CN103352064A - 一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，包括如下步骤：将碱性蛋白酶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌，加入胰蛋白酶液，搅拌，静置，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液；将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的CaCl2-壳聚糖混合溶液中，硬化成球，过滤，烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠；配制玉米醇溶蛋白乙醇溶液，调节pH，加入复合载体固定化双酶凝胶珠，反应，过滤，滤液调pH，得到玉米蛋白活性肽液；制备过程简便，无毒，安全，复合载体固定化双酶凝胶珠极易分离、稳定性高，可重复利用，贮存酶活损失小，降解所得玉米蛋白肽生物活性高，玉米醇溶蛋白水解度优于游离酶降解所得水解度。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备玉米蛋白活性肽的方法，属于固定化酶技术应用领域。
背景技术
玉米醇溶蛋白是玉米加工主要副产物—玉米蛋白粉中的主要组成部分，约占68%,是一种结构特殊的蛋白质，其中的赖氨酸和色氨酸含量极少。由于含有高比例的非极性氨基酸残基，缺乏碱性、酸性氨基酸，使玉米醇溶蛋白不溶于水，加之其口感粗糙，因而限制了其在食品工业中的应用。
玉米肽是指玉米蛋白经蛋白酶降解后，再经分离、精制等过程得到的蛋白水解产物，它是由分子量小、活性高的短肽组成，富含谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸，这种特殊的氨基酸组成使玉米肽具有特殊的理化性质如粘度随温度变化不大、溶解性好、持水性高、酸性条件下不易凝聚、较强的乳化性和起泡性、稳定性好等和多种生物学功能如降血压、醒酒、消除疲劳、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等作用。因此玉米醇溶蛋白降解制备玉米肽成为研究热点。
目前，酶解法是制备玉米肽的主要生产方法。关于酶解法制备玉米肽的现有技术中多采用游离单一或游离复合酶及单一载体固定单一酶法（海藻酸钠为载体固定单一蛋白酶）。游离蛋白酶在有机介质中容易失活,且酶蛋白难以回收，不仅增加了制备过程的成本，且造成后续产物分离纯化困难，不能规模化应用在实际工业生产中；单酶水解（游离单一或单一载体固定单一酶法）玉米醇溶蛋白存在水解不充分、水解度低等问题；玉米醇溶蛋白属于高憎水蛋白，在水相中溶解度低，耗酶量大，且水解效率低；在海藻酸钠为载体固定单一蛋白酶技术中，利用海藻酸钠单一载体所得凝胶珠在含多价阴离子的溶液以及高浓度电解质溶液中不稳定，钙离子易脱落，凝胶变软，甚至溶解，海藻酸钠单一载体固定化酶所得凝胶珠稳定性差。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在40℃～50℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL胰蛋白酶液；在50～80℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=6.5～8.0的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为2%～3%的海藻酸钠溶液；
（2）按体积比为0.5～2:5的比例将碱性蛋白酶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌0.5～1h，加入胰蛋白酶液，搅拌0.5～1h，静置1～2h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液，所述胰蛋白酶液与所述碱性蛋白酶液的体积比为1:1～2；
（3）称取脱乙酰度≥90.0%的壳聚糖，以体积分数为0.5%～1%的乙酸水溶液为溶剂，在50℃～80℃水浴下溶解0.5～1h，配制得1.5g/mL壳聚糖溶液；按体积比为1:2～3的比例，将所述壳聚糖溶液和浓度为2g/mL的CaCl2水溶液混合，搅拌10～20min，静置20～40min，获得CaCl2-壳聚糖混合溶液；
（4）将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的步骤（3）获得的CaCl2-壳聚糖混合溶液中，硬化成球0.5～1.5h，过滤，水洗3～5次，40～50℃烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠，4℃冰箱保存备用；
（5）称取玉米醇溶蛋白放入体积浓度为75%～90%的乙醇水溶液中，于50～60℃水浴10～15min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成底物浓度为2.5～3.5g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为8.0～9.0，加入复合载体固定化双酶凝胶珠，在50～60℃下，反应20min～1h，过滤，将滤液调节pH为8.0～9.0，得到玉米蛋白活性肽液；所述玉米醇溶蛋白与复合载体固定化双酶凝胶珠的质量比为1:0.5～2。
所述步骤（1）优选为：用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在45℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL胰蛋白酶液；在60℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为2.5%的海藻酸钠溶液。
所述步骤（2）优选为：按体积比为1:5的比例将碱性蛋白酶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌1h，加入胰蛋白酶液，搅拌1h，静置2h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液，所述胰蛋白酶液与所述碱性蛋白酶液的体积比为1:1.5。
所述步骤（3）优选为：称取脱乙酰度≥90.0的壳聚糖，以体积分数为1%的乙酸水溶液为溶剂，在60℃水浴下溶解0.5h，配制得1.5g/mL壳聚糖溶液；按体积比为1:2.5的比例，将所述壳聚糖溶液和浓度为2g/mL的CaCl2水溶液混合，搅拌15min，静置30min，获得CaCl2-壳聚糖混合溶液。
所述步骤（4）优选为：将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的步骤（3）获得的CaCl2-壳聚糖混合溶液中，硬化成球1h，过滤，水洗4次，45℃烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠，4℃冰箱保存备用。
所述步骤（5）优选为：称取玉米醇溶蛋白放入体积浓度为85%的乙醇水溶液中，于55℃水浴10min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成底物浓度为3g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为8.5，加入复合载体固定化双酶凝胶珠，在55℃下，反应30min，过滤，将滤液调节pH为8.5，得到玉米蛋白活性肽液；所述玉米醇溶蛋白与复合载体固定化双酶凝胶珠的质量比为1:1。
本发明的优点：
本发明采用了海藻酸钠和壳聚糖两种酶载体进行复合，同时对碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行包埋共固定化，不仅发挥了作为天然高分子材料的海藻酸钠具有的安全、环保、酶固定化工艺优良等优势，壳聚糖原料易得、价格低廉、机械性能较好、化学性能稳定且具有可生物降解、固定化酶效率高等诸多优点，还可充分发挥碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合的优势提高玉米醇溶蛋白酶解效率；针对脂溶性玉米醇溶蛋白，于乙醇相中不仅保留酶活性，还可使底物充分溶解，大大提高酶解效率。本发明的用复合载体固定化双酶比游离酶对玉米醇溶蛋白水解度高，固定化酶与底物极易分离、稳定性高，酶可重复利用三次仍对玉米醇溶蛋白有较高的水解度，贮存五周后基本无酶活损失。本发明的方法降解所得玉米蛋白肽抗氧化性优于游离酶降解所得玉米蛋白肽。
本发明的方法制备过程简便，无毒，安全，酶解效率高，所得玉米肽生物活性高。
附图说明
图1为复合载体固定化双酶凝胶珠照片。
图2为复合载体固定化双酶凝胶珠贮存稳定性。
图3为复合载体固定化双酶凝胶珠重复使用稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明所采用的所有的原料均为商品，例如：
碱性蛋白酶：购于天津诺奥科技发展有限公司；
胰蛋白酶：购于天津诺奥科技发展有限公司；
玉米醇溶蛋白：购于高邮市日星药用辅料有限公司。
上述原料的介绍是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1
一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在45℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制成1mg/mL胰蛋白酶液；在70℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为2%的海藻酸钠溶液；
不同pH值的磷酸盐缓冲液均为0.2M的NaH2PO4·2H2O-Na2HPO4·12H2O溶液配制；
（2）将2.5mL碱性蛋白酶液加入到25mL海藻酸钠溶液中，搅拌1h，使碱性蛋白酶液被海藻酸钠溶液包埋，加入2.5mL胰蛋白酶液，搅拌1h，静置2h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液；
（3）称取脱乙酰度≥90.0%的壳聚糖，以体积分数为1%的乙酸水溶液为溶剂，在50℃水浴下溶解1h，配制得1.5g/mL壳聚糖溶液；按体积比为1:2.5的比例，将所述40mL壳聚糖溶液和100mL浓度为2g/mL的CaCl2水溶液混合，搅拌10min，静置20min，获得CaCl2-壳聚糖混合溶液；
（4）将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的步骤（3）获得的CaCl2-壳聚糖混合溶液中，硬化成球0.5h，过滤，水洗4次，50℃烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠，4℃冰箱保存备用；
（5）称取0.50g玉米醇溶蛋白放入体积浓度为85%的乙醇水溶液中，于55℃水浴10min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成底物浓度为3.3g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为8.50，加入1.00g复合载体固定化双酶凝胶珠，在55℃下，反应20min，过滤，将滤液用0.1M的NaOH水溶液调节pH为8.50，得到玉米蛋白活性肽液；根据消耗的氢氧化钠的量计算玉米醇溶蛋白水解度为65.78%。
实施例2
一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在50℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制成1mg/mL胰蛋白酶液；在65℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=6.5的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为3%的海藻酸钠溶液；
不同pH值的磷酸盐缓冲液均为0.2M的NaH2PO4·2H2O-Na2HPO4·12H2O溶液配制；
（2）将5mL碱性蛋白酶液加入到12.5mL海藻酸钠溶液中，搅拌45min，使碱性蛋白酶液被海藻酸钠溶液包埋，加入5mL胰蛋白酶液，搅拌0.5h，静置1h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液；
（3）称取脱乙酰度≥90.0%的壳聚糖，以体积分数为0.5%的乙酸水溶液为溶剂，在60℃水浴下溶解45min，配制得1.5g/mL壳聚糖溶液；按体积比为1:2.5的比例，将所述40mL壳聚糖溶液和100mL浓度为2g/mL的CaCl2水溶液混合，搅拌15min，静置20min，获得CaCl2-壳聚糖混合溶液；
（4）将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的步骤（3）获得的CaCl2-壳聚糖混合溶液中，硬化成球1h，过滤，水洗5次，45℃烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠，4℃冰箱保存备用；
（5）称取1.00g玉米醇溶蛋白放入体积浓度为90%的乙醇水溶液中，于50℃水浴15min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成底物浓度为3.5g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为8.50，加入1.5g复合载体固定化双酶凝胶珠，在50℃下，反应30min，过滤，将滤液用用0.1M的NaOH水溶液调节pH为8.50，得到玉米蛋白活性肽液；根据消耗的氢氧化钠的量计算玉米醇溶蛋白水解度为72.55%。
实施例3
一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在45℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL胰蛋白酶液；在60℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为2.5%的海藻酸钠溶液；
不同pH值的磷酸盐缓冲液均为0.2M的NaH2PO4·2H2O-Na2HPO4·12H2O溶液配制；
（2）按体积比为1:5的比例将碱性蛋白酶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌1h，加入胰蛋白酶液，搅拌1h，静置2h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液，所述胰蛋白酶液与所述碱性蛋白酶液的体积比为1:1.5
（3）称取脱乙酰度≥90.0%的壳聚糖，以体积分数为1%的乙酸水溶液为溶剂，在60℃水浴下溶解0.5h，配制得1.5g/mL壳聚糖溶液；按体积比为1:2.5的比例，将所述壳聚糖溶液和浓度为2g/mL的CaCl2水溶液混合，搅拌15min，静置30min，获得CaCl2-壳聚糖混合溶液；
（4）将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的步骤（3）获得的CaCl2-壳聚糖混合溶液中，硬化成球1h，过滤，水洗4次，45℃烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠，4℃冰箱保存备用；
（5）称取玉米醇溶蛋白放入体积浓度为85%的乙醇水溶液中，于55℃水浴10min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成底物浓度为3.0g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为8.5，加入复合载体固定化双酶凝胶珠，在55℃下，反应30min，过滤，将滤液用0.1M的NaOH水溶液调节pH为8.5，得到玉米蛋白活性肽液；所述玉米醇溶蛋白与复合载体固定化双酶凝胶珠的质量比为1:1。根据消耗的氢氧化钠的量计算玉米醇溶蛋白水解度为69.65%。
实施例4
一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在40℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL胰蛋白酶液；在50℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=8.0的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为2%的海藻酸钠溶液；
不同pH值的磷酸盐缓冲液均为0.2M的NaH2PO4·2H2O-Na2HPO4·12H2O溶液配制；
（2）按体积比为0.5:5的比例将碱性蛋白酶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌0.5h，加入胰蛋白酶液，搅拌0.5h，静置1h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液，所述胰蛋白酶液与所述碱性蛋白酶液的体积比为1:1；
（3）称取脱乙酰度≥90.0%的壳聚糖，以体积分数为0.5%的乙酸水溶液为溶剂，在50℃水浴下溶解1h，配制得1.5g/mL壳聚糖溶液；按体积比为1:2的比例，将所述壳聚糖溶液和浓度为2g/mL的CaCl2水溶液混合，搅拌10min，静置20min，获得CaCl2-壳聚糖混合溶液；
（4）将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的步骤（3）获得的CaCl2-壳聚糖混合溶液中，硬化成球0.5h，过滤，水洗3次，40℃烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠，4℃冰箱保存备用；
（5）称取玉米醇溶蛋白放入体积浓度为75%的乙醇水溶液中，于50℃水浴15min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成底物浓度为2.5g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为8.0，加入复合载体固定化双酶凝胶珠，在50℃下，反应1h，过滤，将滤液用0.1M的NaOH水溶液调节pH为8.0，得到玉米蛋白活性肽液；所述玉米醇溶蛋白与复合载体固定化双酶凝胶珠的质量比为1:0.5。根据消耗的氢氧化钠的量计算玉米醇溶蛋白水解度为62.94%。
实施例5
一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在50℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL胰蛋白酶液；在80℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=6.5的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为3%的海藻酸钠溶液；
不同pH值的磷酸盐缓冲液均为0.2M的NaH2PO4·2H2O-Na2HPO4·12H2O溶液配制；
（2）按体积比为2:5的比例将碱性蛋白酶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌1h，加入胰蛋白酶液，搅拌1h，静置2h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液，所述胰蛋白酶液与所述碱性蛋白酶液的体积比为1:2；
（3）称取脱乙酰度≥90.0%的壳聚糖，以体积分数为1%的乙酸水溶液为溶剂，在80℃水浴下溶解0.5h，配制得1.5g/mL壳聚糖溶液；按体积比为1:3的比例，将所述壳聚糖溶液和浓度为2g/mL的CaCl2水溶液混合，搅拌20min，静置40min，获得CaCl2-壳聚糖混合溶液；
（4）将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的步骤（3）获得的CaCl2-壳聚糖混合溶液中，硬化成球1.5h，过滤，水洗5次，50℃烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠，4℃冰箱保存备用；
（5）称取玉米醇溶蛋白放入体积浓度为90%的乙醇水溶液中，于60℃水浴10min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成底物浓度为3.5g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为9.0，加入复合载体固定化双酶凝胶珠，在60℃下，反应20min，过滤，将滤液用0.1M的NaOH水溶液调节pH为9.0，得到玉米蛋白活性肽液；所述玉米醇溶蛋白与复合载体固定化双酶凝胶珠的质量比为1:2。根据消耗的氢氧化钠的量计算玉米醇溶蛋白水解度为64.81%。
实施例6
按照实施例1中步骤（5）条件用游离双蛋白酶对玉米醇溶蛋白进行酶解：
称取0.50g玉米醇溶蛋白放入体积浓度为85%的乙醇水溶液中，于55℃水浴10min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成浓度为3.3g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为8.50，先后加入2.00mg碱性蛋白酶粉和2.00mg胰蛋白酶粉，在55℃下，反应20min后转移至95℃水浴下灭酶10min，调节pH为8.50，得到玉米蛋白活性肽，根据消耗的碱量计算玉米醇溶蛋白水解度为52.24%；
表1经本方法所得粗肽液与经游离酶所得粗肽液生物活性比较
由各实施例结果可以看出，本发明所制得玉米蛋白活性肽液水解度较游离酶酶解玉米醇溶蛋白所得玉米蛋白活性肽液水解度高，且所得玉米蛋白活性肽液生物活性高。
经本发明实施例1步骤（4）获得的复合载体固定化双酶凝胶珠强度较大，极易成球且不易变形，见图1。实施例2-5步骤（4）获得的复合载体固定化双酶凝胶珠的照片显示，与图1相似。
同时本发明人以实施例2步骤（4）所获得的复合载体固定化双酶凝胶珠稳定性进行了研究，试验结果见图2、图3。由图2可以看出复合载体固定化双酶凝胶珠在保存五周后基本无酶活损失，由图3可以看出，本方法所得复合载体固定化双酶凝胶珠在重复利用三次后对玉米醇溶蛋白的水解度仍然较高。
Claims (6)
1.一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，其特征是包括如下步骤：
（1）用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在40℃～50℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL胰蛋白酶液；在50～80℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=6.5～8.0的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为2%～3%的海藻酸钠溶液；
（2）按体积比为0.5～2:5的比例将碱性蛋白酶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌0.5～1h，加入胰蛋白酶液，搅拌0.5～1h，静置1～2h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液，所述胰蛋白酶液与所述碱性蛋白酶液的体积比为1:1～2；
（3）称取脱乙酰度≥90.0%的壳聚糖，以体积分数为0.5%～1%的乙酸水溶液为溶剂，在50℃～80℃水浴下溶解0.5～1h，配制得1.5g/mL壳聚糖溶液；按体积比为1:2～3的比例，将所述壳聚糖溶液和浓度为2g/mL的CaCl2水溶液混合，搅拌10～20min，静置20～40min，获得CaCl2-壳聚糖混合溶液；
（4）将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的步骤（3）获得的CaCl2-壳聚糖混合溶液中，硬化成球0.5～1.5h，过滤，水洗3～5次，40～50℃烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠，4℃冰箱保存备用；
（5）称取玉米醇溶蛋白放入体积浓度为75%～90%的乙醇水溶液中，于50～60℃水浴10～15min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成底物浓度为2.5～3.5g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为8.0～9.0，加入复合载体固定化双酶凝胶珠，在50～60℃下，反应20min～1h，过滤，将滤液调节pH为8.0～9.0，得到玉米蛋白活性肽液；所述玉米醇溶蛋白与复合载体固定化双酶凝胶珠的质量比为1:0.5～2。
2.根据权利要求1所述的一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，其特征是所述步骤（1）为：用pH=10的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL碱性蛋白酶液；在45℃水浴条件下，用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制1mg/mL胰蛋白酶液；在60℃水浴、搅拌条件下，将海藻酸钠加入到pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，使海藻酸钠充分溶解，配成质量分数为2.5%的海藻酸钠溶液。
3.根据权利要求1所述的一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，其特征是所述步骤（2）为：按体积比为1:5的比例将碱性蛋白酶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌1h，加入胰蛋白酶液，搅拌1h，静置2h，获得包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液，所述胰蛋白酶液与所述碱性蛋白酶液的体积比为1:1.5。
4.根据权利要求1所述的一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，其特征是所述步骤（3）为：称取脱乙酰度≥90.0的壳聚糖，以体积分数为1%的乙酸水溶液为溶剂，在60℃水浴下溶解0.5h，配制得1.5g/mL壳聚糖溶液；按体积比为1:2.5的比例，将所述壳聚糖溶液和浓度为2g/mL的CaCl2水溶液混合，搅拌15min，静置30min，获得CaCl2-壳聚糖混合溶液。
5.根据权利要求1所述的一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，其特征是所述步骤（4）为：将包有双蛋白酶液的海藻酸钠溶液逐滴滴入到不断搅拌下的步骤（3）获得的CaCl2-壳聚糖混合溶液中，硬化成球1h，过滤，水洗4次，45℃烘干，得到复合载体固定化双酶凝胶珠，4℃冰箱保存备用。
6.根据权利要求1所述的一种用复合载体固定化双酶制备玉米蛋白活性肽的方法，其特征是所述步骤（5）为：称取玉米醇溶蛋白放入体积浓度为85%的乙醇水溶液中，于55℃水浴10min，使玉米醇溶蛋白溶解，配成底物浓度为3.0g/mL的玉米醇溶蛋白液，调节pH为8.5，加入复合载体固定化双酶凝胶珠，在55℃下，反应30min，过滤，将滤液调节pH为8.5，得到玉米蛋白活性肽液；所述玉米醇溶蛋白与复合载体固定化双酶凝胶珠的质量比为1:1。
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