KR101560842B1 - 유기 매질에서 친수성 기질에 대해 고내성인 변형-고정된 효소 - Google Patents

유기 매질에서 친수성 기질에 대해 고내성인 변형-고정된 효소 Download PDF

Info

Publication number
KR101560842B1
KR101560842B1 KR1020097025617A KR20097025617A KR101560842B1 KR 101560842 B1 KR101560842 B1 KR 101560842B1 KR 1020097025617 A KR1020097025617 A KR 1020097025617A KR 20097025617 A KR20097025617 A KR 20097025617A KR 101560842 B1 KR101560842 B1 KR 101560842B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oil
enzyme
support
group
fatty acid
Prior art date
Application number
KR1020097025617A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100023853A (ko
Inventor
솝히 바쉬르
Original Assignee
트랜스 바이오디젤 엘티디.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 트랜스 바이오디젤 엘티디. filed Critical 트랜스 바이오디젤 엘티디.
Publication of KR20100023853A publication Critical patent/KR20100023853A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101560842B1 publication Critical patent/KR101560842B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)

Abstract

효소가 소수성 미세환경으로 둘러싸임으로써, 친수성 제제, 기질 및/또는 반응 생성물의 존재 하에서 비활성화 및/또는 응집으로부터 보호되는 것인, 고체 지지체에 고정된 변형된 계면 효소, 보다 상세하게는 고체 지지체에 고정된, 리파아제 및 포스포리파아제의 제조가 개시되어 있다. 상기 효소는, 효소를 피복하는 지질기와 공유결합함으로써 보호될 수 있거나, 소수성 고체 지지체 위에 고정되거나 함침됨으로써 보호될 수 있다. 또한 소수성으로 보호되는 효소의 제조방법이 개시되어 있다. 상기 효소는 바이오디젤의 제조 공정에 유용하게 사용될 수 있다.
계면 효소

Description

유기 매질에서 친수성 기질에 대해 고내성인 변형-고정된 효소{MODIFIED-IMMOBILIZED ENZYMES OF HIGH TOLERANCE TO HYDROPHILIC SUBSTRATES IN ORGANIC MEDIA}
본 발명은 알코올, 특히 단쇄 알콜 뿐만 아니라 다른 친수성 물질에 대해 개량된 활성 및 안정성을 갖는 고정된 계면 효소(interfacial enzymes), 보다 상세하게는 리파아제(lipases) 및 포스포리파아제(phospholipases) 뿐만 아니라 다른 가수분해 효소에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 효소의 제조 방법 및 이들의 다양한 산업 및 연구에서의 용도, 상세하게는, 전형적으로 바이오디젤(biodiesel)로서 사용되는 메틸 에스테르(methyl esters)와 같은, 지방산 단쇄 알킬 에스테르(fatty acid short-chain alkyl esters)의 생산에 관한 것이다.
계면 효소는 단백질 구조에 있어서 두 개의 영역으로 이루어진 효소의 한 종류이고; 제1 영역은 친수성 영역(hydrophilic domain)이며, 제2 영역은 소수성 영역(hydrophobic domain)이다. 이러한 독특한 특성 때문에 이러한 종류의 효소가 2상 시스템에 존재하는 경우에는, 계면 영역을 선호하게 된다. 이러한 조건하에서, 상기 효소 분자의 친수성 영역은 친수층(aqueous layer)과 접하고 상기 소수성 영역은 소수층(hydrophobic layer)과 접하는 활성 형태(active conformation)가 형성 된다.
리파아제 및 포스포리파아제는 계면 시스템에 존재하는 경우 그들의 촉매 활성을 나타내는 가장 잘 알려진 계면 효소이다. 리파아제(트리아실글리세롤 가수분해효소 E.C. 3.1.1.3)는 수성 시스템에서 트리아실글리세롤의 에스테르 결합에 작용하여 유리 지방산(free fatty acids), 부분(partial) 글리세라이드 및 글리세롤을 생성하는 가수분해효소로서 정의된다. 포스포리파아제 또한 가수분해 효소의 한 종류에 속하지만, 이들은 특히 수성 시스템에 존재하는 인지질(phospholipid)의 에스테르 결합을 끊어서, 포스포리파아제의 종류에 따라, 유리 지방산, 리소인지질 (lysophospholipids), 글리세롤인지질 (glycerophospholipids), 포스파티딕 산 (phosphatidic acid) 및 유리 알콜(free alcohol)을 생성한다.
리파아제 및 포스포리파아제는 동물, 식물 및 미생물에 광범위하게 분포되어 있다. 지난 20년간 리파아제 및 포스포리파아제의 산업적 응용에 대한 관심이 급격히 높아졌다. 낮은 수분 활성상태에서 이러한 종류의 효소가 이들의 역가수분해 작용(reverse hydrolysis reaction)을 촉진시킨다는 것이 확인되었다. 에스테르 및 아미드 결합을 포함하는 값비싼 화합물의 합성 또는 하이드록실기, 카르복실기와 같은 작용기(functional groups) 및 아미노기(amino groups)를 포함하는 다른 화학물질의 합성에 상기 리파아제 및 포스포리파아제의 역촉매 활성(reverse catalytic activity)이 광범위하게 이용되어 왔다. 특히, 리파아제 및 포스포리파아제는 지방, 오일, 왁스, 인지질, 스핑고지질(sphingolipids)을 개질하여 새롭게 원하는 기능적 특성을 얻고, 이들의 라세미 혼합물로부터 광학적 활성 화합물을 분 리하는 데 이용되어 왔다. 본 명세서에 개시된, 왁스 에스테르 및 단쇄 알킬 에스테르(바이오디젤(biodiesel))의 합성을 위한 계면 효소의 용도가 특히 관심을 받는다.
현재, 상업적으로 이용가능한 40개 이상의 리파아제 및 포스포리파아제가 존재하지만, 단지 그들 중 일부만이 상업적인 양으로 제조된다. 산업적으로 가장 유망한 계면 효소 중 일부는 칸디다 안타르티카(Candida antarctica), 칸디다 루고사(Candida rugosa), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 수도모나스 속(Pseudomonas sp .), 리조푸스 니베우스(Rhizopus niveus), 무코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 페니실리움 카멤베르티이(Penicillium camembertii), 알칼리제네스 속(Alcaligenes sp .), 버크홀데리아 속(Burkholderia sp .), 써모마이세스 라누기노사(Thermomyces lanuginosa), 크로모박테리움 비스코숨(Chromobacterium viscosum), 파파야 씨(papaya seeds), 및 판크레아틴(pancreatin)으로부터 얻어진다.
효소의 고정화는, 기본적으로 전체 공정에서의 효소의 비용을 절감하고, 생성물로부터 효소의 회수를 용이하게 하며, 연속적인 공정 조작이 가능하게 하는 것을 목표로 하는 매우 다양한 기술들에 의하여 설명되어 왔다. 일반적으로 고정화 기술들은 다음에 따라서 분류된다:
1. 실리카 및 불용성 고분자(insoluble polymers)와 같은 고체 지지체(solid supports)에 효소의 물리적인 흡착(physical adsorption).
2. 이온교환수지(ion-exchange resins)에 흡착.
3. 에폭시화된 무기 또는 고분자 지지체와 같은 고체 지지체 물질과 효소의 공유결합.
4. 성장하는 고분자에 효소의 혼입(entrapment).
5. 멤브레인 반응기(membrane reactor) 또는 반투과성 겔에 효소의 구속(confinement).
6. 가교 효소 결정(Cross-linking enzyme crystals (CLECS's)) 또는 가교 효소 응집체(Cross-linking enzyme aggregates (CLEAS's))
전술한 모든 효소 고정화 공정은 다음의 단계들을 포함한다:
1. pH, 온도, 버퍼 염(buffer salts)의 유형 및 이온세기가 적절한 버퍼 시스템에 효소를 용해시키는 단계.
2. 상기 효소 용액에 고체 지지체를 첨가하고 효소분자가 고체 지지체에 고정될 때까지 일정 시간 동안 혼합하는 단계.
3. 상기 고정된 효소를 포함하는 고체 지지체를 여과하는 단계.
4. 적절한 버퍼로 상기 지지체를 세척하여 느슨하게 결합된 효소분자를 제거한 후 상기 지지체를 건조하는 단계.
계면 효소, 주로 리파아제는 전술한 기술에 의해 고정화되어 왔다. 이러한 기술들에 의하여 고정화된 효소 제조 공정이 낮은 합성 활성 및/또는 짧은 조작 반감기를 갖게 되었다. 고정화된 리파아제 및 다른 계면 효소의 합성 활성을 증가시키기 위해 다른 활성화 방법들이 적용되어 왔다. 이러한 방법들은 다음의 단계들 을 포함한다:
1. 지방산(fatty acid) 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 소수성 잔기(hydrophobic residues)와 효소의 표면 작용기를 결합시키는 단계.
2. 폴리올 지방산 에스테르와 같은 계면활성제(surfactants)로 효소의 표면을 피복시키는 단계.
3. 소수성 지지체, 전형적으로, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 친수성 용매로 사전처리된 폴리프로필렌과 효소를 접촉시키는 단계.
4. 염 용액, 글리세롤 등과 같은, 전형적으로 1% 미만의 저농도 효소 활성제를 상기 반응 시스템에 첨가시키는 단계.
산업적인 양으로 효소 역변환을 수행하기 위한 고정된 계면 효소의 활성화, 안정화 및 비용효율성에 대해, 상기 방법들 중 어느 것도 만족스러운 결과를 가져오지 못했다. 또한, 전술한 공정에 따라 고정화될 때, 상기 고정화 공정에 존재하는 일정한 제약으로 인해 대부분의 효소들이 그들의 합성 활성의 상당부분을 잃어버리거나 그들의 최고 활성 효율을 나타내지 못한다는 것이 보고되어 왔다. 예를 들어, 리파아제 및 포스포리파아제를 폴리올 지방산 에스테르로 피복시키는 단계에서는 리파아제 분자들이 상기 활성제로 완전히 피복되지 않고; 따라서 그러한 효소 분자들이 상기 활성제와 접촉하지 못하고 비활성으로 남게 되는 심각한 난제에 직면하였다.
리파아제 및 포스포리파아제의 또 다른 난제는 이들이 친수성 기질(hydrophilic substrate), 상세하게는 단쇄 알콜(short-chain alcohols) 및 단쇄 지방산(short-chain fatty acids)(C4 이하)에 대한 내성이 낮다는 것이다. 메탄올 및 아세트산과 같은 단쇄 알콜 및 단쇄 지방산이 이러한 효소의 4차 구조로부터 필수적인 물 분자를 분리시키고, 이러한 효소들의 변성(denaturation)을 야기시키며, 결과적으로 이들의 촉매 활성(catalytic activity)을 손실케 하는 원인이라는 것이 많은 연구에서 관찰되어 왔다.
따라서, 본 발명의 목적은 합성용의 고도로 활성화되고 안정된 고정 계면 효소, 보다 상세하게는 리파아제 및 포스포리파아제를 얻기 위한 새로운 방법을 제공하는 것이다. 특히 중요한 것은, "바이오디젤"로서 사용하기 위한 지방산 단쇄 알킬 에스테르의 합성에 이러한 효소들이 사용된다는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 메탄올, 에탄올 및 글리세롤과 같은 단쇄 알콜 및 아세트산과 같은 단쇄 지방산에 대한 고내성을 갖는, 고도로 활성화되고 안정된 고정된 계면 효소를 제공하는 것이다.
이러한 본 발명의 목적 및 또 다른 목적은 다음 설명에 따라 명백해질 것이다.
[발명의 간단한 설명]
본 발명은 효소가 소수성 미세환경(hydrophobic microenvironment)으로 둘러싸이고, 이로인해 친수성 제제, 기질 및/또는 반응 생성물의 존재 하에서 비활성화(deactivation) 및/또는 응집(aggregation)으로부터 보호되는, 고체 지지체에 변형-고정된 계면 효소에 관한 것이다.
본 발명의 변형된 계면 효소는 공유결합된 지질기(lipid group)로 피복됨으로써 보호될 수 있다.
상기 지지체는 흡착 또는 작용기와의 공유결합에 의해 상기 효소와 결합할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 지지체가 유기 화합물 또는 무기 화합물, 바람직하게는 실리카-기반 및 알루미나-기반 지지체와 같은 무기 지지체, 고분자-기반 지지체와 같은 유기 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 지지체가 에폭시기 또는 알데히드기와 같은 활성 작용기(active functional groups) 및 이온기를 포함하거나 상기 지지체가 이온교환수지일 수 있다.
상기 지질 에폭사이드(lipid epoxide)는 지방산(fatty acids), 지방산 알킬 에스테르(fatty acid alkyl esters), 당 지방산 에스테르(sugar fatty acid esters), 중쇄 및 장쇄 알킬 글루코시드(medium- and long-chain alkyl glucosides), 인지질(phospholipids), 폴리에틸렌글리콜 유도체(polyethylene glycol derivatives) 및 4차 암모늄 염(quaternary ammonium salts)으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 변형된 계면 효소는 상기 소수성 미세환경을 제공하는 소수성 고체 지지체 위에 고정되거나 함침됨으로써 보호될 수 있다.
상기 효소는 리파아제, 에스테라아제 또는 포스포리파아제일 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 효소는 칸디다 안타르티카, 칸디다 루고사, 리조무코르 미에헤이, 수도모나스 속, 리조푸스 니베우스, 무코르 미에헤이, 무코르 자바니쿠스, 리조푸스 오리자에, 아스페르길루스 니게르, 페니실리움 카멤베르티이, 알칼리제네스 속, 버크홀데리아 속, 써모마이세스 라누기노사, 크로모박테리움 비스코숨, 파파야 씨 및 판크레아틴 중 하나일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은:
(a) 버퍼 수용액과, 지질 에폭사이드를 포함하는 적어도 하나의 유기용매를 포함하는 시스템을 제공하는 단계;
(b) 계면 효소와 상기 (a)단계에서 제공된 이중 용매 시스템(bi-solvent system)을 혼합하는 단계;
(c) 불용성 지지체를 상기 (b)단계의 혼합물에 첨가하고 혼합하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 얻은 혼합물로부터 상기 불용성 지지체에 고정된 계면 효소를 분리하는 단계를 포함하는, 불용성 지지체에 변형-고정된 계면 효소의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 변형된 계면 효소는 친수성 제제, 기질 및/또는 반응 생성물의 존재 하에서 비활성화 및/또는 응집으로부터 보호된다.
하나의 실시태양에서, 상기 지지체는, 유기 화합물 또는 무기 화합물, 바람직하게는, 실리카-기반 및 알루미나-기반 지지체와 같은 다공성 무기 지지체, 고분자-기반 지지체와 같은 유기 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 지지체가 선택적으로 에폭시기 또는 알데히드기와 같은 활성 작용기 및 이온기를 포함하는 다공성 지지체이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 유기 용매는 (옥탄과 같은) 알칸, (디-이소프로필 에테르와 같은) 에테르, (n-옥탄올과 같은) 알콜, (데칸알데히드와 같은) 알데히드 및 (2-옥탄온과 같은) 케톤 그리고 이들의 혼합물로부터 선택된다.
추가적 실시태양에서, 상기 지질 에폭사이드는 지방산, 지방산 메틸 에스테르(fatty acid methyl esters), 당 지방산 에스테르 또는 중쇄 및 장쇄 알킬 클루코시드, 인지질, 폴리에틸렌글리콜 유도체 및 4차 암모늄 염으로부터 선택된다.
또 다른 면에서, 본 발명은:
(a) 버퍼 수용액과, 지질 에폭사이드, 바람직하게는 지방산 에폭사이드(fatty acid epoxide) 또는 트리글리세라이드 에폭사이드(triglyceride epoxide)를 포함하는 적어도 하나의 유기 용매를 포함하는, 2상 시스템(bi-phase system)을 제공하는 단계;
(b) 상기 계면 효소와 상기 (a)단계에서 제공된, 과량의 에폭사이드를 갖는 2상 시스템을 혼합하여, 상기 효소의 친핵성 표면 반응기, 상세하게는 아미노기와 에폭사이드기를 반응시켜 지방산 또는 트리글리세라이드로 공유결합에 의해 피복된 효소를 생성하는 단계(도1);
(c) 상기 지지체를 상기 (b)단계의 혼합물에 첨가하고 혼합하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 얻은 혼합물로부터 상기 지지체에 고정된 지질 계면 효소 복합체를 분리하는 단계를 포함하고,
상기 효소가 소수성 미세환경으로 둘러싸임으로써, 친수성 제제, 기질 및/또는 반응 생성물의 존재 하에서 비활성화 및/또는 응집으로부터 보호되고, 고체 지지체에 변형-고정된 계면 효소의 제조 방법을 제공한다.
상기 효소 2상 용액을 혼합하기 전에, 상기 지지체가 선택적으로 세척되어 염 및 유기 물질이 제거된다.
본 발명의 이러한 제조 방법에서, 상기 불용성 지지체는 물리적 흡착 또는 작용기와의 공유결합에 의해 상기 계면 효소와 결합할 수 있다. 바람직하게는 상기 지지체가, 유기 화합물 또는 무기 화합물, 바람직하게는 실리카-기반 및 알루미나-기반 지지체와 같은 다공성 무기 지지체, 고분자-기반 지지체와 같은 유기 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 지지체가 에폭시기 또는 알데히드기와 같은 활성 작용기 및 이온기를 포함하거나 상기 지지체가 이온교환수지인, 다공성 지지체이다.
본 발명의 에폭시화 과정인 (a)단계에서 사용되는 유기 용매는 (옥탄과 같은) 알칸, (n-옥탄올과 같은) 알콜, (데칸알데히드와 같은) 알데히드, (디-이소프로필 에테르와 같은) 에테르 및 (2-옥탄온과 같은) 케톤 그리고 이들의 혼합물일 수 있으나, 이들에 국한되지는 않는다.
본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 계면 효소는 바람직하게는 리파아제, 에스테라아제 또는 포스포리파아제이다. 구체적으로 비제한적인 예는 칸디다 안타르티카, 칸디다 루고사, 리조무코르 미에헤이, 수도모나스 속, 리조푸스 니베우스, 무코르 자바니쿠스, 무코르 미에헤이, 리조푸스 오리자에, 아스페르길루스 니게르, 페니실리움 카멤베르티이, 알칼리제네스 속, 버크홀데리아 속, 써모마이세스 라누기노사, 크로모박테리움 비스코숨, 파파야 씨 및 판크레아틴로부터 유래된 효소이다.
고체 다공성 지지체에 고정된, 본 발명의 계면 효소는 활성이 있는 것으로 잠겨져(locked) 있고, 다량의 상기 지질 분자(원래의 에폭시기를 통해 상기 효소의 표면 작용기와 결합됨)와 공유결합을 이루면서 피복됨으로써 변형되며, 단쇄 알콜 및 단쇄 지방산과 같은 친수성 기질에 대해 고내성을 갖는 것이 특징이다.
본 발명의 에폭시화 과정에서 사용되는 지지체는 작용기와 물리적 흡착 또는 작용기와의 공유결합에 의해 지질로 피복된 효소와 결합할 수 있고, 유기 화합물 또는 무기 화합물, 바람직하게는 실리카-기반 및 알루미나-기반 지지체와 같은 다공성 무기 지지체, 고분자-기반 지지체와 같은 유기 지지체로부터 선택되며, 상기 지지체가 에폭시기 또는 알데히드기와 같은 활성 작용기 및 이온기를 포함하거나, 상기 지지체가 이온교환수지일 수 있다.
본 발명의 효소로 피복된 지질의 제조 방법에서, 상기 지질은 바람직하게는, 유리 지방산 또는 지방산 알킬 에스테르 에폭사이드, 당 지방산 에스테르 에폭사이드, 중쇄 및 장쇄 알킬 글루코시드, 인지질 에폭사이드, 폴리에틸렌글리콜 에폭사이드 유도체 및 4차 암모늄 염 에폭사이드이지만, 이들에 국한되지는 않는다. 상기 불포화 지질 기질의 에폭사이드들은 전형적으로 화학적 또는 생화학적 촉매, 예를 들어, 과산화수소(hydrogen hyperoxide) 존재 하의 리파아제에 의해 에폭사이드기에 적어도 하나의 이중 결합을 산화시킴으로써 얻어진다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은, (a) (i) 버퍼 수용액 시스템 또는 (ii) 수용성 버퍼 및 유기용매를 포함하는 2상 시스템을 제공하는 단계; (b) 상기 시스템 (i) 또는 시스템 (ii) 중 어느 하나에 소수성 고분자 지지체를 첨가하는 단계; (c) 계면 효소를 상기 (b)단계의 혼합물에 첨가하고 혼합하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 얻은 혼합물로부터 상기 소수성 지지체에 고정된 계면 효소를 분리하는 단계를 포함하는, 고체 지지체에 고정-변형된 계면 효소의 제조 방법에 관한 것이며, 효소가 소수성 미세환경으로 둘러싸이고, 이로인해 친수성 제제, 기질 및/또는 반응 생성물의 존재 하에서 비활성화 및/또는 응집으로부터 보호된다.
이러한 제조 방법에서, 상기 유기 용매는 n-옥탄, 이소-옥탄, n-헥산, n-옥탄올 디-이소프로필 에테르 및 오일 트리글리세라이드일 수 있으나, 이들에 국한되지는 않는다. 상기 소수성 고분자 지지체는 엠버라이트(AmberliteR) XAD 7HP와 같은 소수성 지방족 및 아크릴 가교 고분자(hydrophobic aliphatic and acrylic cross-linked polymers) 또는 엠버라이트(AmberliteR) XAD 1600과 같은 소수성 방향족 가교 고분자(hydrophobic aromatic cross-linked polymers)일 수 있으나, 이들에 국한되지는 않는다.
본 발명의 모든 제조 방법에서, 상기 효소는 리파아제, 에스테라아제 또는 포스포리파아제, 예를 들어, 칸디다 안타르티카, 칸디다 루고사, 리조무코르 미에헤이, 무코르 미에헤이, 수도모나스 속, 리조푸스 니베우스, 무코르 자바니쿠스, 리조푸스 오리자에, 아스페르길루스 니게르, 페니실리움 카멤베르티이, 알칼리제네스 속, 버크홀데리아 속, 써모마이세스 라누기노사, 크로모박테리움 비스코숨, 파파야 씨 및 판크레아틴일 수 있다.
본 발명의 소수성 변형-고정된 효소 또는 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 소수성 변형-고정된 효소는 바이오디젤로서 또는 표면 활성 성분(surface-active ingredients) 제조용의 중간체로서 사용되는 지방산 알킬 에스테르의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
그러므로, 구조화된 지질의 제조용 효소 공정은 본 명세서에 개시된 본 발명의 변형-고정된 효소 또는 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 변형-고정된 효소의 존재 하에서 유리 지방산, 트리글리세라이드, 지방산 에스테르, 부분 글리세라이드, 인지질 또는 다른 지방산 유도체와 같은 지방산 원료를 메탄올과 같은 알콜과 함께 반응시키는 단계를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은, 본 발명의 리파아제 또는 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 리파아제를 포함하는 식물 오일, 동물 오일, 조류 오일(algal oil) 또는 어류 오일, 또는 이들 중 적어도 둘 이상의 혼합물로부터 얻어진 지방산 원료에 메탄올을 단계적으로 첨가하고 상기 지방 알킬 군 또는 지방산들이 지방산 메틸 에스테르로 전환될 때까지 적절한 조건 하에서 반응을 진행시키는 단계를 포함하는, 지방산의 단쇄 알킬 에스테르, 바람직하게는 지방산 메틸 에스테르(바이오디젤)의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 제조 방법에서, 상기 식물 오일은 콩유(soybean oil), 카놀라유(canola oil), 평지씨유(rapeseed oil), 올리브유(olive oil), 비버 오일(castor oil), 팜유(palm oil), 해바라기 오일(sunflower oil), 땅콩 오일(peanut oil), 면실유(cotton seed oil), 자트로파 유(Jatropha oil)폐식용유, 또는 비식용 식물원으로부터 유래된 오일 트리글리세라이드일 수 있으나, 이들에 국한되지는 않는다.
본 발명은 다음의 도면을 통해 보다 상세하게 설명될 것이다.
도 1: 공유결합에 의해 지방산 에폭사이드로 피복된 효소의 제조 공정에 대한 개략적인 예시.
도 2A: 버퍼 용액 내에서, 본 발명의 고정된 무코르 미에헤이(M. miehei) 리파아제의 가수분해 활성과 고정되고 비공유결합에 의해 계면활성제(surfactant) 또는 지질로 피복된 동일한 효소의 가수분해 활성과의 비교.
도 2B: 버퍼 용액 내에서, 본 발명의 고정된 무코르 미에헤이 리파아제의 합성 활성과 고정되고 비공유결합에 의해 계면활성제 또는 지질로 피복된 동일한 효소의 가수분해 활성과의 비교.
도 3A: 아세톤 내에서, 본 발명의 고정된 무코르 미에헤이 리파아제의 가수분해 활성과 고정되고 비공유결합에 의해 계면활성제 또는 지질로 피복된 동일한 효소의 가수분해 활성과의 비교.
도 3B: 아세톤 내에서, 본 발명의 고정된 무코르 미에헤이 리파아제의 합성 활성과 고정되고 비공유결합에 의해 계면활성제 또는 지질로 피복된 동일한 효소의 가수분해 활성과의 비교.
도 4A: n-헥산 내에서, 본 발명의 고정된 무코르 미에헤이 리파아제의 가수분해 활성과 고정되고 비공유결합에 의해 계면활성제 또는 지질로 피복된 동일한 효소의 가수분해 활성과의 비교.
도 4B: n-헥산 내에서, 본 발명의 고정된 무코르 미에헤이 리파아제의 합성 활성과 고정되고 비공유결합에 의해 계면활성제 또는 지질로 피복된 동일한 효소의 가수분해 활성과의 비교.
도 5: 이어지는 에스테르교환(transesterification) 반응에서 동일 회분(batch)의 생촉매(biocatalyst)를 사용하여 다양한 주형(matrices)에 고정된 써모마이세스 라누기노사 리파아제를 사용하는 지방산 메틸 에스테르로의 반응 전환율(%). 반응 조건: 자동 온도 조절 장치 교반기(thermostated shaker)에서 콩유(2.5g), 메탄올(1시간 개별적으로 0.3g씩 3회 첨가됨) 및 고정된 리파아제(250mg)를 30℃에서 4시간 동안 혼합한다.
도 6: 이어지는 에스테르교환 반응에서 동일 회분의 생촉매를 사용하여 다양한 주형에 고정된 칸디다 안타르티카 B 리파아제를 사용하는 지방산 메틸 에스테르로의 반응 전환율(%). 반응 조건: 도 5의 반응 조건과 동일.
도 7: 이어지는 에스테르교환 반응에서 동일 회분의 생촉매를 사용하여 다양한 주형에 고정된 수도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia) 리파아제를 사용하는 지방산 메틸 에스테르로의 반응 전환율(%). 반응 조건: 도 5의 반응 조건과 동일.
도 8: 이어지는 에스테르교환 반응에서 동일 회분의 생촉매를 사용하여 다양한 주형에 고정된 알칼리제네스 속 리파아제를 사용하는 지방산 메틸 에스테르로의 반응 전환율(%). 반응 조건: 도 5의 반응 조건과 동일.
[발명의 상세한 설명]
단쇄 알콜 및 단쇄 지방산과 같은 친수성 기질에 대해 높은 내성이 있고, 고도로 활성화되고 안정된 고정된, 신규한 계면 효소, 보다 상세하게는 리파아제 및 포스포리파아제에 대한 연구 후에, 본 발명의 발명자는 상기 효소의 활성 부 위(active-site) 근처에서 에스테르교환 반응 매개물질의 소수성 미세환경이 리파아제의 활성을 강화하고 친수성 단쇄 알콜 및 산뿐만 아니라, 혼합 반응에서 존재할 수 있는 다른 친수성 제제에 대한 이들의 내성을 증가시키는 수단으로서 제공될 수 있다는 것을 발견하였다.
그러므로 본 발명의 발명자는 효소를 불용성 주형에 고정시키고, 소수성이 되게 하는, 다른 효소 제조 방법을 개발하였다. 상기 효소는, 이하에서 설명되는 바와 같이, 예를 들어, 지질 에폭사이드를 가하여 에폭시화하는 것과 같은 친유성 잔기(lipophilic residues)의 부착에 의하여 직접적으로 소수성이 부여되거나, 또는 상기 효소를 둘러싸거나 상기 효소를 함침시키는 소수성 미세환경을 제공하는 소수성 주형 위에 고정시킴으로써 소수성이 부여될 수 있다. 이러한 연구과정에서, 상기 효소의 활성 부위 근처의 소수성 미세환경은 상기 효소가 친수성 부분(hydrophilic moieties)을 갖는 기질 및 생성물의 저해 농도(inhibiting concentration)에 노출되는 것을 막을 수 있는, 버퍼 영역으로서 작용한다는 것이 입증된다. 상기 효소에 제공된 상기 소수성 미세환경은 단쇄 알콜의 비저해 농도(non-inhibiting concentration) 범위가 상기 효소의 활성 부위로 접근하는 것을 제어하게 되고, 또한 상기 효소의 활성 부위 근처에서 형성된 친수성 반응 생성물을 반응 매질 속으로 제거하게 된다.
그러므로, 본 발명의 하나의 측면에 따르면, 상기 소수성 고정된 효소는 실질적으로 다음과 같은 두 단계의 기술에 의해 제조될 수 있다:
1 단계: 수상(aqueous phase) 및 지질 에폭사이드를 포함하는 유기 상(organic phase)으로 이루어진 2상 시스템에서 계면 효소들을 상기 지질 에폭사이드와 반응시킴으로써 모든 계면 효소 분자들을 활성 형태로 만드는 단계(도 1 참조). 상기 지질 에폭사이드는 과량으로 존재하고, 따라서 각 효소 분자는 다량의 지질 분자로 공유결합에 의해 피복된다.
2 단계: 공유결합에 의해 피복된 상기 효소를 이미 포함하고 있는 2상 시스템에 적절한 지지체를 첨가하는 단계.
이러한 조건 하에서, 지질 잔기 또는 복합체와 공유결합에 의해 피복된, 2상 경계면에 위치한 상기 효소 분자들은 단순한 물리적 흡착, 에폭시기 또는 알데히드기와 같은 작용기를 포함하는 활성화된 수지와 공유결합, 또는 이온교환수지에의 흡착에 의해 상기 지지체에 빠르게 고정화될 수 있다.
이러한 2단계 기술이 본 발명에 따른 활성을 갖는 변형-고정된 계면 효소의 제조 방법에 이용된다.
이러한 측면에 따르면, 본 발명은 안정되고, 고도로 활성화된 변형-고정된 계면 효소, 보다 상세하게는 리파아제, 에스테라아제 및 포스포리파아제를 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 수성 버퍼 용액 및 지질 에폭사이드를 포함하는 적어도 하나의 유기 용매로 이루어진 2상 시스템이 제공되며; 상기 효소가 과량의 상기 2상 시스템과 혼합되고; 고체 지지체가 상기 혼합물에 첨가되며; 그리고 공유결합에 의해 지질로 피복되고, 상기 지지체에 고정된 계면 효소가 분리된다.
상기 고체 지지체는 바람직하게는 유기 화합물 또는 무기 화합물일 수 있는 다공성 지지체이고, 보다 상세하게는 상기 유기 화합물 또는 무기 화합물은 실리카 -기반 및 알루미나-기반 지지체와 같은 다공성 무기 지지체, 고분자-기반 지지체와 같은 유기 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 지지체가 에폭시기 또는 알데히드기와 같은 활성 작용기 및 이온기를 선택적으로 포함할 수 있다. 몇 가지 구체적인 지지체들이 다음의 실시예, 보다 상세하게는 표 1에 열거되어 있다.
상기 2상 시스템은 적절한 수성 버퍼 및 유기 용매로부터 제조된다. 이러한 유기 용매는 (옥탄과 같은) 알칸, (디-이소프로필 에테르와 같은) 에테르, (n-옥탄올과 같은) 알콜, (데칸알데히드와 같은) 알데히드 및 (2-옥탄온과 같은) 케톤 그리고 이들의 혼합물일 수 있으나, 이들에 국한되지는 않는다.
본 발명의 고정된 효소 또는 본 발명의 에폭시화 방법에 의해 제조된 고정된 효소는 매우 활성적이고, 특히 안정적이며, 단쇄 알콜 및 단쇄 지방산과 같은 친수성 기질에 대해 높은 내성을 갖고 있다. 10 싸이클(cycles)의 반응 후에도 활성이 약 90%까지 유지된다. 이러한 안정성은 비용을 절감하는데 중요하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 에폭시화 및 지질 부분으로 효소를 피복시킬 필요가 없는, 대체적인 리파아제 소수화 방법에 관한 것이다. 소수성 미세환경을 가지며 물리적으로 부착되어 고정된 효소는 수용액 시스템 또는 다른 리파아제를 포함하는 물-유기 용매 2층(bi-layer) [2상(bi-phase)이라고도 함] 시스템을 포함하는 소수성 다공성 고분자 주형에 접촉시킴으로써 제조되었다. 바이오디젤 및 글리세롤을 생산하기 위해, 이렇게 제조되는 상기 고정된 효소를 오일 트리글리세라이드 및 메탄올 사이에서 에스테르교환 반응에서 실험하였고, 이러한 연구과정에서 에스테르교환 반응이 반응 모델로서 사용되었다. 이론에 구속되지 않고, 상기 미 세환경의 소수성 특징이 상기 효소 분자 근처에서 상기 친수성 기질의 농도를 줄이게 된다는 점이 제안된다. 이러한 친수성 기질은 상기 반응에서 사용된 기질/기질들 또는 상기 반응에 의해 형성된 생성물일 수도 있다. 이러한 "소수화(hydrophobicized)"된 생촉매는 상기 효소 근처에 도달하는 상기 친수성 단쇄 알콜 및 산 반응물의 농도를 제어하고/하거나 상기 효소 분자들의 근처에서 형성된 친수성 기질을 빠르게 제거한다. 주요 결과로서, 상기 효소 분자들은, 상기 고정된 효소의 근처에 도달하는 반응물의 농도를 제어하는 것뿐만 아니라, 상기 반응에 의해 형성된 친수성 생성물을 빠르게 제거함으로써 상기 친수성 기질 및 생성물로부터 보호된다. 실시예 5에서 보여지는 바와 같이, 이러한 제안을 소수성(hydrophobicity)이 다른 4개의 지지체에 개별적으로 고정된, 4개의 다른 리파아제로 각각 시험하였다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 지방산 단쇄 알킬 에스테르, 보다 상세하게는 지방산 메틸 에스테르(바이오디젤)의 제조 방법에 관한 것이다. 일반적으로 상기 방법에서, 처음에 메탄올이 식물 오일, 동물 오일, 조류 오일, 어류 오일 또는 진균류로부터 유래되는 오일 또는 이들 중 적어도 둘 이상의 혼합물에 단계적으로 첨가된다. 본 발명의 제조 방법에 의한 실시예로서 제조된, 지질로 공유결합에 의해 피복된 고체 지지체에 고정된 변형된 리파아제, 또는 본 발명에 따라 소수성 주형에 고정된 리파아제가 상기 메탄올/지방산 원료 혼합물에 첨가되고, 상기 지방산 원료가 지방산 메틸 에스테르로 전환될 때까지 상기 반응이 진행된다.
본 명세서 내에서 지지체, 주형, 흡착제(adsorbent)라는 용어는 동의어로 사 용되었고, 혼용될 수 있다.
공정, 단계 및 물질이 약간 변경될 수 있기 때문에 본 명세서에서 명시한 바와 같이, 본 발명이 구체적인 실시예, 공정 단계, 그리고 물질에 국한되지 않는 것임을 이해해야 한다. 또한 본 발명의 범위는 첨부된 청구항 및 이들의 균등물에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본 명세서에 사용된 용어는 단지 구체적인 실시태양을 설명하기 위한 목적으로만 사용된 것이지 그 용어에만 국한시키려는 의도가 없는 것임을 이해해야 한다.
명백하게 복수형이 아니라고 기술되지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수형 지시대상물은 복수형을 포함하는 것임을 유념해야 한다.
본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐, 문맥에서 그렇지 않다고 하지 않는 한, "포함"이라는 단어는 명시된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함한다는 의미이지, 다른 정수 또는 단계, 또는 다른 정수 또는 단계의 그룹을 제외한다는 의미가 아닌 것임을 이해해야 할 것이다.
다음의 실시예들은 본 발명을 수행함에 있어서 본 발명자들에 의해 사용된 대표적인 기술들이다. 이러한 기술들은 본 발명의 실행을 위한 바람직한 실시태양의 대표적인 예임과 동시에, 본 명세서에 비추어 볼 때, 당업자들이 본 발명의 의도된 범위에서 벗어나지 않는 여러 가지 변형을 할 수 있다는 것을 인식해야 할 것이다.
[실시예]
실시예 1
고정된 리파아제( 리포자임 TL )의 제조
0.05 M 및 pH 6.5의 인산염 버퍼 1 ml와 지질 에폭사이드를 포함하는 n-헥산 10 ml로 이루어진 2용매 시스템에 써모마이세스 라누기노사로부터 유래한 리파아제(1ml의 리포자임(Lipozyme) TL 100L, 노보자임사, 덴마크)를 혼합하였다. 상기 혼합물을 48시간 동안 교반하였다. 지지체(1g)를 상기 시스템에 첨가하였고, 상기 혼합물을 8시간 동안 교반하였다. 상기 변형-고정된 효소를 포함하는 상기 지지체를 여과하였고, 건조 용기 내에서 밤새 건조하여 공유결합에 의해 지질로 피복된 고활성의 고정된 리파아제를 얻었다.
표 1은 다른 지지체에 고정된 리포자임 TL 100L의 상대적인 에스테르교환 활성을 보여준다. 고정된 리파아제(0.2g)를 콩유(2.5g)와 메틸 알콜(0.3g)에 첨가함으로써 상기 반응들을 진행시켰다. 상기 반응 시스템은 30℃에서 자기적으로(magnetically) 혼합하거나 흔들어줌으로써 혼합하였다. 위에 언급된 조건하에서, 1시간 후에 생성된 지방산 메틸 에스테르를 측정함으로써, 상기 반응속도(reaction rate)를 결정하였다.
표 1: 지방산 메틸 에스테르(FAME)를 얻기 위해 콩유 트리글리세라이드(soybean oil triglyceride)의 에스테르교환반응용의 다른 지방산 에폭사이드로 변형된(epoxide-modified) 리포자임을 사용하는 반응속도. 반응 조건: 올리브 유(2.5g) 및 메탄올(0.2g)을 다른 지지체(0.2g)에 변형-고정된 리파아제 TL 100L와 1시간 동안 혼합한다. 상기 반응 혼합물을 30℃에서 300rpm으로 흔들어 준다.
지지체 종류 반응율(micromol FAME/min.g biocatalyst)
엠버라이트(Amberlite) XAD 4 (Rohm & Haas, USA) 16
엠버라이트 XAD 16 (Rohm & Haas) 12
엠버라이트 XAD 7HP (Rohm & Haas) 10
엠버라이트 XAD 16HP (Rohm & Haas) 22
듀오라이트(Duolite) XAD 761 (Rohm & Haas) 11
엠버라이트 XAD 1180 (Rohm & Haas) 9
엠버라이트 XAD 1600 (Rohm & Haas) 8
듀오라이트 A7 (Rohm & Haas) 12
듀오라이트 A561 (Rohm & Haas) 10
듀오라이트 A568 (Rohm & Haas) 12
듀오라이트 C467 (Rohm & Haas) 6
엠버리스트(Amberlyst) A-21 (Rohm & Haas) 10
다우엑스 모노스피어(Dowex monosphere) 77 (DOW, USA) 13
다우엑스 옵티포어(Dowex optipore) L493 (DOW, USA) 12
다우 스티렌(Dow styrene) DVB (DOW, USA) 18
MTO 다우엑스 옵티포어 SD-2 (DOW, USA) 10
다우엑스 MAC-3 9
엠버라이트 FPA53 (Rohm & Haas) 11
엠버라이트 FPC22H (Rohm & Haas) 10
엠버라이트 FPA4OCl (Rohm & Haas) 2
엠버라이트 IRC50 (Rohm & Haas) 7
퓨로라이트(Purolire) A109 (Purolite, USA) 12
실시예 2
고정된 리파아제의 제조
다른 리파아제(100mg)를 사용하고, 트리글리세라이드 에폭사이드를 사용하여 실시예 1의 고정화 과정을 반복하였다. 위에서 기술한 조건하에서 지방산 메틸 에스테르의 생산에 대한 반응속도가 표 2에 나타나 있다.
표 2: 지방산 메틸 에스테르(FAME)를 얻기 위해 콩유 트리글리세라이드의 에스테르교환반응용의 다른 지방산 에폭사이드로 변형된(epoxide-modified) 다른 리 포자임을 사용하는 반응속도. 반응 조건: 콩유(2.5g) 및 메탄올(0.3g)을 트리글리세라이드 에폭사이드로 공유결합에 의해 피복되고, 엠버라이트 XAD 4 (0.2g)에 고정된 다른 리파아제와 1시간 동안 혼합한다. 상기 반응 혼합물을 30℃에서 300rpm으로 흔들어 준다.
지지체 종류 반응율(micromol FAME/min.g biocat.)
칸디다 안타르티카 9.6
칸디다 루고사 7.7
리조무코르 미에헤이 12.5
수도모나스 세파시아 16.2
페니실리움 카멤베르티이 4.2
알칼리제네스 속 12.3
리조푸스 니베우스 3.4
무코르 자바니쿠스 12.3
리조푸스 오리자에 14.2
아스페르길루스 니게르 6.3
버크홀데리아 속 12.1
써모마이세스 라누기노사 17.1
크로모박테리움 비스코숨 15.1
실시예 3
지방산 메틸 에스테르(바이오디젤) 제조용의 고정된 리파아제
지지체로서 엠버라이트 XAD 8 또는 세라이트(Celite)(분말), 유기 용매로서 버퍼 (콘트롤) n-헥산 또는 아세톤(Ac)을 사용하여, 실시예 1의 제조 방법에 따라 변형-고정된 무코르 미에헤이 리파아제를 제조하였다.
상기 제조방법은 지방산 메틸 에스테르(바이오디젤)의 제조에 이용되었다. 상기 반응은 고정된 리파아제(100mg)을 첨가하고 30℃에서 6시간 동안 반응 매질을 흔들어 줌으로써 개시된다.
상기 다른 효소 제조 방법의 친수성 활성 및 합성 활성[상기 효소가 공유결 합에 의해 올레산으로 피복되는 버퍼-에폭사이드-OA 및, 상기 효소가 오일(트리글리세라이드, 예. 트리올레인(triolein))로 공유결합에 의해 피복되는, 버퍼-에폭사이드-오일]을 다른 효소 제조 방법(공유결합에 의해 지질로 피복되지 않음.)의 친수성 활성 및 합성 활성과 비교하였다: 상기 효소가 상기 지지체에 단순히 고정되는, 버퍼 (콘트롤); 상기 지지체-고정 효소가 상기 지방산으로 공유결합에 의해 피복되는, 버퍼-올레산(Oleic acid)(버퍼-OA); 상기 지지체-고정 효소가 소르비탄 모노스테아린산(sorbitan monostearate)으로 피복되는, 버퍼-SMO.
상기 결과는 도 2 내지 도 4에 나타나 있다. 상기 도면에서 볼 수 있듯이, 본 발명의, 지질 성분으로 공유결합에 의해 피복된 효소의 친수성 활성 및 합성 활성 모두 상기 다른 효소 제조 방법보다 상당히 현저하게 높았다.
또한, 10 싸이클 이상의 반응 후에도 상기 효소의 활성이 대부분 유지된다(데이터는 표시하지 않음).
그러므로, 본 발명의 에폭사이드로 변형된 효소 제조 방법은 고도의 활성 및 증가된 안정성을 보인다.
실시예 4
버퍼 시스템 또는 2상 시스템에서의 리파아제의 고정
리파아제(덴마크 노보자임사의 3000 단위의 써모마이세스 라누기노사와 칸디다 안타르티카 리파아제 B, 일본 아마노 엔자임 주식회사의 수도모나스 세파시아, 일본 메이토 상요사의 알칼리제네스 속 리파아제)를 고분자 지지체(1g)를 포함하는 버퍼 용액(10ml, pH 7) 내에서 8시간 동안 실온에서 혼합하였다. 상기 고정된 효소를 여과하였고, 건조 용기 내의 실리카 위에서 건조시켰다. 상기 동일한 공정이 유사한 부피의 버퍼 용액과, 유기 용매, 예를 들어 이소-옥탄으로 이루어진 2상 시스템에서 진행될 수 있다.
모두 미국, Rohm & Haas사에서 제조된 다음의 지지체들을 사용하였다:
-소수성 흡착제인, 엠버라이트 XAD 1600
-친수성 흡착제인, 엠버라이트 XAD 761
-극성 및 비극성 흡착제인, 엠버라이트 XAD 7HP; 그리고
-극성 음이온 교환수지인, 엠버라이트 IRA-958
실시예 5
바이오디젤의 생산에서 실시예 4의 고정된 리파아제의 사용
바이오디젤과 부산물로서 글리세롤을 생산하기 위한 오일 트리글리세라이드와 메탄올의 에스테르교환반응을 이용하여, 실시예 4에서 제조된 고정된 리파아제의 활성을 평가하였다. 상기 반응들은 10% w/w의 고정된 리파아제를 메탄올(4시간에 걸쳐 1시간마다 0.3g씩 3회 첨가됨)을 포함하며 자기적으로 교반되는, 콩유(2.5g)에 첨가함으로써 개시하였다.
4시간 후에 상기 반응 매질을 교환하면서 동일 회분의 생촉매를 사용하여, 다양한 주형에 고정된 다른 리파아제에 대한 상기 오일의 지방산 메틸 에스테르로 의 전환율(%)을 도 5 내지 도 8에 나타내었다. 엠버라이트R XAD 1600과 같은 소수성 지지체(흡착제)에 고정된 리파아제가 다른 유형의 지지체에 고정된 다른 유사한 효소와 비교하여, 훨씬 많은 수의 회분에 대한 반복적인 사용에 있어서 이들의 에스테르교환 활성을 유지하였다. 또한, 이러한 유형의 반응에 대하여, 친수성 지지체에 고정된 모든 리파아제가 빈약한 에스테르교환 활성을 보였을 뿐만 아니라 연속되는 회분에서도 반복적으로 사용할 수 없다는 것을 분명히 알 수 있다. 엠버라이트R XAD 761 및 엠버라이트R IRA-958과 같은 친수성 지지체에 고정된 리파아제가, 형성된 친수성 반응 생성물, 즉 글리세롤로 포화된 생촉매의 응집을 형성하였음이 주목되었다. 상기 형성된 생성물의 누적과 상기 고정된 효소 근처의 메탄올의 고농도로 인해, 상기 생촉매가 빈약한 활성뿐만 아니라 낮은 수의 반복사용을 보였다.
대조적으로, 엠버라이트R XAD 1600과 엠버라이트R XAD 7HP와 같은 소수성 지지체에 고정된 리파아제, 특히 써모마이세스 라누기노사와 수도모나스 세파시아 리파아제가 더 높은 에스테르교환 활성을 생성하였고, 또한 동일 회분의 생촉매를 사용하여 50 싸이클 이상의 반복 사용에서도 이들의 에스테르교환 활성을 유지하였다.

Claims (22)

  1. 고체 지지체에 고정된 변형된 계면 효소로서,
    상기 계면 효소는 리파아제, 에스테라아제 또는 포스포리파아제이고, 상기 계면 효소는 공유결합된 지질기로 피복되며, 이에 의해, 상기 계면 효소가 소수성 미세환경으로 둘러싸이고, 친수성 제제, 기질, 및 반응 생성물 중 적어도 하나의 존재 하에서 비활성화 및 응집 중 적어도 하나로부터 보호되고,
    상기 공유결합된 지질기로의 피복은 원래의 에폭시기를 통해 지질 에폭사이드를 상기 계면 효소의 표면 작용기에 공유결합함으로써 달성되는, 변형된 계면 효소.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 지지체는, 흡착 또는 작용기와의 공유결합에 의해 상기 계면 효소와 결합할 수 있고, 다공성 소수성 고분자-기반 지지체이며, 상기 지지체는 에폭시기, 알데히드기 및 이온기 중 하나인 활성 작용기를 포함하는, 변형된 계면 효소.
  4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 지지체는 소수성 지방족 및 아크릴 가교 고분자 또는 소수성 방향족 가교 고분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 고분자-기반 지지체인, 변형된 계면 효소.
  5. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 지질 에폭사이드는 지방산, 지방산 알킬 에스테르, 당 지방산 에스테르, 중쇄 및 장쇄 알킬 글루코시드, 인지질, 및 폴리에틸렌글리콜로부터 선택되는, 변형된 계면 효소.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 계면 효소는 칸디다 안타르티카, 칸디다 루고사, 리조무코르 미에헤이, 수도모나스 속, 리조푸스 니베우스, 무코르 미에헤이 무코르 자바니쿠스, 리조푸스 오리자에, 아스페르길루스 니게르, 페니실리움 카멤베르티이, 알칼리제네스 속, 버크홀데리아 속, 써모마이세스 라누기노사, 크로모박테리움 비스코숨, 파파야 씨(papaya seeds) 및 판크레아틴(pancreatin)으로 부터 유래된 효소들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 계면 효소.
  9. 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 변형된 계면 효소의 제조 방법으로서,
    (a) 버퍼 수용액과, 지질 에폭사이드를 포함하는 적어도 하나의 유기용매를 포함하는 시스템을 제공하는 단계;
    (b) 상기 계면 효소와 상기 (a)단계에서 제공된 이중 용매 시스템을 혼합하는 단계;
    (c) 상기 지지체를 상기 (b)단계의 혼합물에 첨가하고 혼합하는 단계;
    (d) 상기 (c)단계에서 얻은 혼합물로부터 상기 지지체에 고정된 계면 효소를 분리하는 단계를 포함하는, 변형된 계면 효소의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 지지체는 다공성 소수성 고분자-기반 지지체이고, 상기 지지체는 에폭시기 또는 알데히드기 및 이온기 중 하나로부터 선택된 활성 작용기를 포함하는, 변형된 계면 효소의 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 지질 에폭사이드는 지방산, 지방산 메틸 에스테르, 당 지방산 에스테르 또는 중쇄 및 장쇄 알킬 글루코시드, 인지질, 및 폴리에틸렌글리콜로부터 선택되는, 변형된 계면 효소의 제조 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 지방산 메틸 에스테르의 제조 방법으로서,
    제 1 항에 정의된 리파아제를 포함하는 식물 오일, 동물 오일, 조류 오일 또는 어류 오일, 또는 이들 중 적어도 둘 이상의 혼합물에 메탄올을 단계적으로 첨가하는 단계와,
    오일 트리글리세라이드가 지방산 메틸 에스테르로 전환될 때까지 반응을 진행시키는 단계를 포함하는, 지방산 메틸 에스테르의 제조 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 식물 오일은 콩, 카놀라, 평지씨, 올리브, 팜유, 해바라기 오일, 땅콩 오일, 면실유, 폐식용유, 또는 비식용 식물원으로부터 유래된 오일 트리글리세라이드인, 지방산 메틸 에스테르의 제조 방법.
  21. 지방산 메틸 에스테르의 제조 방법으로서,
    제 9 항의 제조 방법에 따라 제조된 리파아제를 포함하는 식물 오일, 동물 오일, 조류 오일 또는 어류 오일, 또는 이들 중 적어도 둘 이상의 혼합물에 메탄올을 단계적으로 첨가하는 단계와,
    오일 트리글리세라이드가 지방산 메틸 에스테르로 전환될 때까지 반응을 진행시키는 단계를 포함하는, 지방산 메틸 에스테르의 제조 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 식물 오일은 콩, 카놀라, 평지씨, 올리브, 팜유, 해바라기 오일, 땅콩 오일, 면실유, 폐식용유, 또는 비식용 식물원으로부터 유래된 오일 트리글리세라이드인, 지방산 메틸 에스테르의 제조 방법.
KR1020097025617A 2007-05-09 2008-05-07 유기 매질에서 친수성 기질에 대해 고내성인 변형-고정된 효소 KR101560842B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL183084 2007-05-09
IL183084A IL183084A0 (en) 2007-05-09 2007-05-09 Modified-immobilized enzymes of high tolerance to hydrophilic substrates in organic media

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100023853A KR20100023853A (ko) 2010-03-04
KR101560842B1 true KR101560842B1 (ko) 2015-11-20

Family

ID=40002723

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097025617A KR101560842B1 (ko) 2007-05-09 2008-05-07 유기 매질에서 친수성 기질에 대해 고내성인 변형-고정된 효소

Country Status (13)

Country Link
US (1) US9068175B2 (ko)
EP (1) EP2152866B1 (ko)
JP (1) JP5484318B2 (ko)
KR (1) KR101560842B1 (ko)
CN (1) CN101790582B (ko)
AU (1) AU2008249564B2 (ko)
BR (1) BRPI0811312A2 (ko)
CA (1) CA2686917C (ko)
DK (1) DK2152866T3 (ko)
ES (1) ES2447540T3 (ko)
IL (2) IL183084A0 (ko)
MX (1) MX2009012132A (ko)
WO (1) WO2008139455A2 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9168469B2 (en) 2004-12-22 2015-10-27 Chemtor, Lp Method and system for production of a chemical commodity using a fiber conduit reactor
US10526299B2 (en) 2004-12-22 2020-01-07 Chemtor, Lp Fiber conduit reactor with a heat exchange medium inlet and a heat exchange medium outlet
IL180598A0 (en) * 2007-01-08 2007-07-04 Basheer Sobhi Immobilized interfacial enzymes of improved and stabilized activity
US8617866B2 (en) * 2007-11-28 2013-12-31 Sobhi Basheer Robust multi-enzyme preparation for the synthesis of fatty acid alkyl esters
BR112012022006B1 (pt) 2010-03-01 2021-02-23 Trans Bio-Diesel Ltd um processo para a síntese enzimática de alquil ésteres de ácido graxo
US10000731B2 (en) 2010-03-01 2018-06-19 Trans Bio-Diesel Ltd. Enzymatic transesterification/esterification processes employing lipases immobilized on hydrophobic resins in the presence of water solutions
JP5178888B2 (ja) * 2011-08-02 2013-04-10 日清オイリオグループ株式会社 エステル交換油の製造方法
ES2601802T3 (es) * 2011-08-31 2017-02-16 Trans Bio-Diesel Ltd. Transesterificación enzimática con lipasas inmovilizadas sobre resinas hidrófobas en soluciones acuosas
WO2014047195A1 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Chemtor, Lp Use of a fiber conduit contactor for metal and/or metalloid extraction
WO2014100454A1 (en) * 2012-12-19 2014-06-26 John Lee Massingill Enzymatic chemical processing in a fiber conduit apparatus
US20150353970A1 (en) 2012-12-31 2015-12-10 Trans Bio-Diesel Ltd. Enzymatic transesterification/esterification processing systems and processes employing lipases immobilzed on hydrophobic resins
CN104293764A (zh) * 2013-07-19 2015-01-21 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 一种磷脂酶a1的固定化方法
CN103451174A (zh) * 2013-09-22 2013-12-18 清华大学 一种酶-高分子结合物及其制备方法与应用
CN106811455A (zh) * 2015-11-27 2017-06-09 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 固定化酶及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000075295A1 (en) * 1999-06-02 2000-12-14 Novozymes A/S Chemically modified lipolytic enzyme

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK306189D0 (da) 1989-06-21 1989-06-21 Novo Nordisk As Immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf til estersyntese
US5932212A (en) * 1996-05-24 1999-08-03 Altus Biologics, Inc. Crosslinked protein crystal formulations and their use as catalysts in organic solvents
IL129086A0 (en) 1999-03-22 2000-02-17 Enzymotec Ltd Surfactant-lipase complex immobilized on insoluble matrix
AU8760898A (en) * 1997-09-24 1999-04-12 Enzymotec Ltd. Surfactant-lipase complex immobilized on insoluble matrix
WO1999033964A1 (en) 1997-12-23 1999-07-08 Novo Nordisk A/S A process for immobilisation of enzymes
IL142952A (en) * 2001-05-03 2005-12-18 Enzmotec Ltd Process for enzyme-catalyzed production of 1,2 diacylated phospholipids
CA2495944C (en) * 2002-08-16 2011-02-22 Dow Corning Corporation Enzyme catalyzed organosilicon carbohydrates
WO2005005977A2 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Applera Corporation Fluorescent phospholipase assays and compositions
US20050031657A1 (en) * 2003-07-18 2005-02-10 Gilson Michael K. Hydrosomes; chemical vessels for laser-guided microfluidics
US20080268287A1 (en) 2005-11-11 2008-10-30 Elena Donadio Method of Converting Water-Soluble Active Proteins Into Hydrophobic Active Proteins, the Use of the Same for the Preparation of Monomolecular Layers of Oriented Active Proteins, and Devices Comprising the Same
GB0600134D0 (en) * 2006-01-05 2006-02-15 Vernique Biotech Ltd Use of epoxidised molecules
IL180598A0 (en) 2007-01-08 2007-07-04 Basheer Sobhi Immobilized interfacial enzymes of improved and stabilized activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000075295A1 (en) * 1999-06-02 2000-12-14 Novozymes A/S Chemically modified lipolytic enzyme

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioorg Khim., Vol. 31, No. 6, Pages 593-601(2005.)*

Also Published As

Publication number Publication date
AU2008249564B2 (en) 2014-05-22
EP2152866B1 (en) 2013-12-18
WO2008139455A2 (en) 2008-11-20
EP2152866A2 (en) 2010-02-17
BRPI0811312A2 (pt) 2014-12-30
IL202010A (en) 2016-02-29
IL202010A0 (en) 2011-08-01
WO2008139455A3 (en) 2010-02-25
AU2008249564A1 (en) 2008-11-20
CA2686917A1 (en) 2008-11-20
KR20100023853A (ko) 2010-03-04
EP2152866A4 (en) 2010-09-01
ES2447540T3 (es) 2014-03-12
DK2152866T3 (en) 2014-03-17
US9068175B2 (en) 2015-06-30
JP5484318B2 (ja) 2014-05-07
CN101790582B (zh) 2015-01-21
CA2686917C (en) 2013-07-09
JP2010525834A (ja) 2010-07-29
MX2009012132A (es) 2009-12-01
US20100209982A1 (en) 2010-08-19
IL183084A0 (en) 2007-09-20
CN101790582A (zh) 2010-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101560842B1 (ko) 유기 매질에서 친수성 기질에 대해 고내성인 변형-고정된 효소
KR101556799B1 (ko) 개량되고 안정화된 활성을 갖는 고정된 계면 효소
Facin et al. Driving immobilized lipases as biocatalysts: 10 years state of the art and future prospects
US7790429B2 (en) Robust multi-enzyme preparation for the synthesis of fatty acid alkyl esters
RU2600879C2 (ru) Способы и система для ферментативного синтеза сложных алкилэфиров жирных кислот
RU2573929C9 (ru) Способы ферментативной переэтерификации/этерификации, в которых использованы липазы, иммобилизованные на гидрофобных смолах, в присутствии водных растворов
CN106867989A (zh) 固定化酶及其制备方法
JPH06327486A (ja) 固定化酵素を用いるエステル交換法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180920

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190930

Year of fee payment: 5