CN104894199A - 一种酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备方法，特别涉及一种酵母细胞短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法，该方法以酿酒酵母为原料，首先对酵母菌体多次离心洗净，洗净后的菌体分散调浆，进行酶解自溶，离心，取上清喷雾干燥制备酵母短肽，沉淀进行高温抽提制备甘露聚糖和β-葡聚糖；高温抽提后离心可以得到上清液和沉淀两部分；上清液经过浓缩、醇沉、干燥得到甘露聚糖；下层沉淀经过高速分散、酶解和高压微射流均质处理得到β-葡聚糖，所采用的制备条件温和，不采用强酸、强碱和有机溶剂等对环境有害的试剂，且可实现产业化规模生产。

Description

一种酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法

技术领域

本发明涉及制备方法，特别涉及一种酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种含有丰富营养物质的工业副产物，含有50％左右的蛋白质，人体必需的八种氨基酸含量均很高。酿酒酵母细胞壁中含有25％～35％的多糖，主要为β-葡聚糖(约29％)和甘露聚糖(约31％)(Bacon et al，1969；Fleet et al，1976；Kath et al，1999)，其中，β-葡聚糖的主要生理功能是维持细胞壁的结构，保持细胞正常的生理形态；而甘露聚糖则主要负责细胞识别和与环境的交互作用，决定酵母的免疫特性(Ruiz-Herrera，1992)。

酵母蛋白氨基酸比例协调，用蛋白酶酶解酵母蛋白可以获得具有高生物活性的短肽制品；β-葡聚糖位于细胞壁的最内层，而甘露聚糖存在于酵母细胞壁外层，二者通过蛋白质连接构成酵母细胞壁的基本组成。β-葡聚糖由β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖组成(葡萄糖残基通过β-1,3-糖苷键和β-1,6-糖苷键组成(刘红芝等，2006)，两者比例为85:15，以β-1,3-糖苷键为骨架，β-1,6-糖苷键为支链，并且β-1,6-葡聚糖的还原端连接到β-1,3-葡聚糖非还原端的末端葡萄糖上，在氢键作用下共同形成一个三维网络结构；甘露聚糖相对分子质量主要分布在20000～200000(刘红芝等，2008)间，由α-甘露糖以α-1,6糖苷键形成主链，并联结以α-1,2糖苷键和α-1,3糖苷键连接的数目不等的甘露糖侧链(Cabib et al，1982)，其中一些侧链结合有一些可能是酵母细胞抗原决定部位的基团，并且甘露聚糖携带一个分子量大概为100kDa的蛋白。

酿酒酵母短肽的制备方法主要采用酸水解法、碱水解法和酶法等。其中，蛋白质酸水解会造成某些氨基酸的损失，产生的蛋白质衍生物包含非天然结构，或不能被人体代谢，甚至可能产生抑制作用和毒性；而蛋白质经碱水解处理，会导致其中的氨基酸发生消旋作用，使必需氨基酸的L-对映体减少和消化率降低，并产生有毒的D-氨基酸。而酶法制备酿酒酵母短肽主要采用碱性蛋白酶，其在调节pH的过程会大量引入盐离子，影响产品纯度；为提高产品纯度需对肽产品进行脱盐处理，操作周期长且需要增加设备投入。

酵母细胞壁甘露聚糖的分离提取方法包括酸法、碱法、酶法及热水浸提法等。其中，酸法会导致所得产品的蛋白含量较高，且甘露聚糖在酸性条件下容易发生水解；碱法使用大量碱液，既会导致甘露聚糖降解又会污染环境；酶法提取所得产品的蛋白含量较高，纯度较低，需进一步纯化处理；热水浸提所得产品的纯度较低，如果在浸提过程中加入氯化钠，会导致产品盐离子含量升高。

酿酒酵母细胞壁β-葡聚糖的制备方法主要有物理法(如超声)、化学法(如酸法、碱法和酸碱法)和生物法(如酶法)。其中，物理法所得产品纯度较低，需要与其他方法结合以提高纯度；化学法需要大量使用酸碱，所得产品纯度较低，且会对葡聚糖的结构造成损失，进而破坏其生理活性；而由于生物方法作用手段温和，需要与其它方法结合使用来提高所制备的酵母葡聚糖的纯度。

酵母短肽因很好地保留了啤酒酵母原有的营养和功能成分，可作为功能性保健品原料而用于食品、医药及饲料行业。β-葡聚糖和甘露聚糖作为主要的酵母细胞壁多糖具有多种功能活性，如免疫增强功能、抗辐射和抗氧化功能以及霉菌吸附功能。发明一种酵母细胞短肽与细胞壁多糖的绿色同步制备技术，不仅可以充分利用我国的酵母资源，还可以进一步开发具备高功能活性的酵母短肽和多糖产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法。

为达到上述目的，具体采用如下的技术方案：

一种酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法，包括如下步骤：

(1)将酿酒酵母加入去离子水中得到悬浮液，向所述悬浮液中加入中性蛋白酶进行酶解自溶，灭酶活后离心，得到上清a和沉淀a；

(2)将所述上清a经干燥后，即得酵母短肽；

(3)向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得沉淀a1，然后向沉淀a1中加入去离子水得到悬浮液，所述悬浮液抽提后离心，得到上清b和沉淀b；

(4)将所述上清b浓缩，向所述浓缩后的上清b中加入乙醇进行醇沉，离心后得沉淀，所述沉淀经干燥后即得酵母细胞壁甘露聚糖；

(5)向所述沉淀b中加入去离子水得到悬浮液，将所述悬浮液高速分散，将经高速分散后的悬浮液进行酶解处理，灭酶后得酶解液，然后进行高压微射流处理，离心后得沉淀，所述沉淀采用无水乙醇脱水后，经干燥即得酵母细胞壁β-葡聚糖。

具体的，步骤(1)中，酿酒酵母与去离子水的体积比为1：4～6。

为了充分酶解酿酒酵母细胞得到细胞壁，步骤(1)中性蛋白酶的用量为200～300U/g，采用酶解进行诱导自溶时，酶解自溶的温度为40～60℃，时间为20～30h，pH值为6.0～8.0(优选为7.0)。

具体的，所述中性蛋白酶选自Neutrase或/和Flavorzym。

步骤(3)的具体操作步骤为：向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得到沉淀a1，然后按质量比1：3～10向沉淀a1中加去离子水得到悬浮液，对所述悬浮液在90～100℃的条件下高温抽提3～6h，抽提结束后进行离心处理，分别得上清b和沉淀b。

所述离心处理的离心转速为4000～5000rpm，离心时间为10～20min；优选地，离心转速为4500rpm，离心时间为10min。

为了提高糖浓度，增强乙醇与糖的结合从而使糖完全沉淀，步骤(4)中，所述浓缩后的上清b为浓缩前上清b体积的1/5～1/3；步骤(4)中，所述加入乙醇进行醇沉的步骤为：先用体积分数为50％～75％的乙醇进行沉淀，采用去离子水复溶，复溶后再次使用60％～80％的乙醇进行沉淀。

为了彻底分散沉淀b，使其与酶充分反应，提高高压微射流均质效果，步骤(5)的具体操作步骤为：按质量比1：4～6向所述沉淀b中加入去离子水得到悬浮液；采用高速分散器，在6000～8000rpm的条件下处理5～10min，得高速分散悬浮液，将所述高速分散悬浮液加入蜗牛酶或中性蛋白酶Neutrase进行酶解，酶的添加量为所述沉淀b质量的0.02％～0.05％，在35～55℃的条件下酶解1～3h，灭酶后得酶解液，所述酶解液在压力100～200MPa和处理流量为20～200mL/min的条件下，高压微射循环处理3～6次，离心后得沉淀，所述沉淀采用无水乙醇脱水后，经干燥即得酵母β-葡聚糖。

步骤(4)和步骤(5)干燥的温度均为40～65℃。

本申请中灭酶活处理为本领域的常规技术手段，具体的，灭酶活的温度可为90℃，时间为10min。

本发明提供的制备方法以酿酒酵母为原料，首先对酵母菌体多次离心洗净，洗净后的菌体分散调浆，进行酶解自溶，离心，取上清喷雾干燥制备酵母短肽，沉淀进行高温抽提制备β-葡聚糖和甘露聚糖；高温抽提后离心可以得到上清液和沉淀两部分；上清液经过浓缩、醇沉、干燥得到甘露聚糖；下层沉淀经过高速分散、酶解和高压微射流均质处理得到β-葡聚糖，本发明制得的产品纯度高(短肽、β-葡聚糖、甘露聚糖的纯度均大于90％)，所采用的制备条件温和，不采用强酸、强碱和有机溶剂等对环境有害的试剂，且可实现产业化规模生产。而且本发明可实现工业副产物废啤酒酵母的综合利用，增加工业副产物的利用率和附加价值，具有重大的经济效益和环保意义。

利用本发明的制备方法得到的产品方面具有以下优点：酵母细胞壁短肽具有抗氧化活性，在1mg/mL浓度时，DPPH清除率达49.94％。

酵母细胞壁葡聚糖具有增强免疫的功效，在150mg/kg.d剂量时可以显著增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化率，吸光度值为0.68，是空白对照组的2.20倍；在150mg/kg.d剂量时，小鼠NK细胞的杀伤率为69.32％。

酵母细胞壁甘露聚糖具有增强免疫力、抑制肿瘤活性的功效。在50mg/kg.d剂量时可以显著增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化率，吸光度值为0.76，是空白对照组的1.84倍，50mg/kg.d剂量时可以显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬功能，吞噬百分率为20.35％；具有直接抑制HL-60肿瘤细胞生长的作用，在1.58mg/mL时能够抑制50％的HL-60肿瘤细胞。

附图说明

图1为酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法的流程示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的酵母细胞壁购自浙江深友生物技术有限公司。

实施例1：酵母多糖和短肽的制备

本实施例中酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法包括以下步骤：

(1)酿酒酵母用去离子水洗涤后离心去除杂质，按体积比1：6加去离子水配制成悬浮液a，向所述悬浮液a中按加酶量200U/g加入中性蛋白酶Neutrase，置于pH7.0和55℃的条件下在恒温去离子水浴振荡器中酶解自溶20h，然后升温至90℃，保温10min灭酶，离心，分别得到上清a和沉淀a；

(2)采用喷雾干燥对步骤(1)中所得上清a进行干燥即得到酵母短肽；

(3)向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得到沉淀a1，然后按质量比1：6(沉淀a1与去离子水的质量比为1：6)向沉淀a1中加去离子水得到悬浮液，对所述悬浮液在90℃的条件下高温抽提3.5h，离心，分别得上清b和沉淀b；

(4)对步骤(3)中所得上清b在70℃下进行3倍浓缩(即所述浓缩液后的体积为上清b的1/3)，所得到的浓缩液先用体积分数为50％的乙醇进行沉淀，采用去离子水复溶，然后使用75％体积分数的乙醇醇沉得沉淀，将所述沉淀置于65℃的鼓风干燥箱中烘干，粉碎即得到酵母甘露聚糖；

(5)对步骤(3)中所得沉淀b用去离子水洗3次去除杂质，再以质量比1：6(沉淀b与去离子水的质量比为1：6)加去离子水配制成悬浮液，采用高速分散器在8000rpm条件下处理5min，得高速分散悬浮液，然后在高速分散悬浮液中加入蜗牛酶进行酶解，酶的添加量为所述沉淀b质量的0.02％，于45℃酶解3h，升温至90℃，保温10min进行灭酶处理；灭酶后的酶解液在压力200MPa和处理流速150mL/min下循环处理3次，离心后得沉淀；将所述沉淀用无水乙醇溶液脱水，然后在鼓风干燥箱中于65℃的条件下烘干，粉碎即得到酵母β-D-葡聚糖。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽含量为92.29％；β-葡聚糖为乳白色粉末，β-葡聚糖含量为94.89％；酵母甘露聚糖为白色粉末，甘露聚糖含量为94.60％。

实施例2

本实施例中酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法包括以下步骤：

(1)酿酒酵母用去离子水洗涤后离心去除杂质，按体积比1：4加去离子水配制成悬浮液a，按加酶量200U/g加入中性蛋白酶Neutrase，置于pH 7.0和55℃的条件下酶解自溶24h，升温至90℃，保温10min灭酶，离心，分别得上清a和沉淀a；

(2)采用喷雾干燥对步骤(1)中所得上清a进行干燥即得到酵母短肽；

(3)向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得到沉淀a1，然后按质量比1：4(沉淀a1与去离子水的质量比为1：4)向沉淀a1中加去离子水得到悬浮液，对所述悬浮液在95℃的条件下高温抽提3.0h，离心，分别得上清b和沉淀b；

(4)对步骤(3)中所得上清b在70℃下进行5倍浓缩(即所述浓缩后的体积为上清b的1/5)，得浓缩液，所得到的浓缩液先用70％乙醇进行沉淀，复溶后使用相同积分数的乙醇醇沉，离心后得到沉淀，对所述沉淀置于65℃鼓风干燥箱中烘干，粉碎即得到酵母甘露聚糖；

(5)对步骤(3)中所得沉淀b用去离子水洗3次去除杂质，再以质量比1：4(沉淀b与去离子水的质量比为1：4)加去离子水配制成悬浮液，再将所述悬浮液采用高速分散器在6000rpm条件下处理10min，得高速分散悬浮液；然后在高速分散悬浮液中加入中性蛋白酶Neutrase进行酶解，酶的添加量为所述沉淀b质量的0.05％，于50℃的恒温去离子水浴振荡器中酶解2h，升温至90℃，保温10min进行灭酶活处理；灭酶后的酶解液在压力150MPa和处理流速200mL/min下循环处理6次，离心后得沉淀，将所述沉淀用无水乙醇溶液脱水后，置于鼓风干燥箱中于50℃条件下烘干粉碎即得到酵母β-葡聚糖。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽纯度为90.72％，β-葡聚糖为乳白色粉末，葡聚糖纯度为93.75％；酵母甘露聚糖为白色粉末，甘露聚糖纯度为90.70％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中酿酒酵母与去离子水的体积比为1：5，中性蛋白酶Flavorzyme的用量为300U/g，采用酶解进行自溶时，温度为40℃，时间为30h，pH值为8.0。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽含量为90.46％；β-葡聚糖为乳白色粉末，β-葡聚糖含量为94.42％；酵母甘露聚糖为白色粉末，甘露聚糖含量为93.84％。

实施例4

本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的具体操作步骤为：向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得到沉淀a1，然后按质量比1：3向沉淀a1中加去离子水得到悬浮液，对所述悬浮液在100℃的条件下高温抽提6h，抽提结束后进行离心处理，分别得到上清b和沉淀b。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽含量为92.13％；β-葡聚糖为乳白色粉末，β-葡聚糖含量为91.08％；酵母甘露聚糖为白色粉末，甘露聚糖含量为90.32％。

实施例5

本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(4)的主要操作步骤为：对步骤(3)中所得上清b在70℃下进行4倍浓缩(即所述浓缩后的体积为上清b的1/4)，得浓缩液，所得到的浓缩液先用60％乙醇进行沉淀，复溶后再次使用相同体积分数的乙醇醇沉，离心后得到沉淀，对所述沉淀置于鼓风干燥箱中烘干，粉碎即得到酵母甘露聚糖。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽含量为92.06％；β-葡聚糖为乳白色粉末，β-葡聚糖含量为94.68％；酵母甘露聚糖为白色粉末，甘露聚糖含量为91.13％。

实施例6

本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(5)的具体操作步骤为：按质量比1：5向所述沉淀b中加入去离子水得到悬浮液，采用高速分散器，在6000rpm的条件下处理10min，得高速分散悬浮液，将所述高速分散悬浮液加入中性蛋白酶Neutrase进行酶解，酶的添加量为所述沉淀b质量的0.05％，在55℃的条件下酶解2h，灭酶后得酶解液，所述酶解液在压力100MPa和处理流量为100mL/min的条件下，高压微射循环处理4次，离心后得沉淀，所述沉淀采用无水乙醇脱水后，经干燥即得酵母β-葡聚糖。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽含量为92.21％；β-葡聚糖为乳白色粉末，β-葡聚糖含量为90.61％；酵母甘露聚糖为白色粉末，甘露聚糖含量为94.36％。

实施例1～6制备得到的产品方面具有以下优点：酵母细胞壁短肽具有抗氧化活性，在1mg/mL浓度时，DPPH清除率达49.94％。

酵母细胞壁葡聚糖具有增强免疫的功效，在150mg/kg.d剂量时可以显著增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化率，吸光度值为0.68，是空白对照组的2.20倍；在150mg/kg.d剂量时，小鼠NK细胞的杀伤率为69.32％。

酵母细胞壁甘露聚糖具有增强免疫力、抑制肿瘤活性的功效。在50mg/kg.d剂量时可以显著增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化率，吸光度值为0.76，是空白对照组的1.84倍，50mg/kg.d剂量时可以显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬功能，吞噬百分率为20.35％；具有直接抑制HL-60肿瘤细胞生长的作用，在1.58mg/mL时能够抑制50％的HL-60肿瘤细胞。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将酿酒酵母加入去离子水中得到悬浮液，向所述悬浮液中加入中性蛋白酶进行酶解自溶，灭酶活后离心，得到上清a和沉淀a；

(2)将所述上清a干燥后，即得酵母短肽；

(3)向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得到沉淀a1，然后向沉淀a1中加入去离子水得到悬浮液，所述悬浮液抽提后离心，得到上清b和沉淀b；

(4)将所述上清b浓缩，向所述浓缩后的上清b中加入乙醇进行醇沉，离心后得沉淀，所述沉淀经干燥后即得酵母细胞壁甘露聚糖；

(5)向所述沉淀b中加入去离子水得到悬浮液，将所述悬浮液高速分散，将经高速分散后的悬浮液进行酶解处理，灭酶后得酶解液，然后进行高压微射流处理，离心后得沉淀，所述沉淀采用无水乙醇脱水后，经干燥即得酵母细胞壁β-葡聚糖。

2.根据权利要求1所述的同步制备方法，其特征在于，步骤(1)中，酿酒酵母与去离子水的体积比为1：4～6。

3.根据权利要求1所述的同步制备方法，其特征在于，步骤(1)中性蛋白酶的用量为200～300U/g，采用酶解进行自溶时，温度为40～60℃，时间为20～30h，pH值为6.0～8.0。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述中性蛋白酶选自Neutrase或/和Flavorzym。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)的具体操作步骤为：向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得到沉淀a1，然后按质量比1：3～10向沉淀a1中加去离子水得到悬浮液，对所述悬浮液在90～100℃的条件下高温抽提3～6h，抽提结束后进行离心处理，分别得到上清b和沉淀b。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述离心处理的离心转速为4000～5000rpm，离心时间为10～20min；优选地，离心转速为4500rpm，离心时间为10min。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述浓缩后的上清b为浓缩前上清b体积的1/5～1/3。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述加入乙醇进行醇沉的步骤为：先用体积分数为50％～75％的乙醇进行沉淀，采用去离子水复溶，复溶后再次使用60％～80％体积分数的乙醇进行沉淀。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)的具体操作步骤为：按质量比1：4～6向所述沉淀b中加入去离子水得到悬浮液，采用高速分散器，在6000～8000rpm的条件下处理5～10min，得高速分散悬浮液，将所述高速分散悬浮液加入蜗牛酶或中性蛋白酶Neutrase进行酶解，酶的添加量为所述沉淀b质量的0.02～0.05％，在35～55℃的条件下酶解1～3h，灭酶后得酶解液，所述酶解液在压力100～200MPa和处理流量为20～200mL/min的条件下，高压微射循环处理3～6次，离心后得沉淀，所述沉淀采用无水乙醇脱水后，经干燥即得酵母β-葡聚糖。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)和步骤(7)干燥的温度均为40～65℃。