RO122364B1

RO122364B1 - Procedeu de imobilizare a tripsinei pe suport biopolimeric

Info

Publication number: RO122364B1
Application number: ROA200500923A
Authority: RO
Inventors: Luminiţa Tcacenco; Irina Lupescu; Eugenia Dumitra Teodor; Daniela Pomponiu
Original assignee: Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Pentru Ştiinţe Biologice
Priority date: 2005-10-31
Filing date: 2005-10-31
Publication date: 2009-04-30

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de imobilizare a tripsinei pe suport biopolimeric-chitosan în care, în vederea obţinerii de granule, se aplică entraparea enzimei 150...200 mg tripsina tip II S, din pancreas de suine (SIGMA), dizolvată în soluţie de chitosan (SIGMA) 1...1,5 g în tampon acid acetic-acetat de sodiu la pH=5,4, urmată de tratarea cu aldehidă glutarică (FLUKA) 0,375...0,5 g şi soluţie 3% de borohidrură de sodiu.

Description

Invenția se referă o metodă de imobilizare a tripsinei, enzimă din clasa serin proteazelor, pe suport biopolimeric, respectiv chitosan, un polizaharid poliaminic obținut prin Ndiacetilarea chitinei, în vederea utilizării ca biocatalizator atât în reacția de hidroliză proteică, cât și în reacția inversă, de sinteză dipeptidică, constând în entraparea enzimei în gel de chitosan și reticularea cu agent polifuncțional-aldehidă glutarică și tratarea cu un agent de reducere, rezultând un produs granular stabil, ușor de separat din mediul de reacție și ușor de manevrat.

Folosirea enzimelor ca biocatalizatori în sinteză chimică a constituit un succes al ultimelor decenii. în soluție, enzimele solubile se comportă ca orice substanță, adică se dispersează în solvent, având libertate completă de mișcare. Imobilizarea enzimelor poate fi considerată ca o tehnică specială, având ca scop restrângerea libertății de mișcare a enzimelor. Utilizarea unui catalizator enzimatic în formă imobilizată presupune realizarea procesului catalitic într-un sistem bifazic heterogen și permite separarea biocatalizatorului din mediul de reacție.

Sunt cunoscute o serie de metode generale de imobilizare a enzimelor pe suporturi insolubile, care sunt aplicate și în cazul tripsinei, și anume legarea ionică sau adsorbția, legarea covalentă, entraparea, microîncapsularea, reticularea. Acestea sunt însă condiționate de suporturile utilizate, precum și de forma de condiționare a imobilizatului sub formă de membrană, granule, gel etc.

Scopul invenției este acela de a obține un biocatalizator pe bază de tripsină imobilizată pe suport de chitosan, utilizabil în reacția de scindare sau de formare a legăturii dipeptidice.

Modul de acțiune se pare a fi următorul: agentul polifuncțional (aldehidă glutarică) inițiază reticularea chitosanului solubil în prezența tripsinei; resturile lisil ale acesteia participă la reacția de reticulare și se leagă covalent de polimerul chitosan.

Materialul reticulat cu o textură de gel este un polimer bază Schiff, care, prin tratare cu un agent de reducere NaH₄B, este redus și stabilizat, rezultând un produs sub formă de granule.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția este aceea că prin tratarea materialului reticulat cu textură de gel chitosan-tripsină cu un agent de reducere, și anume NaH₄B, biocatalizatorul se obține sub formă de granule, fără a fi necesară o fază suplimentară de prelucrare, constând în trirurarea acesteia pe dispozitive speciale.

Metoda conform invenției înlătură dezavantajele ce apar prin condiționarea materialului prin triturare, prin aceea că pierderile de biocatalizator sunt mult diminuate, prin faptul că granulele se forează în vasul de reacție și separarea lor este foarte ușoară.

în ceea ce privește tehnologia de imobilizare pentru obținerea tripsinei imobilizate pe chitosan, sub formă de granule, s-au folosit:

- 1-1,5 g chitosan (SIGMA) din carcasă de crab;

- 3,125 ml acid acetic 2M (ICCF);

- 75 ml apă bidistilată;

- 3,125 ml acetat de sodiu 1M (CHIMOPAR S.A.).

Chitosanul s-a dizolvat pe baie de apă (la 50°C), sub agitare continuă, pH-ul final al soluției fiind de 5,4.

La această soluție s-a adăugat 150-200 g tripsină tip II S, din pancreas de suine (SIGMA), dizolvată în 10 ml acid clorhidric 0,001 M, și apoi 7,5 ml glutaraldehidă 50% (FLUKA) dizolvată în 75 ml apă bidistilată. Amestecul rezultat s-a menținut timp de 30 min la temperatură scăzută (4-5°C), pentru formarea gelului, după care s-au adăugat 750 mg borohidrură de sodiu dizolvat în 25 ml apă bidistilată, timp de 15 min, sub agitare continuă și în gheață. Imobilizatul sub formă de granule s-a obținut încă de la începutul adiției borohidrurii de sodiu.

RO 122364 Β1

Imobilizatul granulat astfel obținut s-a separat din amestecul de reacție prin filtrare, după care s-a condiționat prin spălare cu apă bidistilată, tampon fosfat 0,5 M, pH=7, tampon fosfat pH=5,6 și, în final, din nou cu apă bidistilată.

S-au obținut 11,7116 g imobilizat tripsină-chitosan sub formă de granule (greutatea uscată a imobilizatului), cu 1079,23 U activitate totală, ceea ce reprezintă un randament de 90%.

Stabilitatea statică și operațională a biocatalizatorului obținut s-a evaluat prin determinarea influenței pH-ului, a temperaturii și a numărului de reutilizări asupra activității enzimatice a preparatului imobilizat. Activitatea biocatalizatorului s-a determinat în următoarele condiții standard:

1. substrat sintetic: clorhidrarul N^a-benzoil-DL-arginin-4-nitoanilidei (DL-ΒΑΡΑ, ales în conformitate cu specificitatea de substrat a tripsinei care hidrolizează legăturile peptidice în care este implicată L-lizina sau L-arginina, precum și grupele ester sau amidă);

2. concentrația substratului: 4 mM;

3. timp de reacție: 5 min;

4. agitare permanentă.

Principiul metodei

4-nitroanilină, produsul reacției de hidroliză enzimatică a N^a-benzoil-DL-arginin-4nitroanilidei la nivelul legăturii amidice, se determină spectofotometric prin măsurarea absorbției supernatantului prelevat din mediul de reacție, la 405 nm (lungimea de undă la care 4-nitroanilina prezintă absorbție maximă). Formula de calcul a activității enzimatice este următoarea:

ExV.xdil

A= -------?------9,62 x I x τ x c unde:

E = absobanță la X = 405 nm

V_p = volumul inițial al soluției analizate (ml) = 6 dil = diluția soluției prevăzute după digestie = 50

I = grosimea stratului absorbant (cm) = 1 τ = timpul de reacție (min.) = 5 c = cantitatea de preparat imobilizat, luată în analiză (g): 0,1

9,62 = coeficientul de extincție molară a 4-nitroanilinei (cnr/umoli).

Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelele 1,2, 3.

Rezultă că tripsina imobilizată pe chitosan prezintă un pH optim la valoarea 8, ca și enzima liberă, este stabilă la temperatură cuprinsă între 20-30’0, peste 40’C activitatea scade cu 51,5%, iar după 10 cicluri de reacție activitatea scade doar cu 10%.

Tabelul 1

Influența pH-ului de reacție asupra activității tripsinei imobilizate*

Nr. crt.	pH de reacție	Absorbanța Ă=405 nm	Activ, enz. (pmoli/min/g)
1.	8	0,515	32,12
2.	7,5	0,500	31,18
3.	7	0,470	29,31
4.	8,5	0,500	31,18

* temperatura de reacție = 25*C;

pH-urile de reacție s-au obținut cu ajutorul unor soluții tampon fosfat Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, de concentrație 0,2 M.

RO 122364 Β1

Tabelul 2

Influența temperaturii asupra activității tripsinei imobilizate*

Nr. crt.	Temperatura CC)	Absorbanța Ă=405 nm	Activ, enz. (pmoli/min/g)
1.	20	0,500	31,18
2.	25	0,515	32,12
3.	30	0,500	31,18
4.	35	0,450	28,06
5.	40	0,250	15,6

*pH-ul de reacție =8, obținut cu ajutorul tamponului Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ 0.2M

Tabelul 3

Comportarea tripsinei imobilizate la recirculări

Nr. cicluri de reacție	Data	Interval de timp (zile)	Absorbanța Ă=405 nm	Activ, enz. (pmoli/min/g)	Activitate remanentă (%)
1.	05.05.2005	-	0,515	32,12	100,00
2.	06.05.2005	1	0,498	31,05	96,66
3.	09.05.2005	4	0,464	28,93	90,06
4.	10.05.2005	5	0,441	27,50	85,61
5.	11.05.2005	6	0,424	26,44	82,32
6.	12.05.2005	7	0,405	25,25	78,61
7.	13.05.2005	8	0,385	24,00	74,72
8.	16.05.2005	11	0,365	22,80	71,00
9.	17.05.2005	12	0,352	21,95	68,34
10.	18.05.2005	13	0,335	20,89	65,04

După cum se poate observa, pe parcursul celor 10 cicluri de reacție, efectuate în timp de 13 zile, activitatea enzimatică a scăzut cu 35% față de valoarea prezentată în primul ciclu de reacție.

Claims

Revendicare

Procedeu de imobilizare a tripsinei pe suport biopolimeric-chitosan, caracterizat prin aceea că se aplică entraparea a 150-200 mg tripsină tip II S, din pancreas de suine, care apoi se dizolvă în soluție de chitosan 1-1,5 g în tampon acid acetic-acetat de sodiu la pH=5,4, urmată de tratarea cu aldehidă glutarică 0,375-0,5 g și soluție 3% de borohidrură de sodiu, obținându-se granule neuniforme, de culoare galben-maronie, transparente, asemănătoare chihlimbarului, de tripsină, imobilizate pe suport biopolimeric-citosan cu 92,17 U/g activitate, rezistență mecanică bună timp de 10 cicluri de reacție, pH optim 8 și stabilitate la temperatură cuprinsă între 2O...3O°C.