：
活性乞０００　ｕｎｉｔ　／　ｐ）θ、／２と卵アルブ
ミン３．０１およびプルラン０．２１とをθ、／Ｍ識度
Ｍ濃度酸緩衝液（ｐＨ１ｈ、θ）−〇−に溶解し、混合
溶液を調製した。この混合溶液をトルエン７θｄ１クロ
ロホルムコθ−スパンｌｊを／、ｊ−含む有機溶媒中に
攪拌しながら滴下して分散させたのち、コｊ（φ）チ濃
度のグルタルアルデヒド溶液をｌ耐加えて３０分間、２
５℃で７５分間攪拌をつづけた。得ちれた同定化物を０
．７Ｍ濃度のリン酸緩＠８３０θ―で３回洗浄を繰シ返
して直径θ、ｊ〜／、０−の粒状の固定化グルコースオ
キシダーゼを、２！；ｍ得た。固定化グルコースオキシ
ダーゼの活性を／、θ（ｗ７Ｗ）　９６濃度のグルコー
ス溶液を用いてダθ°Ｃにおけるグルコース消費量で測
定した結果、Ａｍ　ｇ　（ｕｎ　ｉｔβ−固定化グルコ
ースオキシダーゼ）であった。活性収率はＵｊチであり
た。

実施例１ グルコースイソメラーゼ含有凍結菌体（合同酒精製）を
超音波画体破砕処理して得た粗酵素液をアセトン分画（
ダθ〜７ｊチ）で部分精製することによシ調製したグル
コースイソメラーゼ酵素粉末（活性１０．　！；００　
ｕｎ　ｉ　ｔ／　ｊ’　）０．５部と卵アルブミン７．
６Ｐおよびプルラン／、θノとを０．６Ｂ　Ｍ濃度のリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，６）ｊＯｍｌに溶解し混合溶液を
＃Ａ製した。

この混合溶液をトルエン／ＪＤ　ｓ／　、クロロホルム
ダθ耐、スパンざｊを３．０１を含む有機酊媒中に攪拌
しながら滴下゛して分散させたのち、２ｊ（φ）−一度
のグルタルアルデヒド溶液をＱｍ加えて３０°Ｃで３０
分間攪拌をつづけた。得られた固定化物を一過し九のち
０．のＭ濃度（０す：／１ｌＩＥｑＩ１１１！（Ｐ１１
７．Ｊ）Ｘ）Ｏｄ−Ｃ，を回洗浄を繰シ返して直径／、
θ〜二θ−の粒状の同定化グルコースイソメラーゼを６
θ−得た。

固定化グル】−スイソメラーゼの活性を、２Ｍ濃度のグ
ルコース溶液を用いて６θ°Ｃにおけるフラクトース生
成量で測定した結果、嬬ｊ（ｕｎｉｔ’ｓ／−固定化グ
ルコースイソメラーゼ）の活性を示した。活性収率社何
、６チでありた。

実施例よ パン酵母（サツカロマイセス・セレビレエ）をｋ　ＪＬ
−りＯＸ　−２％　４　ホ！Ｊ　ヘフ）　ン０−　ｊ　
’ｆ４酵母エキスθ、−一、第ニリン酸カリウム０．ｊ
−１硫酸マグネシウム・７水和物θ、コチを含む培地（
ｐＨ１ｈ、１１７）を用いて培養して得た温曹体（含水
率７０％）／−０１と卵アルブミンユ０！およびプルラ
ンθ、λＰとを０．０！　Ｍ　ＩＩ　＆のリン酸緩衝液
（ｐＨムθ）−〇−に加・えて攪拌し混合液をｍｉ＆ｉ
！ｔ、九〇この混合液をトルエンｊθ−、クロロホルム
／ｊ−、ツインｌθを二〇−含む有機溶媒中に攪拌しな
がら滴下して分散させたのち、ｐ−トルイレンジイソシ
アネートーーを加えて３θ°Ｃで６θ分間攪拌をつづけ
た。得られた固定化物を濾過したのち０．のＭ濃度のリ
ン酸緩衝液（ｐＨ＆θ）　ｘｏ　ｓｇで３回洗浄を繰シ
返して直径／、θ〜二〇謳の粒状の固定化酵母を一６ｄ
得た。固定化酵母のインベルターゼ活性を３０℃でのシ
孤−クロースからのグルコース生成量で測定した結果／
　ｊ　（ｕｎｉｔ／ｍ−固定化酵母）でありた０活性の
回収率はｇ、コチであった。

なお培養酵母のインベルターゼ活性は２ｗ（ｕｎｉｔ／
Ｐ−乾燥菌体）であった０更にこの固定化酵母を先に用
いた培地で一日関３θ°Ｃで培養するとインベルターゼ
活性は／θ４４　（ｕｎｉｔ、４−固定化酵母）に増大
した。

実施例６ 放線菌、ストレプトマイセスやフエーオクロモゲナスを
培養して得られたグルコースイソメラーゼ含有凍結菌体
（合同酒精製；活性ｊ支）　ｕｌｌル冷−凍結画体）　
１０りと卵アルブミンｊＰおよびプルラン／りとを０．
０６　Ｍ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ７，ｊ）ｊθｄに加
えて攪拌し、混合液を調製し九〇この混合液をトルエン
／！；Ｏｄ、クロロホルムダθｄ１スパンｌｊを３．０
ｍ含む有機溶媒中に攪拌しながら部下して分散させたの
ち、コｊ　（Ｗ／Ｗ）−娘度のグルタルアルデヒド溶液
４１５ｇを加えて３０℃で３０分間攪拌をつづけた。得
られた固定化物を一過したのち０．ＱＭｆＩｋ度のリン
酸緩衝液（ｐＨ７，４）　３００　ｍで３回洗浄を繰シ
返して直径／、θ讃〜ユｊｓｉの粒状の固定化放線菌を
６０−得た。固定化放線菌のグルコースイソメラーゼ活
性を二〇Ｍｉｌ＆のグルコース溶液を基質として６０℃
でのフラクトース生成量で測定した結果、！＆ｊ（％ｔ
ｎｉ％ＡＪ−固定化放線菖）であり九〇活性の収率紘ｎ
ｊ−でありた〇な参、グルコースイソメラーゼτ有凍結
曹体の含水率はＩＩｏ−であうた。

実施例７ フマル酸アンモニウム３チ、第ニリン酸カリウム０．．
２ｍ、硫酸マグネシウム・７水和物０．０ｓチ、】−ン
スチーブリカ−４を一１炭酸カルシウムｏ、カーを含む
培地（ｐＨ７，０）で大腸菌（エシェリシェ・コリ）を
培養して得た湿菌体（含水率ざθ−）！ｒＦと卵アルブ
ミンコタおよびカルボキシメチルセルロースθ、りｙと
を０．ｃＭｌｌ＆のリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）」θｄ
に加えて攪拌し混合液を調製した。この混合液をトルエ
ン７０ｗ１．クロロホルムコθ―、スパンざｊをｉ、ｓ
ｔ含む有機溶媒中に攪拌しながら陶工して分散させたの
ち２　ｊ　（ｗ／Ｗ）−淡度のグルタルアルデヒド溶液
−一を加えて３θ°Ｃで２０分間攪拌をつづけ九〇得ら
れた固定化物を０．０６　Ｍ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ
７，ｊ　）　、２００　ｍで３回洗浄を繰シ返して直径
／、θ蒙〜二〇−の粒状の固定化大腸菌を一ダ―得た。

この固定化大Ｍ！Ｉ′ｖ！４の７スパルターゼ活性をフ
マル酸アンモニウムを基質として３７℃でのアスパラギ
ン酸生成量で測定した結果ユ／　（ｕｎｉｔ／ｓｇ−固
定化大腸菌）であう九〇活性の回収率はＵ、／チであう
九〇なお、培養によって得られた大腸菌の７スパルター
ゼ活性は７４１　（ｕｎｌｔ／　Ｆ−乾燥画体）　であ
りた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 酵素もしく轄黴生物を轟＃酔素以外の水溶性蛋白質およ
   び水溶性の多糖類とともに水に不溶性の有機溶媒中に分
   散させたのち、分散状態を保ちながら多官能性の架橋剤
   と反応させることを特徴とする酵素もしくは微生物の固
   定化方法０