CN112301025A - 固定化酶载体的修饰方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了固定化酶载体的修饰方法,包括以下步骤:使固定化酶载体,优选多孔无机材料,与醇溶蛋白接触。本申请还提供了修饰的固定化酶载体及其用途,制备固定化酶组合物的方法,以及固定化酶组合物及其用途。
Description
技术领域
本申请属于酶工程领域。具体而言,本申请涉及固定化酶载体的修饰方法以及固定化酶载体及其用途。在更具体的方面,本申请提供了固定化酶组合物的制备方法,以及通过所述方法制备的固定化酶组合物及其用途。
背景技术
生物酶是具有催化功能的蛋白质,它是从生物体中产生的,具有特殊的催化功能,因此生物酶的制造和应用领域逐渐扩大。其中,脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3),亦称三酰基甘油酰基水解酶,是重要的工业酶制剂品种之一,其可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应,被广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。目前,脂肪酶大规模工业应用的难点主要是酶液价格昂贵,使用成本高。酶固定化是解决这个难点的有效方法之一,它将生物酶限域到载体材料上,使得生物酶不溶于反应介质,从而达到生物酶回收和循环利用的目的。目前,充当固定化酶载体的材料主要有两类,一类是离子交换树脂等颗粒性载体,一类是白炭黑、活性炭、硅藻土等粉末类多孔吸附质材料。与树脂类载体相比,白炭黑等多孔吸附质材料因其巨大的比表面积,高的孔体积,优良的机械稳定性和低廉的价格等优点,而受到广泛关注,被用于粉末类固定化酶优良载体的开发。可以通过物理吸附的方法将生物酶固定到此类吸附质材料上,但酶与载体分子的相互作用力不强,容易导致酶的固定化效率及稳定性下降。
对载体材料进行表面改性是提高固定化酶催化性能的一种有效方法。目前对白炭黑等氧化硅材料进行改性的方法主要是利用硅烷偶联剂或者功能化聚硅氧烷跟二氧化硅表面的硅羟基反应。例如Mesa课题组(Claudia Bernal,Juan C.Poveda-Jaramillo,MonicaMesa,Raising the enzymatic performance of lipase and protease in thesynthesis of sugar fatty acid esters,by combined ionic exchange-hydrophobicimmobilization process on aminopropyl silica support.Chemical EngineeringJournal,2018,334,760-767)利用3-氨丙基三乙氧基硅烷或者3-氨丙基三甲氧基硅烷对氧化硅进行改性,并用于脂肪酶固定化,所得固定化酶在蔗糖脂肪酸酯合成反应中表现出好的催化活性。这种改性方法硅烷偶联剂用量大,利用率低,且功能基团嫁接密度小,操作复杂,材料改性成本较高。中国专利申请CN 104087571A描述了一种利用含氢硅油对二氧化硅进行改性,并利用改性二氧化硅做载体固定化脂肪酶的方法,该方法所使用的含氢硅油改性剂和催化剂价格昂贵,改性步骤繁琐,处理成本高。
除小分子外,利用大量蛋白分子对载体进行填充包附是改善固定化酶性能的另一种方式。例如美国专利US5232843A利用非脂肪酶对疏水型氧化硅类载体或者离子交换树脂载体的固定化酶进行填充包附,使固定化酶表现出高于未经非脂肪酶蛋白填充固定化酶的催化活性,该方法主要使用水溶性非脂肪酶蛋白对固定化酶进行包附填充,且所包附固定化酶载体必须经过硅脂疏水改性或者包含离子交换基团,对普通的亲水型多孔材料固载酶未能表现出明显的改善酶活效果。
目前本领域仍然需要开发绿色安全,价格低廉的粉末型改性吸附剂材料,并将其作为生物酶载体,用于开发具有高催化活性和循环稳定性的固定化酶产品。
发明概述
本发明所要解决的技术问题是开发具有高催化活性和循环稳定性的固定化酶。
为解决上述技术问题:
第一方面,本申请提供了固定化酶载体的修饰方法,其包括以下步骤:使固定化酶载体,优选多孔无机材料,与醇溶蛋白接触。
在第一方面的一些实施方案中,所述接触步骤包括将包含醇溶蛋白与固定化酶载体的混合物进行静置、振荡或搅拌处理,或者将醇溶蛋白溶液循环通过所述固定化酶载体,得到处理后的混合物,并干燥所述处理后的混合物。
在第一方面的一些实施方案中,所述醇溶蛋白溶解于60%-95%(v/v)的醇类水溶液或丙酮中。
在第一方面的一些实施方案中,所述醇溶蛋白的质量浓度为0.01%-2%(w/v)。
在第一方面的一些实施方案中,所述醇溶蛋白与所述固定化酶载体的质量比:1:2-1:100。
在第一方面的一些实施方案中,所述处理的时间为10min-6h。
在第一方面的一些实施方案中,所述干燥为旋转蒸发、真空干燥、冷冻干燥、烘箱干燥或自然干燥。
在第一方面的一些实施方案中,所述接触步骤的次数为1-10次。
第二方面,本申请提供了固定化酶载体,其包含醇溶蛋白。
第三方面,本申请提供了根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体,或第二方面所述的固定化酶载体在制备固定化酶组合物中的用途。
第四方面,本申请提供了固定化酶组合物的制备方法,其包括将根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体或第二方面所述的固定化酶载体与待固定的酶接触的步骤,并且任选地包括将根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体或第二方面所述的固定化酶载体、待固定的酶和多羟基化合物接触的步骤。
在第四方面的一些实施方案中,所述接触步骤包括将包含根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体或第二方面所述的固定化酶载体与待固定的酶的混合物进行振荡处理,任选地将包含根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体或第二方面所述的固定化酶载体、待固定的酶和多羟基化合物的混合物进行振荡处理,得到振荡处理后的混合物,干燥所述振荡处理后的混合物。
在第四方面的一些实施方案中,所述酶的质量浓度为1-30mg/mL。
在第四方面的一些实施方案中,所述振荡处理的时间为0.5h-48h。
在第四方面的一些实施方案中,所述振荡处理的温度为4℃-25℃。
在第四方面的一些实施方案中,所述干燥为喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。
在第五方面,本申请提供了固定化酶组合物,其包含根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体或第二方面所述的固定化酶载体和酶;任选地,所述固定化酶还包含多羟基化合物。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述酶的含量为1wt.%-10wt.%。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述多羟基化合物的含量为0wt.%-50wt.%。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述固定化酶载体的含量为40wt.%-95wt.%。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述醇溶蛋白的含量为1wt.%-5wt.%。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述多孔无机材料为气相二氧化硅、水合硅胶、沉淀二氧化硅(也被称为白炭黑)、硅胶或硅藻土。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述醇溶蛋白为玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、糯米醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白或椰肉醇溶蛋白。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述酶为来自动物、植物或微生物的脂肪酶。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述脂肪酶来自选自以下的微生物:疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、米根霉(Rhizopusoryzae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、黑曲霉(Aspergillus niger)或以上微生物的基因改造菌种。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述多羟基化合物为多糖类化合物。
第六方面,本申请提供了根据第四方面所述的方法制备的固定化酶组合物、或第五方面所述的固定化酶组合物在制备母乳脂肪替代物中的用途。
附图说明
图1为白炭黑压片的水接触角照片。
图2为使用0.5%(w/v)的醇溶蛋白一次修饰的白炭黑压片的水接触角照片。
图3为使用0.5%(w/v)的醇溶蛋白三次修饰的白炭黑压片的水接触角照片。
发明详细描述
使用非水溶性的醇溶蛋白对固定化酶载体进行修饰得到的修饰的固定化酶载体能够有效地提高酶活稳定性和催化专一性。虽然多孔无机材料具有大的表面积和高的孔体积,可以通过物理吸附的方法将生物酶吸附到多孔无机材料上,但是其与生物酶的相互作用力不强,容易导致生物酶的固定化效率及稳定性下降。本申请的发明人通过研究开发出新的固定化酶载体的修饰方法以及将修饰的固定化酶载体用于制备固定化酶组合物。使用本申请的固定化酶载体制备的固定化酶组合物具有以下一种或多种优势:
1.固定化酶组合物具有提高的酶催化专一性,尤其是Sn-1,3专一性;
2.固定化酶组合物具有良好的循环稳定性;
3.使用本申请的固定化酶制备的母乳脂肪替代物品质优良。
定义
提供以下定义用以更好地说明本申请的内容以及在实践本申请的各项发明中指导本领域普通技术人员。除非另外说明,本申请中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同,例如,涉及原料和产物、操作步骤、工艺参数、使用设备和工具以及数值单位中的术语。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物,其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本文所用术语“多孔无机材料”是指具有微小细孔、质轻、表面积很大的各种天然或人工无机非金属材料。例如,多孔无机材料包括但不限于气相二氧化硅、水合硅胶、沉淀二氧化硅、硅胶、硅藻土等。
如本文所用术语“醇溶蛋白”是植物种子储存蛋白的组分之一,它包含大量非极性氨基酸,不溶于水,具有强的耐水性、亲油性和成膜性,在食品保鲜,药物缓释等方面有一定应用。例如,醇溶蛋白包括但不限于玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、糯米醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白、椰肉醇溶蛋白等。
如本文所用术语“脂肪酶”,是指一类具有多种催化能力的酶,可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酸解、转酯化及酯类的逆向合成反应。脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中。
如本文所用术语“Sn-1,3专一性”,是指对甘油三酯或其衍生物(甘油、甘油一酯、甘油二酯)1位和3位基团优先催化。
如本文所用术语“载体”,是指用于负载活性组分以参与某种化学或物理过程的物质。
如本文所用术语“多羟基化合物”,是指低分子量(分子量小于500)的多羟基化合物。多羟基化合物可以为多糖类化合物,例如可溶性淀粉、糊精、果胶、可溶性纤维素等。
具体实施方案
应当理解,下文描述的方法中的各个步骤并不一定是实施本申请的方法的必要或全部步骤,一些步骤可以被省略,可以被其他相似步骤替换,或者也可以增加一些其他步骤。此外,还应当理解,下文描述的各个技术特征(例如,参数值和范围)并不局限于其所在语境的具体实施方案,而是可以在本领域技术人员所能预见的合理情况下与其他技术特征进行任意地组合。
第一方面,本申请提供了固定化酶载体的修饰方法,其包括以下步骤:使固定化酶载体,优选多孔无机材料,与醇溶蛋白接触。
在第一方面的一些实施方案中,所述接触步骤包括将包含醇溶蛋白与固定化酶载体的混合物进行静置、振荡或搅拌处理,或者将醇溶蛋白溶液循环通过所述固定化酶载体,得到处理后的混合物,并干燥所述处理后的混合物。
在第一方面的一些实施方案中,所述搅拌为磁力搅拌或机械搅拌。
在第一方面的一些实施方案中,可以使用蠕动泵将醇溶蛋白溶液循环通过所述固定化酶载体。
在第一方面的一些实施方案中,所述醇溶蛋白溶解于60%-95%(v/v)的醇类水溶液或丙酮中。
在第一方面的一些具体实施方案中,所述醇溶蛋白溶解于70%(v/v)的丙酮或95%(v/v)的乙醇中。
在第一方面的一些实施方案中,所述醇溶蛋白的质量浓度为0.01%-2%(w/v),例如0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%(w/v),或以上任意两个值组成的范围。
在第一方面的一些实施方案中,所述醇溶蛋白的质量浓度为0.1%-1%(w/v),例如0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%(w/v),或以上任意两个值组成的范围。
在第一方面的一些具体实施方案中,所述醇溶蛋白的质量浓度为0.5%(w/v)。
在第一方面的一些实施方案中,所述醇溶蛋白与所述固定化酶载体的质量比为1:2-1:100,例如1:2、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100,或以上任意两个值组成的范围。
在第一方面的一些实施方案中,所述醇溶蛋白与所述固定化酶载体的质量比为1:40-1:60,例如1:40、1:45、1:50、1:55、1:60,或以上任意两个值组成的范围。
在第一方面的一些具体实施方案中,所述醇溶蛋白与所述固定化酶载体的质量比为1:40、1:50或1:60。
在第一方面的一些实施方案中,所述处理的时间为10min-6h,例如10min、20min、30min、40min、50min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h,或以上任意两个值组成的范围。
在第一方面的一些实施方案中,所述处理的时间为1-3h,例如1h、1.5h、2h、2.5h、3h,或以上任意两个值组成的范围。
在第一方面的一些具体实施方案中,所述处理的时间为1h或3h。
在第一方面的一些实施方案中,所述干燥为旋转蒸发、真空干燥、冷冻干燥、烘箱干燥或自然干燥。
在第一方面的一些具体实施方案中,所述干燥为旋转蒸发。
在第一方面的一些实施方案中,所述接触步骤的次数为1-10次,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次,或以上任意两个值组成的范围。
在第一方面的一些实施方案中,所述接触步骤的次数为1-3次,例如1、2或3次。
在第一方面的一些具体实施方案中,所述接触步骤的次数为1次或3次。
第二方面,本申请提供了固定化酶载体,其包含醇溶蛋白。
在第一方面的一些实施方案中,采用质量浓度为0.5%(w/v)的醇溶蛋白修饰固定化酶载体,得到的修饰的固定化酶载体与未修饰的固定化酶载体相比,修饰的固定化酶载体表面疏水程度提高,例如载体表面跟水滴接触后其接触角从未修饰的20°提高到修饰后的89°(参见下表及附图1-3)。
第三方面,本申请提供了根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体、或第二方面所述的固定化酶载体在制备固定化酶组合物中的用途。
第四方面,本申请提供了固定化酶组合物的制备方法,其包括将根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体或第二方面所述的固定化酶载体与待固定的酶接触的步骤,并且任选地包括将根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体或第二方面所述的固定化酶载体、待固定的酶和多羟基化合物接触的步骤。
在第四方面的一些实施方案中,所述接触步骤包括将包含根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体或第二方面所述的固定化酶载体与待固定的酶的混合物进行振荡处理,任选地将包含根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体或第二方面所述的固定化酶载体、待固定的酶和多羟基化合物的混合物进行振荡处理,得到振荡处理后的混合物,干燥所述振荡处理后的混合物。
在第四方面的一些实施方案中,所述酶的质量浓度为1-30mg/mL,例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30mg/mL,或以上任意两个值组成的范围。
在第四方面的一些实施方案中,所述酶的质量浓度为2.5-25mg/mL,例如2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25mg/mL,或以上任意两个值组成的范围。
在第四方面的一些具体实施方案中,所述酶的质量浓度为2.5mg/mL、10mg/mL或25mg/mL。
在第四方面的一些实施方案中,所述振荡处理的时间为0.5h-48h,例如0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、12h、24h、36h、48h,或以上任意两个值组成的范围。
在第四方面的一些实施方案中,所述振荡处理的时间为1h-5h,例如1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h,或以上任意两个值组成的范围。
在第四方面的一些具体实施方案中,所述振荡处理的时间为4h。
在第四方面的一些实施方案中,所述振荡处理的温度为4℃-25℃,例如4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃,或以上任意两个值组成的范围。
在第四方面的一些实施方案中,所述振荡处理的温度为20℃-25℃,例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃,或以上任意两个值组成的范围。
在第四方面的一些具体实施方案中,所述振荡处理的温度为25℃。
在第四方面的一些实施方案中,所述干燥为喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。
在第四方面的一些具体实施方案中,所述冷冻干燥的条件为冷阱温度-40℃,真空度20Pa。
在第四方面的一些具体实施方案中,所述真空干燥的温度为40℃。
在第四方面的一些具体实施方案中,所述喷雾干燥的条件进口温度150℃,出口温度80℃。
在第五方面,本申请提供了固定化酶组合物,其包含根据第一方面所述的方法制备的修饰的固定化酶载体或第二方面所述的固定化酶载体和酶;任选地,所述固定化酶还包含多羟基化合物。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述酶的含量为1wt.%-10wt.%,例如1wt.%、2wt.%、3wt.%、3.1wt.%、3.2wt.%、3.3wt.%、3.4wt.%、3.5wt.%、3.6wt.%、3.7wt.%、3.8wt.%、3.9wt.%、4wt.%、4.1wt.%、4.2wt.%、4.3wt.%、4.4wt.%、4.5wt.%、4.6wt.%、4.7wt.%、4.8wt.%、4.9wt.%、5wt.%、6wt.%、7wt.%、8wt.%、9wt.%、10wt.%,或以上任意两个值组成的范围。
在第五方面的一些具体实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述酶的含量为1wt.%、3.8wt.%、4.0wt.%、4.1wt.%、4.2wt.%、4.5wt.%或9.9wt.%。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述多羟基化合物的含量为0wt.%-50wt.%,例如0wt.%、5wt.%、10wt.%、11wt.%、11.1wt.%、11.2wt.%、11.3wt.%、11.4wt.%、11.5wt.%、11.6wt.%、11.7wt.%、11.8wt.%、11.9wt.%、12wt.%、12.1wt.%、12.2wt.%、12.3wt.%、12.4wt.%、12.5wt.%、12.6wt.%、12.7wt.%、12.8wt.%、12.9wt.%、13wt.%、14wt.%、15wt.%、20wt.%、21wt.%、22wt.%、23wt.%、24wt.%、24.1wt.%、24.2wt.%、24.3wt.%、24.4wt.%、24.5wt.%、24.6wt.%、24.7wt.%、24.8wt.%、24.9wt.%、25wt.%、30wt.%、35wt.%、36wt.%、37wt.%、37.1wt.%、37.2wt.%、37.3wt.%、37.4wt.%、37.5wt.%、37.6wt.%、37.7wt.%、37.8wt.%、37.9wt.%、38wt.%、39wt.%、40wt.%、45wt.%、50wt.%,或以上任意两个值组成的范围。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述多羟基化合物的含量为0wt.%-40wt.%,例如0wt.%、5wt.%、10wt.%、11wt.%、11.1wt.%、11.2wt.%、11.3wt.%、11.4wt.%、11.5wt.%、11.6wt.%、11.7wt.%、11.8wt.%、11.9wt.%、12wt.%、12.1wt.%、12.2wt.%、12.3wt.%、12.4wt.%、12.5wt.%、12.6wt.%、12.7wt.%、12.8wt.%、12.9wt.%、13wt.%、14wt.%、15wt.%、20wt.%、21wt.%、22wt.%、23wt.%、24wt.%、24.1wt.%、24.2wt.%、24.3wt.%、24.4wt.%、24.5wt.%、24.6wt.%、24.7wt.%、24.8wt.%、24.9wt.%、25wt.%、30wt.%、35wt.%、36wt.%、37wt.%、37.1wt.%、37.2wt.%、37.3wt.%、37.4wt.%、37.5wt.%、37.6wt.%、37.7wt.%、37.8wt.%、37.9wt.%、38wt.%、39wt.%、40wt.%,或以上任意两个值组成的范围。
在第五方面的一些具体实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述多羟基化合物的含量为0wt.%、11.7wt.%、12.3wt.%、12.7wt.%、13.0wt.%、24.8wt.%或37.6wt.%,或以上任意两个值组成的范围。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述固定化酶载体的含量为40wt.%-95wt.%,例如40wt.%、45wt.%、50wt.%、50.1wt.%、50.2wt.%、50.3wt.%、50.4wt.%、50.5wt.%、50.6wt.%、50.7wt.%、50.8wt.%、50.9wt.%、51wt.%、55wt.%、60wt.%、61wt.%、62wt.%、62.1wt.%、62.2wt.%、62.3wt.%、62.4wt.%、62.5wt.%、62.6wt.%、62.7wt.%、62.8wt.%、62.9wt.%、63wt.%、64wt.%、65wt.%、70wt.%、70.1wt.%、70.2wt.%、70.3wt.%、70.4wt.%、70.5wt.%、70.6wt.%、70.7wt.%、70.8wt.%、70.9wt.%、71wt.%、72wt.%、73wt.%、73.1wt.%、73.2wt.%、73.3wt.%、73.4wt.%、73.5wt.%、73.6wt.%、73.7wt.%、73.8wt.%、73.9wt.%、74wt.%、75wt.%、75.1wt.%、75.2wt.%、75.3wt.%、75.4wt.%、75.5wt.%、75.6wt.%、75.7wt.%、75.8wt.%、75.9wt.%、76wt.%、77wt.%、77.1wt.%、77.2wt.%、77.3wt.%、77.4wt.%、77.5wt.%、77.6wt.%、77.7wt.%、77.8wt.%、77.9wt.%、78wt.%、79wt.%、80wt.%、85wt.%、86wt.%、87wt.%、87.1wt.%、87.2wt.%、87.3wt.%、87.4wt.%、87.5wt.%、87.6wt.%、87.7wt.%、87.8wt.%、87.9wt.%、88wt.%、89wt.%、90wt.%、95wt.%,或以上任意两个值组成的范围。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述固定化酶载体的含量为50wt.%-90wt.%,例如50wt.%、50.1wt.%、50.2wt.%、50.3wt.%、50.4wt.%、50.5wt.%、50.6wt.%、50.7wt.%、50.8wt.%、50.9wt.%、51wt.%、55wt.%、60wt.%、61wt.%、62wt.%、62.1wt.%、62.2wt.%、62.3wt.%、62.4wt.%、62.5wt.%、62.6wt.%、62.7wt.%、62.8wt.%、62.9wt.%、63wt.%、64wt.%、65wt.%、70wt.%、70.1wt.%、70.2wt.%、70.3wt.%、70.4wt.%、70.5wt.%、70.6wt.%、70.7wt.%、70.8wt.%、70.9wt.%、71wt.%、72wt.%、73wt.%、73.1wt.%、73.2wt.%、73.3wt.%、73.4wt.%、73.5wt.%、73.6wt.%、73.7wt.%、73.8wt.%、73.9wt.%、74wt.%、75wt.%、75.1wt.%、75.2wt.%、75.3wt.%、75.4wt.%、75.5wt.%、75.6wt.%、75.7wt.%、75.8wt.%、75.9wt.%、76wt.%、77wt.%、77.1wt.%、77.2wt.%、77.3wt.%、77.4wt.%、77.5wt.%、77.6wt.%、77.7wt.%、77.8wt.%、77.9wt.%、78wt.%、79wt.%、80wt.%、85wt.%、86wt.%、87wt.%、87.1wt.%、87.2wt.%、87.3wt.%、87.4wt.%、87.5wt.%、87.6wt.%、87.7wt.%、87.8wt.%、87.9wt.%、88wt.%、89wt.%、90wt.%,或以上任意两个值组成的范围。
在第五方面的一些具体实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述固定化酶载体的含量为50.1wt.%、62.1wt.%、70.3wt.%、73.8wt.%、75.9wt.%、77.9wt.%或87.1wt.%。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述醇溶蛋白的含量为1wt.%-5wt.%,例如1wt.%、1.1wt.%、1.2wt.%、1.3wt.%、1.4wt.%、1.5wt.%、1.6wt.%、1.7wt.%、1.8wt.%、1.9wt.%、2wt.%、2.1wt.%、2.2wt.%、2.3wt.%、2.4wt.%、2.5wt.%、2.6wt.%、2.7wt.%、2.8wt.%、2.9wt.%、3wt.%、3.5wt.%、4wt.%、4.5wt.%、5wt.%,或以上任意两个值组成的范围。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,所述醇溶蛋白的含量为1wt.%-3wt.%,例如1wt.%、1.1wt.%、1.2wt.%、1.3wt.%、1.4wt.%、1.5wt.%、1.6wt.%、1.7wt.%、1.8wt.%、1.9wt.%、2wt.%、2.1wt.%、2.2wt.%、2.3wt.%、2.4wt.%、2.5wt.%、2.6wt.%、2.7wt.%、2.8wt.%、2.9wt.%、3wt.%,或以上任意两个值组成的范围。
在第五方面的一些具体实施方案中,所述醇溶蛋白的含量为1.2wt.%、1.3wt.%或2.4wt.%。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物还包含水。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,水的含量为1wt.%-10wt.%,例如1wt.%、2wt.%、3wt.%、4wt.%、5wt.%、6wt.%、6.1wt.%、6.2wt.%、6.3wt.%、6.4wt.%、6.5wt.%、6.6wt.%、6.7wt.%、6.8wt.%、6.9wt.%、7.0wt.%、7.1wt.%、7.2wt.%、7.3wt.%、7.4wt.%、7.5wt.%、7.6wt.%、7.7wt.%、7.8wt.%、7.9wt.%、8wt.%、9wt.%、10wt.%,或以上任意两个值组成的范围。
在第五方面的一些实施方案中,所述固定化酶组合物中,水的含量为5wt.%-8wt.%,例如5wt.%、6wt.%、6.1wt.%、6.2wt.%、6.3wt.%、6.4wt.%、6.5wt.%、6.6wt.%、6.7wt.%、6.8wt.%、6.9wt.%、7.0wt.%、7.1wt.%、7.2wt.%、7.3wt.%、7.4wt.%、7.5wt.%、7.6wt.%、7.7wt.%、7.8wt.%、7.9wt.%、8wt.%,或以上任意两个值组成的范围。
在第五方面的一些具体实施方案中,所述固定化酶组合物中,水的含量为6.3wt.%、6.8wt.%、6.9wt.%、7.2wt.%、7.5wt.%或7.8wt.%。
在一些实施方案中,根据第四方面所述的方法制备的固定化酶组合物与第五方面所述的固定化酶组合物具有相同的性质。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述多孔无机材料为气相二氧化硅、水合硅胶、沉淀二氧化硅(也被称为白炭黑)、硅胶或硅藻土。
在上述任一方面所述的具体实施方案中,所述多孔无机材料为亲水型气相二氧化硅或沉淀二氧化硅。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述醇溶蛋白为玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、糯米醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白或椰肉醇溶蛋白。
在上述任一方面所述的具体实施方案中,所述醇溶蛋白为玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白或糯米醇溶蛋白。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述酶为来自动物、植物或微生物的脂肪酶。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述脂肪酶来自选自以下的微生物:疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、米根霉(Rhizopusoryzae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、黑曲霉(Aspergillus niger)或以上微生物的基因改造菌种。
在上述任一方面所述的具体实施方案中,所述脂肪酶来自选自以下的微生物:疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)或其组合。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述脂肪酶为Sn-1,3专一性脂肪酶。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述固定化酶组合物为Sn-1,3专一性固定化脂肪酶组合物。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述多羟基化合物为为多糖类化合物。
在上述任一方面所述的实施方案中,所述多羟基化合物为可溶性淀粉、糊精、果胶或可溶性纤维素。
在上述任一方面所述的具体实施方案中,所述多羟基化合物为麦芽糊精、可溶性淀粉或甲基纤维素。
第六方面,本申请提供了根据第四方面所述的方法制备的固定化酶组合物、或第五方面所述的固定化酶组合物在制备母乳脂肪替代物中的用途。
作为示例性而非限制性的方案,本申请的固定化酶组合物的制备方法具体可以包括下述一个或多个步骤:
1)将醇溶蛋白(例如玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白或糯米醇溶蛋白)溶解于60%-95%(v/v)的醇类水溶液(例如70%(v/v)丙酮或95%(v/v)的乙醇)中,获得质量浓度为0.01%-2%(w/v)(例如0.5%(w/v))的醇溶蛋白溶液。
2)向固定化酶载体(多孔无机材料,例如亲水型气相二氧化硅或白炭黑)中加入步骤1)的醇溶蛋白溶液,振荡处理10min-6h(例如1h),得到振荡处理后的混合物,干燥(例如旋转蒸发)振荡处理后的混合物,去除混合物中的溶剂,得到淡黄色粉末;任选地,可以重复(例如2次)进行上述步骤分批加入醇溶蛋白溶液,得到修饰的固定化酶载体。
3)向步骤2)的修饰的固定化酶载体中加入质量浓度为1-30mg/mL(例如2.5mg/mL、10mg/mL或25mg/mL)的酶液(脂肪酶液,例如疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)脂肪酶液、米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶液、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶液或其混合物),任选地,再加入多羟基化合物(例如麦芽糊精、可溶性淀粉或甲基纤维素),室温振荡0.5h-48h(例如4h),干燥(例如喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥)振荡处理后的混合物,得到固定化酶组合物。
在本说明书和权利要求书中,词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”,且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
应该理解,在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤,可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例,除非与之矛盾。
实施例
下述实施例仅是说明性的,并不意图限制本申请实施方案的范围或者所附的权利要求的范围。
以下实施例中所用的原料及设备的具体信息如下:
玉米醇溶蛋白(上海国药集团有限公司)、小麦醇溶蛋白(上海高创化学科技有限公司)、糯米醇溶蛋白(自制)、Zeofree型白炭黑(邱博工程材料(青岛)有限公司)、REOLOSIL系列QS-30亲水型气相二氧化硅(日本德山)、AEROSIL系列A200亲水型气相二氧化硅(德固赛)、麦芽糊精(罗盖特)、可溶性淀粉(百灵威科技有限公司)、甲基纤维素(上海国药集团有限公司)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶溶液(诺维信公司)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶溶液(自制)、米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶溶液(天野)、甘油三硬脂酸酯(嘉里特种油脂(上海)有限公司)、油酸(丰益油脂化学(上海)有限公司)。
制备例1
将0.5g玉米醇溶蛋白溶解到100mL 95%(v/v)乙醇溶液中,加入30g Zeofree型白炭黑,振荡混匀1h后,通过旋转蒸发的方法除去混合物中的溶剂,得到淡黄色粉末。向该粉末中加入150mL市售的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶溶液(10mg/mL),室温振荡摇匀4h。在冷阱温度-40℃,真空度20Pa的条件下冷冻干燥,得到固定化酶A。
制备例2
将0.5g玉米醇溶蛋白溶解到100mL 95%(v/v)乙醇溶液中,加入30g Zeofree型白炭黑,振荡混匀1h后,通过旋转蒸发的方法除去混合物中的溶剂,得到淡黄色粉末。向该粉末中加入150mL市售的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶溶液(10mg/mL),再加入5g麦芽糊精,室温振荡摇匀4h。在冷阱温度-40℃,真空度20Pa的条件下冷冻干燥,得到固定化酶B。
制备例3
将0.5g小麦醇溶蛋白溶解到100mL 70%(v/v)丙酮溶液中,加入25g日本德山REOLOSIL系列QS-30亲水型气相二氧化硅,振荡混匀1h后,通过旋转蒸发的方法除去混合物中的溶剂,得到淡黄色粉末。向该粉末中加入150mL米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶溶液(10mg/mL),再加入10g可溶性淀粉,室温振荡摇匀4h。在冷阱温度-40℃,真空度20Pa的条件下冷冻干燥,得到固定化酶C。
制备例4
将0.5g糯米醇溶蛋白溶解到100mL 95%(v/v)乙醇溶液中,加入20g德固赛AEROSIL系列A200亲水型气相二氧化硅,振荡混匀1h后,通过旋转蒸发的方法除去混合物中的溶剂,得到淡黄色粉末。向该粉末中加入150mL市售的米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶溶液(10mg/mL),再加入15g甲基纤维素,室温振荡摇匀4h。在40℃的条件下真空干燥,得到固定化酶D。
制备例5
将1.0g玉米醇溶蛋白溶解到200mL 95%(v/v)乙醇溶液中。取50ml上述溶液,加入30g白炭黑,振荡混匀1h后,通过旋转蒸发的方法除去混合物中的溶剂,得到一次修饰的淡黄色粉末。向一次修饰的淡黄色粉末中再加入25ml上述醇溶蛋白的乙醇溶液,振荡摇匀1h后,再旋转蒸发除去混合物中的溶剂,得到二次修饰的淡黄色粉末。同样步骤再加入25ml醇溶蛋白进行第三次修饰,得到三次修饰的淡黄色粉末。向三次修饰的淡黄色粉末中加入100mL市售的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶溶液(10mg/mL)和50mL自制的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶溶液(10mg/mL,再加入5g麦芽糊精,室温振荡摇匀4h。在进口温度150℃,出口温度80℃的条件下喷雾干燥,得到固定化酶E。
制备例6
将0.5g玉米醇溶蛋白溶解到100mL 95%(v/v)乙醇溶液中,加入30g Zeofree型白炭黑,振荡混匀1h后,通过旋转蒸发的方法除去混合物中的溶剂,得到淡黄色粉末。向该粉末中加入150mL的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶溶液(2.5mg/mL),再加入5g麦芽糊精,室温振荡摇匀4h。在进口温度150℃,出口温度80℃的条件下喷雾干燥,得到固定化酶F。
制备例7
将0.5g玉米醇溶蛋白溶解到100mL 95%(v/v)乙醇溶液中,加入30g Zeofree型白炭黑,振荡混匀1h后,通过旋转蒸发的方法除去混合物中的溶剂,得到淡黄色粉末。向该粉末中加入150mL的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶溶液(25mg/mL),再加入5g麦芽糊精,室温振荡摇匀4h。在进口温度150℃,出口温度80℃的条件下喷雾干燥,得到固定化酶G。
制备例8
向30g白炭黑中加入150mL疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶溶液(10mg/mL),室温振荡摇匀24h。在进口温度150℃,出口温度80℃的条件下喷雾干燥,得到固定化酶H。
制备例9
向30g白炭黑中加入170mL疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶溶液(10mg/mL),再加入5g麦芽糊精,室温振荡摇匀4h。在进口温度150℃,出口温度80℃的条件下喷雾干燥,得到固定化酶I。
制备例10
将0.5g酪蛋白溶解到100mL磷酸缓冲液中,加入30g Zeofree型白炭黑,振荡混匀1h后,通过旋转蒸发的方法除去混合物中的水,得到酪蛋白掺杂的白炭黑。向该粉末中加入150mL的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶溶液(10mg/mL),再加入5g麦芽糊精,室温振荡摇匀4h。在进口温度150℃,出口温度80℃的条件下喷雾干燥,得到固定化酶J。
通过制备例1-7获得固定化酶A-E中各成分的含量如表1所示:
表1
实施例1固定化酶用于母乳脂肪替代物的制备
将甘油三硬脂酸酯与油酸按质量比1:2的比例混合溶解配成底物,固定化酶添加量为6%(w/w),60℃气浴,150rpm反应6h,制备母乳脂肪替代物1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)。取样进行GC分析甘油三酯组成。表2为使用表1中各固定化酶所制备的母乳脂肪替代物OPO所获得的油脂组合物中Sn-2位棕榈酸占所有棕榈酸的含量、C52甘油三酯的含量及三棕榈酸甘油酯(PPP)含量的结果,检测方法均参照国家标准GB30604-2015(食品安全国家标准食品营养强化剂1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯)。表3为表1中各固定化酶所制备的母乳脂肪替代物OPO所获得的油脂组合物中C52甘油三酯的含量随反应循环次数的变化。其中,固定化酶A-G为实验组,固定化酶H-J为对照组。国家标准GB30604-2015(食品安全国家标准食品营养强化剂1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯)关于食品营养强化剂OPO的规定要求其中PPP含量低于10%,C52大于40%,以及Sn-2位棕榈酸占所有棕榈酸的含量大于52%,这是产品合格的三个重要指标。表2的结果表明,与对照组的固定化酶相比,使用实验组的固定化酶制备的OPO均符合或基本符合国家标准GB30604-2015(食品安全国家标准食品营养强化剂1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯)。
表2
表3为循环使用固定化酶产品后OPO产品中C52含量的变化结果,可见随着使用次数的增加,固定化酶反应产物中C52含量都有一定程度的下降,但是与对照组的固定化酶相比,使用实验组的固定化酶下降趋势慢,说明实验组的固定化酶稳定性好,可重复利用次数多,酶的产能比较高。
表3固定化酶催化产物中C52甘油三酯含量(%)随反应循环次数增加的变化
上文对本申请的各项发明的示例性实施方案进行了描述,但是,在不脱离本申请的实质和范围的情况下,本领域技术人员能够对本申请描述的示例性实施方案进行修改或改进,由此得到的变形方案或等同方案也属于本申请的范围。
Claims (10)
1.固定化酶载体的修饰方法,其包括以下步骤:
使固定化酶载体,优选多孔无机材料,与醇溶蛋白接触;
优选地,所述接触步骤包括将包含醇溶蛋白与固定化酶载体的混合物进行静置、振荡或搅拌处理,或者将醇溶蛋白溶液循环通过所述固定化酶载体,得到处理后的混合物,并干燥所述处理后的混合物。
2.如权利要求1所述的方法,其中
所述醇溶蛋白溶解于60%-95%(v/v)的醇类水溶液或丙酮中,优选地,所述醇溶蛋白溶解于70%(v/v)的丙酮或95%(v/v)的乙醇中;和/或
所述醇溶蛋白的质量浓度为0.01%-2%(w/v),优选为0.1%-1%(w/v),更优选为0.5%(w/v);和/或
所述醇溶蛋白与所述固定化酶载体的质量比为1:2-1:100,优选为1:40-1:60,更优选为1:40、1:50或1:60;和/或
所述处理的时间为10min-6h,优选为1-3h,更优选为1h或3h;和/或
所述干燥为旋转蒸发、真空干燥、冷冻干燥、烘箱干燥或自然干燥,优选为旋转蒸发;和/或
所述接触步骤的次数为1-10次,优选为1-3次,更优选为1次或3次。
3.固定化酶载体,其包含醇溶蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的方法制备的修饰的固定化酶载体、或权利要求3所述的固定化酶载体在制备固定化酶组合物中的用途。
5.固定化酶组合物的制备方法,其包括将根据权利要求1或2所述方法制备的修饰的固定化酶载体或权利要求3所述的固定化酶载体与待固定的酶接触的步骤,并且任选地包括将根据权利要求1或2所述方法制备的修饰的固定化酶载体或权利要求3所述的固定化酶载体、待固定的酶和多羟基化合物接触的步骤;
优选地,所述接触步骤包括将包含根据权利要求1或2所述方法制备的修饰的固定化酶载体或权利要求3所述的固定化酶载体与待固定的酶的混合物进行振荡处理,任选地将包含根据权利要求1或2所述方法制备的修饰的固定化酶载体或权利要求3所述的固定化酶载体、待固定的酶和多羟基化合物的混合物进行振荡处理,得到振荡处理后的混合物,干燥所述振荡处理后的混合物。
6.如权利要求5所述的方法,其中
所述酶的质量浓度为1-30mg/mL,优选为2.5-25mg/mL,更优选为2.5mg/mL、10mg/mL或25mg/mL;和/或
所述振荡处理的时间为0.5h-48h,优选为1h-5h,更优选为4h;和/或
所述振荡处理的温度为4℃-25℃,优选为20-25℃,更优选为25℃;和/或
所述干燥为喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。
7.固定化酶组合物,其包含根据权利要求1或2所述方法制备的修饰的固定化酶载体或权利要求3所述的固定化酶载体和酶;任选地,所述固定化酶还包含多羟基化合物。
8.如权利要求7所述的固定化酶组合物,其中
所述固定化酶组合物中,所述酶的含量为1wt.%-10wt.%,优选为1wt.%、3.8wt.%、4.0wt.%、4.1wt.%、4.2wt.%、4.5wt.%或9.9wt.%;和/或
所述固定化酶组合物中,所述多羟基化合物的含量为0wt.%-50wt.%,优选为0wt.%-40wt.%,更优选为0wt.%、11.7wt.%、12.3wt.%、12.7wt.%、13.0wt.%、24.8wt.%或37.6wt.%;和/或
所述固定化酶组合物中,所述固定化酶载体的含量为40wt.%-95wt.%,优选为50wt.%-90wt.%,更优选为50.1wt.%、62.1wt.%、70.3wt.%、73.8wt.%、75.9wt.%、77.9wt.%或87.1wt.%;和/或
所述醇溶蛋白的含量为1wt.%-5wt.%,优选为1wt.%-3wt.%,更优选为1.2wt.%、1.3wt.%或2.4wt.%。
9.如权利要求1、2、5或6所述的方法、权利要求3所述的固定化酶载体、权利要求4所述的用途、或权利要求7或8所述的固定化酶组合物,其中
所述多孔无机材料为气相二氧化硅、水合硅胶、沉淀二氧化硅、硅胶或硅藻土,优选为亲水型气相二氧化硅或沉淀二氧化硅;和/或
所述醇溶蛋白为玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、糯米醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白或椰肉醇溶蛋白,优选为玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白或糯米醇溶蛋白;和/或
所述酶为来自动物、植物或微生物的脂肪酶,优选地,所述脂肪酶来自选自以下的微生物:疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、米根霉(Rhizopus oryzae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、黑曲霉(Aspergillus niger)或以上微生物的基因改造菌种;更优选地,所述脂肪酶为Sn-1,3专一性脂肪酶;和/或
所述多羟基化合物为多糖类化合物,优选为可溶性淀粉、糊精、果胶或可溶性纤维素,更优选为麦芽糊精、可溶性淀粉或甲基纤维素。
10.根据权利要求5或6所述的方法制备的固定化酶组合物、或权利要求7或8所述的固定化酶组合物在制备母乳脂肪替代物中的用途。
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