CN107937461A - 一种大分子多肽制备过程中的蛋白酶自灭活方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大分子多肽制备过程中的蛋白酶自灭活方法，属于蛋白质酶解领域。具体为取一定量蛋白，加溶剂、预热和调节pH，使其完全溶解，加入低剂量的蛋白酶(与预定的水解度相匹配)，维持pH值和温度恒定，使反应到预定水解度时蛋白酶也达到失活状态(酶活为原蛋白酶酶活的0.5％以下)，即可结束酶解反应，无需酶解反应结束高温灭酶工序。

Description

一种大分子多肽制备过程中的蛋白酶自灭活方法
技术领域
本发明涉及蛋白质酶解领域，特指制备大分子功能多肽酶解过程中蛋白酶自灭活的方法。
技术背景
为了实现蛋白资源的高值化利用，大多采用蛋白酶解制备多肽的方法。该方法制备的多肽具有安全、营养、易吸收、功能性强等优点，受到了各行业的高度关注，其产品已广泛应用于药品、保健品以及化妆品等领域。在酶解法制备多肽过程中，酶解结束后迅速灭酶是非常关键的实验步骤，酶解产物的生物活性通常与蛋白的水解度高度相关，只有在特定的水解度迅速灭酶后才能保证酶解产物具有最佳活性。一般情况下，蛋白酶在低浓度环境中，会发生缓慢自动失活现象，因此蛋白酶需要储存在高浓度环境中，以达到减少其酶活丧失的目的。在常规酶解过程中，蛋白酶的浓度相对较高，酶解反应结束时，酶活还维持较高水平，需要灭酶工序。传统的灭酶方法采用沸水浴(热蒸汽)灭酶，灭酶之后，冷却再离心。该方法一方面需要消耗大量的能量，另一方面灭酶时间长不能有效保证最佳产物活性，同时一些具有生物活性的热敏性物质会在灭酶时损失。
目前酶解法制备的活性肽分为小分子多肽和大分子多肽。小分子多肽的制备策略为，在体外完成整个酶解过程，服用后期望直接被肠道吸收。大分子多肽的制备策略为，充分利用胃肠消化对多肽的酶解作用，在体外只对蛋白进行低程度酶解，并将大部分的酶解过程转移至体内进行，这样使得体外制备的低水解度大分子多肽，在体内消化酶的作用下形成类似传统小分子多肽，再被肠道快速吸收发挥其生理功能。由于大分子多肽制备策略中蛋白质只需要低程度的水解，可以采用两种方案实现，一种为采用普通加蛋白酶量进行短时间的酶解，另一种为采用低加蛋白酶量进行长时间酶解。而后一种方案由于加酶量较低，可以有效降低成本，具有很大的应用前景，同时结合低浓度酶经长时间酶解会发生自动失活的现象，在预定的蛋白水解度下，合理选择加酶量，理论上可以实现大分子制备过程中，蛋白酶解反应结束(蛋白质水解度达到预定值)时蛋白酶自灭活(蛋白酶失活为无酶活状态)的目的，以期省去高温灭酶的步骤，这方面的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺陷，提供一种适用于大分子多肽制备过程中灭酶的方法，旨在实现蛋白酶解结束(蛋白质水解度达到预定值)后，蛋白酶自动失活，显著降低大分子多肽的制备成本的目的。
为了实现上述发明目的，其具体的技术方案如下：
取一定量蛋白，进行可溶化处理，使其完全溶解，加入低剂量蛋白酶(与预定的水解度相匹配)，维持pH值和温度恒定，使反应到预定水解度时蛋白酶也达到失活状态(酶活为原蛋白酶酶活的0.5％以下)，即可结束酶解反应(无需额外灭酶过程)，干燥。
其中上述的蛋白，包括且不局限于牛奶蛋白、蛋清蛋白和玉米醇溶蛋白。
其中上述的可溶化处理，包括且不局限于调节溶剂极性、温度或pH。
其中上述的干燥，可以采用喷雾干燥，可使得酶解产物的中蛋白酶酶活进一步降低。
其中牛奶大分子多肽制备中蛋白酶自灭活方法，按照下述步骤进行：取牛奶(蛋白浓度34g/L)，50℃水浴预热10min，调节pH至7.0，加入160-650U/g(E/S)中性蛋白酶进行酶解，在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到一定水解度(10％-20％)，酶解即可结束，干燥。
其中蛋清大分子多肽制备中蛋白酶自灭活方法，按照下述步骤进行：取蛋清，加水配成蛋白浓度为30g/L，50℃水浴预热10min，调节pH至8.0，加入300-1400U/g(E/S)碱性蛋白酶进行酶解，在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到一定水解度(5％-15％)，酶解即可结束，干燥。
其中玉米大分子多肽制备中蛋白酶自灭活方法为，按照下述步骤进行：用60％的乙醇溶解玉米醇溶蛋白，缓慢加入水，将溶液的乙醇浓度稀释为20％(在此乙醇溶度下，玉米醇溶蛋白需很长时间才能析出，同时胰酶也可以保持较高酶活)。快速用未析出蛋白沉淀的玉米醇溶蛋白于40℃水浴预热10min，调节pH至8.0，加入110-360U/g(E/S)胰酶进行酶解，在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到一定水解度(5％-15％)，酶解即可结束，旋转蒸发掉乙醇后，干燥。
其中上述的U定义为指1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1U。
本发明的优点：本发明在酶解反应体系中只加入了低剂量的蛋白酶，使反应到预定水解度时蛋白酶自动失活(蛋白酶活性小于原始活性的0.5％)，克服了多肽制备时的常用高温灭酶工艺而导致能耗高的不足。利用大分子制备过程中的蛋白酶自灭活方法，可以省去高温灭酶的步骤，大幅降低能耗，显著降低多肽的制备成本。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是，对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
对照和实施例中酶活测定方法参考国标GB/T 23527—2009附录B。
对照和实施例中的中性蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶、玉米醇溶蛋白购于Sigma公司。
对照和实施例中的牛奶为光明优倍巴氏杀菌鲜牛奶，蛋白含量34g/L，脂肪含量0％。
对照和实施例中蛋清来源于鸡蛋(市售)，取鸡蛋蛋清，1:1加水稀释，离心，再加水稀释至蛋白浓度为30g/L。
对照和实施例中1U定义为指1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸。
对照例1
取34g/L的牛奶400mL，50℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至7.0，加入680μL的中性蛋白酶(活性2.01×105U/mL)进行酶解，在整个酶解过程中不断滴加1mol/LNaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为10％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的96.2％。
对照例2
取34g/L的牛奶400mL，50℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至7.0，加入680μL的中性蛋白酶(活性2.01×105U/mL)进行酶解，在整个酶解过程中不断滴加1mol/LNaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为17％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的93.1％。
对照例3
取30g/L的蛋清400mL，50℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至8.0，加入600μL的碱性蛋白酶(活性2.57×105U/mL)进行酶解，在酶解过程中不断滴加1mol/L NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为6％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的94.5％。
对照例4
取30g/L的蛋清400mL，50℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至8.0，加入600μL的碱性蛋白酶(活性2.57×105U/mL)进行酶解，在酶解过程中不断滴加1mol/L NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为15％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的93.8％。
对照例5
称取6.75g的玉米醇溶蛋白溶解于150mL 60％的乙醇溶液中，边搅拌边缓慢加入300mL蒸馏水，配制成15g/L的玉米醇溶蛋白450mL，40℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至8.0，加入337.5mg的胰酶(活性1.09×105U/g)进行酶解，在酶解过程中不断滴加1mol/L NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为5％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的95.6％。
对照例6
称取6.75g的玉米醇溶蛋白溶解于150mL 60％的乙醇溶液中，边搅拌边缓慢加入300mL蒸馏水，配制成15g/L的玉米醇溶蛋白450mL，40℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至8.0，加入337.5mg的胰酶(活性1.09×105U/g)进行酶解，在酶解过程中不断滴加1mol/L NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为12％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的93.7％。
实施例1
取34g/L的牛奶400mL，50℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至7.0，加入12μL的中性蛋白酶(活性2.01×105U/mL)进行酶解，在酶解过程中不断滴加1mol/L NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为10％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的0.15％。
实施例2
取34g/L的牛奶400mL，50℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至7.0，加入45μL的中性蛋白酶(活性2.01×105U/mL)进行酶解，在酶解过程中不断滴加1mol/L NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为20％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的0.23％。
实施例3
取30g/L的蛋清400mL，50℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至8.0，加入15μL的碱性蛋白酶(活性2.57×105U/mL)进行酶解，在酶解过程中不断滴加1mol/L NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为5％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的0.17％。
实施例4
取30g/L的蛋清400mL，50℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至7.0，加入66μL的碱性蛋白酶(活性2.57×105U/mL)进行酶解，在酶解过程中不断滴加1mol/L NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为15％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的0.29％。
实施例5
称取6.75g的玉米醇溶蛋白溶解于150mL 60％的乙醇溶液中，边搅拌边缓慢加入300mL蒸馏水，配制成15g/L的玉米醇溶蛋白450mL，40℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至8.0，加入7mg的胰酶(活性1.09×105U/g)进行酶解，在酶解过程中不断滴加1mol/L NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为5％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的0.28％。
实施例6
称取6.75g的玉米醇溶蛋白溶解于150mL 60％的乙醇溶液中，边搅拌边缓慢加入300mL蒸馏水，配制成15g/L的玉米醇溶蛋白450mL，40℃水浴预热10min，加入4mol/L NaOH调节pH至8.0，加入22mg的胰酶(活性1.09×105U/g)进行酶解，在酶解过程中不断滴加1mol/L NaOH维持pH恒定，水浴温度恒定。反应到水解度为15％，酶解结束，此时酶解液中蛋白酶活性为原始活性的0.37％。

Claims (6)

1.一种大分子多肽制备过程中的蛋白酶自灭活方法，其特征在于：对蛋白进行可溶化处理，使其完全溶解，加入低剂量蛋白酶，维持pH值和温度恒定，使反应到预定水解度时蛋白酶也达到失活状态(酶活为原蛋白酶酶活0.5％以下)，即可结束酶解反应，无需额外灭酶过程。
2.根据权利要求1所述的一种大分子多肽制备过程中的蛋白酶自灭活方法，其特征在于包括且不局限于牛奶蛋白、蛋清蛋白、玉米醇溶蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种大分子多肽制备过程中的蛋白酶自灭活方法，其特征在于包括且不局限于调节溶剂极性、温度或pH。
4.根据权利要求1所述的一种大分子多肽制备过程中的蛋白酶自灭活方法，其特征在于按照下述步骤进行：取牛奶蛋白，50℃水浴预热10min，调节pH至7.0，加入160-650U/g(E/S)中性蛋白酶进行酶解，在酶解过程中维持pH和温度恒定；反应到一定水解度(10％-20％)，酶解即可结束，干燥。
5.根据权利要求1所述的一种大分子多肽制备过程中的蛋白酶自灭活方法，其特征在于按照下述步骤进行：取蛋清蛋白，50℃水浴预热10min，调节pH至8.0，加入300-1400U/g(E/S)碱性蛋白酶进行酶解，在酶解过程中维持pH和温度恒定；反应到一定水解度(5％-15％)，酶解即可结束，干燥。
6.根据权利要求1所述的一种大分子多肽制备过程中的蛋白酶自灭活方法，其特征在于按照下述步骤进行：用60％的乙醇溶解玉米醇溶蛋白，缓慢加入水，将溶液的乙醇浓度稀释为20％；取玉米醇溶蛋白，40℃水浴预热10min，调节pH至8.0，加入110-360U/g(E/S)胰酶进行酶解，在酶解过程中维持pH和温度恒定；反应到一定水解度(5％-15％)，酶解即可结束，旋转蒸发掉乙醇后，干燥。
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