JPH01256389A - 固定化生体触媒の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、固定化生体触媒の製造方法に関する。

（従来の技術） 微生物または酵素の生体触媒反応を利用して有用物質を
製造すること１食品の製造や加工を行なうこと、さらに
産業排水の処理などを行なうことが従来から知られてい
る。一般に、これらの生体触媒による反応を行なう場合
には、該触媒は溶液または懸濁液として回分法で用いら
れることが多く２反応終了後には再利用されずに使い捨
てにされていた。しかし、近年このような生体触媒を再
利用しようという試みがなされるようになり、そのため
の手段として微生物菌体や酵素などの生体触媒を適当な
担体に固定化する方法が開発されてきている。この生体
触媒の固定化によって、所望の反応を連続的に行うこと
も可能となった。

生体触媒の固定化法としては、（ａ）物理吸着法。

但）イオン結合法、（Ｃ）共有結合法、（ｄ）包括法、
（ｅ）マイクロカプセル法、およびげ）架橋法が挙げら
れる。

これらの方法の中では、製造コスト、調製の難易度、結
合の強さ、調製工程における活性低下の有無などの点か
ら（ｄ）の包括法が最も有利であると考えられる。

生体触媒を固定化する担体は、特に該触媒が食品の製造
や加工のために用いられる場合には食品衛生上の安全性
が問われる。例えば、一般に生体触媒の担体として用い
られるポリアクリルアミドゲルの場合、アクリルアミド
モノマー自体が食品衛生上好ましくない毒性を有するた
め２食品の製造や加工には利用され得ない。そのため、
生体触媒を固定化する担体としては食品衛生」二の安全
性に優れた天然物が適していると考えられる。

担体として用いられ得る天然物としては、アルギン酸カ
ルシウム、に−カラギーナン、キトサンなどが挙げられ
る。これらのうち、アルギン酸カルシウムを担体として
用いた場合、調製された固定化物はその硬度が不十分で
ある。さらに、アルギン酸カルシウムは、リン酸イオン
が存在する水溶液（例えば、酵素反応において汎用され
るリン酸緩衝液）中で徐々に溶解するという欠点を有す
る（Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｏｅｎｇ、　１９．３８７（
１９７７））。

に−カラギーナンを担体として用いた場合にも。

該に一カラギーナンが水溶液中で徐々に溶解するという
欠点がある。これを防ぐために、−殻内にはＫ”　、　
ＮＨ４”などのゲル化剤が反応液中に添加される。しか
し、ゲル化剤の添加ができない食品の製造や加工には、
このに−カラギーナンは使用できない。

キトサンを用いて微生物菌体または酵素を包括固定化す
る方法としては、　Ｋ、Ｄ、Ｖｏｒｌｏｐらの方法（Ｂ
ｉｏｔ、ｅｃｈ、Ｌｅｔｔ、　３．９（１９８１））が
よ（知られている。

この方法では、微生物菌体または酵素をキトサン溶液へ
懸濁させ、この懸濁液をトリポリリン酸塩溶液中に滴下
することによってゲル化が行われる。

しかし、このようにして得られたゲルも物理強度が不十
分であり、該ゲルからの微生物菌体または酵素のリーク
（洩れ）が大きく、工業的に使用するには不適当である
。

上記キトサンば６エビやカニの外骨格を形成するキチン
を原料として得られる。水に不溶の多糖類である。キト
サンは食品添加物として許可されている物質であるため
安全性に問題はない。さらに、水に不溶の物質であるの
で上記のアルギン酸カルシウムやに一カラギーナンのよ
うな溶解性やゲル化剤の添加といった問題がない。しか
も、原料は安価であり、生体触媒用の固定化担体として
非常に有望である。従って、上記微生物菌体や酵素のリ
ークをなくすことができれば、このキトサンは、有用な
担体であると考えられる。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、物理的強度に優れ、そして微
生物菌体または酵素のリークの極めて少ない固定化生体
触媒を製造する方法を提供することにある。本発明の他
の目的は、使用する担体が毒性を持たないため食品の製
造や加工にも利用することの可能な固定化生体触媒を製
造する方法を提供することにあるヶ （課題を解決するための手段） 本発明は、微生物菌体または酵素、およびキトサンを用
いて固定化生体触媒を製造する方法であって、（１）微
生物菌体または酵素、およびキトサンを含む溶液または
懸濁液を、３〜６個の陰電荷を有するアニオンを生じ得
る塩の水溶液中に滴下してビーズ状の凝集物を得ること
；（２）該凝集物を乾燥させて乾燥物を得ること；およ
び（３）該乾燥物をアルデヒド基を有する架橋剤溶液中
に浸漬することを特徴とする。

本発明方法で用いられる微生物菌体または酵素は特に限
定されず、酵素活性を有する微生物菌体または酵素のい
ずれもが使用され得る。このような微生物菌体としては
２例えば、エシェリヒア属。

プロテウス属、バチルス属、シュードモナス属などの細
菌類；およびビール酵母、ワイン酵母などの酵母類が挙
げられる。これらの微生物菌体は生菌体であっても乾燥
菌体であってもよい。酵素としては４例えば、トリプト
ファナーゼ、グルコースイソメラーゼ、インベルターゼ
、α−アミラーゼ、リパーゼなどが挙げられる。

本発明方法で用いられる３〜６個の陰電荷を有するアニ
オンを生じ得る塩とは、解雛してアニオンとなるような
塩であり、かつ該アニオンが分子内に３〜６個の陰電荷
を有する化合物を指していう。そのような化合物として
は１例えば、トリボリホスフェート（トリポリリン酸塩
）、トリメタホスフェート（トリメタリン酸塩）、フェ
リシアニド（フェリシアン酸塩）、フェロシアニド（フ
ェロシアン酸塩）、シリケー１（ケイ酸塩）などがある
。なかでも、トリポリフオスフェートが好適である。

本発明方法に用いられるアルデヒド基を有する架橋剤と
しては９例えば、グルクルアルデヒド。

グルオキサール、およびスクシンアルデヒドが挙げられ
、特にグルタルアルデヒドが好適である。

本発明方法により固定化生体触媒を調製するには９例え
ば、まず、キトサン、および微生物菌体または酵素を含
有する溶液または懸濁液の調製を行なう。キトサンは実
質的に水に不溶であるため。

通常、酢酸などの希弱酸溶液に完全に溶解させた後、ア
ルカリ溶液でｐＨを中性に調製する。このキトサン溶液
と、生体触媒として固定化しようとする微生物菌体また
は酵素とをあわせ、均一な溶液または懸濁液とする。固
定化しようとする酵素（微生物菌体が生産する酵素を含
む）が補酵素として特定の成分を必要とする場合には、
この補酵素が加えられていてもよい。

別に、上記３〜６個の陰電荷を有するアニオンを生じ得
る塩の水溶液中を調製する。この塩の濃度は１通常、２
〜６０ｇ／　１２である。この溶液中に上記菌体（酵素
）懸濁液（溶液）を滴下し、ビーズ状の凝集物を生成さ
せる。この凝集物を、該凝集物中の生体触媒が失活しな
いような条件下で乾燥する。乾燥法としては、真空乾燥
法が好適であるが、温風乾燥法および凍結乾燥法も用い
られ得る。

例えば、温風乾燥法は熱安定性のよい耐熱性酵素などを
生体触媒として固定化した場合に用いられ得る。また、
凍結乾燥法を用いると多孔質の乾燥物が得られる。この
乾燥工程は、物理的強度の高い固定化生体触媒を製造す
るために必須である。

乾燥工程を経ずに後述の架橋剤による処理を行なうと、
微生物菌体や酵素のリークは防止されるが得られる固定
化生体触媒の物理的強度は著しく低下し、使用に耐えら
れない。

次に、この乾燥物を上記アルデヒド基を有する適当な架
橋剤の溶液に浸漬する。架橋剤の濃度は通常０．５〜２
０ｇ／　４２であり、浸漬時間は通常５〜１２０分であ
る。

このようにして得られた固定化生体触媒は、酵素を利用
した各種反応により利用される。例えば。

生体触媒としてプロテウス　レトゲリの菌体を商定化し
た固定化生体触媒を用い、バッチ法により。

あるいはカラムに充填して連続的にＬ−１−リブトファ
ンが製造される。この固定化生体触媒は、連続して使用
しても酵素活性はほぼ完全に保持される。

物理的強度が高いためカラムへの充填や連続使用により
破壊されることがなく、かつ膨潤や破壊による微生物菌
体または酵素のリークはほとんど観察されない。さらに
、このようにして調製された固定化生体触媒は、乾燥に
より触媒能に影響を与えることなく容積を縮小させてい
るので、単位容積あたりの活性が高いという利点を有す
る。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

１施■よ 生体触媒として微生物（プロテウス　レトゲリ（ＩＦＯ
１３５０１））を用いた。Ｌ−トリプトファン製造のた
めの固定化生体触媒を、以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程に
より調製した。

（Ａ）キトサン−菌体懸濁液の調製： キトサン０．２５ｇに、０．１％酢酸溶液４５０戚およ
びピリドキサール−５゛−リン酸（トリプトファナーゼ
の補酵素）５０Ｂを添加して完全に溶解させ、　２Ｎ水
酸化ナトリウム溶液でｐｌＩ６．２±０．１に調整した
。

このキトサン溶液に蒸留水を加えて全体を５００ｍ１と
し、これをＡ液とした。

別に、キトサンＬｏｇを０．５％酢酸溶液６００ｉ１に
完全に溶解させ、　２Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６
，２±０．１に調整した。このキトサン溶液に蒸留水を
加えて全体を１１とし、これをＢ液とした。

プロテウス　レトゲリＩＦ０１３５０Ｈ）リプトファナ
ーゼ活性含有する）の湿菌体２５ｇを、生理食塩水２５
Ｉｌｄｌに懸濁させた。この懸濁液に上記Ａ液４５０ｕ
ｔｌを添加し、菌体が均一に分散するように攪拌した。

さらに、Ｂ液１１！、を添加して十分に攪拌し。

キトサン−菌体懸濁液を調製した。

（Ｂ）包括法による固定化ニ リン酸でｐＨ８，１±０．１に調整した１、５％トリポ
リリン酸ナトリウム溶液３１を入れたゲル化漕に。

（Ａ）工程で得られたキトサン−菌体）猿濁液をゆっく
りと攪拌しながら滴下した。滴下終了後、２時間放置し
、生成したビーズ状の固定化物をガラスフィルター上に
回収して蒸留水１２で洗浄した。

この工程は全て室温にて行い、約１８０ｇの凝集物（固
定化物）が得られた。

（Ｃ）乾燥： （Ｂ）工程で得られた固定化物をトレイに広げ。

真空乾燥器内に置き、　３０″（：　、　３ｍｍＨｇで
８時間乾燥した。この工程により乾燥固定化物１３ｇが
得られた。

（Ｄ）架橋剤による処理： 架橋剤としてグルタルアルデヒド１０ｍＭを含有するＯ
、　１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　１３Ｍ！に、（
Ｃ）工程で得られた乾燥固定化物を室温で３０分間浸漬
した。

その後、固定化物をガラスフィルターで濾過し。

蒸留水にてよく洗浄した。この工程により所望の固定化
生体触媒３８．２ｇが得られた。

（Ｅ）Ｌ−）リプトファンの調製： このようにして調製された固定化生体触媒を用いてＬ−
１−リプトファンの調製を行った。（Ｄ）項で得られた
固定化生体触媒０．５ｇを採り、基質液１０　ｄ（イン
ドール０．１０ｇ、ピルビン酸ナトリウム０．２７ｇ。

塩化アンモニウム０．５５ｇ　、　　ピリドキサール−
５゛−リン酸１ｍｇ　、およびトリトン０．０１ｇを含
有し、　６ＮＫＯＩＩでｐＨ８に調整した溶液）を添加
した。これを２０°Ｃで２４時間振盪して反応させたと
ころ、Ｌ−トリプトファンが０．１６ｇ生成した。この
固定化生体触媒を取り出して蒸留水にて洗浄した。この
固定化生体触媒を用いて同様の方法でＬ−１−リプトフ
ァンの調製を繰り返して行った。上記操作を３０回を繰
り返した後もし一トリプトファン生成量は変わらず、活
性が安定に保持されていることがわかった。操作中、こ
の固定化生体触媒の膨潤、破壊などの変化は全く認めら
れなかった。

実衡別１ 実施例１で調製された固定化生体触媒の水溶液中におけ
る安定性（微生物菌体または酵素のリークがないこと）
を確認するために、以下の実験を行った。

まず、実施例１で調製された固定化生体触媒１ｇを採り
、ピリドキサール−５゛−リン酸１■を含有する０、　
１Ｍリン酸緩衝液１０ｍ１を添加して２０°Ｃにて２４
時間振盪しながらインキュベーションを行った。その後
、このリン酸緩衝液を採取して調べたところ。

該緩衝液中には固定化生体触媒由来の微生物菌体は観察
されなかった。この緩衝液中のトリプトファナーゼ活性
を測定すると０．０１０／＋１であり、はとんど活性は
検出されなった。比較のために、上記固定化生体触媒に
含有されているのと同量の微生物菌体を同様のリン酸緩
衝液に懸濁し、超音波破砕した後に上清のトリプトファ
ナーゼ活性を測定したところ、　１０．５０／ｄであっ
た。

このように、実施例１で調製された固定化生体触媒は水
溶液中で安定であり、微生物菌体または酵素のリークが
ほとんどないことが確認された。

此１Ｎ辻１ 実施例１の乾燥工程（（Ｃ）工程）を省略して固定化生
体触媒を調製した。この固定化生体触媒の水溶液中にお
ける安定性を調べるために、実施例２と同様の実験を行
った。その結果、この固定化生体触媒の大半は崩壊した
。

比較±１ 実施例１の固定化生体触媒調製法におけるゲル化の工程
（（Ｂ）工程）で得られた固定化物（ビーズ状の凝集物
）Ｉｇを用いて、該固定化物の水溶液中における安定性
を調べるために、実施例２と同様の実験を行った。その
結果、微生物菌体自体のリークは観察されなかったが、
リン酸緩衝液中に０．４５［１＃＋ｆｆｉのトリプトフ
ァナーゼ活性が検出された。

上記固定化物に含有されているのと同量の微生物菌体を
同様のリン酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕した後に上清
のトリプトファナーゼ活性を測定したところ、　２　、
２１１　／　ｄであった。

（発明の効果） 本発明方法によれば、物理的強度に優れ、微生物菌体ま
たは酵素のリークがほとんどない良質の固定化生体触媒
が提供される。さらに９本発明方法により得られる固定
化生体触媒は２食品衛生上の安全性が高い材料を使用し
て調製されるので。

食品の製造や加工などに広く使用することが可能である
。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物菌体または酵素、およびキトサンを用いて固
   定化生体触媒を製造する方法であって、（１）微生物菌
   体または酵素、およびキトサンを含む溶液または懸濁液
   を、３〜６個の陰電荷を有するアニオンを生じ得る塩の
   水溶液中に滴下してビーズ状の凝集物を得ること； （２）該凝集物を乾燥させて乾燥物を得ること；および （３）該乾燥物をアルデヒド基を有する架橋剤溶液中に
   浸漬すること； を特徴とする固定化生体触媒の製造方法。