CN104293764A - 一种磷脂酶a1的固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种磷脂酶A1的固定化方法，所述方法包括步骤：a）将选自大孔型吸附树脂或离子交换树脂的载体与磷脂酶A1接触，使所述磷脂酶A1固定于所述载体；b)干燥步骤a)中所得的固定有磷脂酶A1的载体，以获得所述固定化磷脂酶A1。本发明还提供了用本发明的方法制备的固定化磷脂酶A1及其应用。本发明的固定化磷脂酶A1具有酯化功能和酸解功能，在油脂工业中可以反复使用，且反应效率高，成本低，有潜在的工业应用。

Description

一种磷脂酶A1的固定化方法

技术领域

本发明涉及食品和生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种磷脂酶A1的固定化方法。 

背景技术

磷脂酶A1是一种羧酸酯水解酶，同时具有脂肪酶和磷脂酶活性，和脂肪酶相比，此酶水解活力高，价格便宜，应用前景广阔。 

酶固定化技术是指采用一定技术手段将酶束缚于一定区域内，使其可以进行其特有的催化反应，并可回收重复利用的一种技术。通过此技术可以提高酶的使用效率，经固定的酶可以进行与产物的分离并可重复利用，提高酶的稳定性，并且便于连续化和自动化操作。 

现有文献专利中描述的可用于油脂改性，酯交换，酯化等的固定化酶技术主要为脂肪酶的固定化，例如在EP0140542中描述了一种关于米黑根毛霉产脂肪酶固定于大孔型弱碱性阴离子交换树脂上，并用于酯交换或者酸解反应。在CN1280189A中描述了一种铜绿假单孢菌产脂肪酶的固定化方法，应用于制备旋光化合物的方法。 

然而，关于磷脂酶固定化的技术较少，且大部分应用在油脂脱胶等磷脂酶常用的情况。在CN101092587A中描述了一种包埋法固定化磷脂酶的方法，此方法以海藻酸钠、壳聚糖为载体，以磷脂酶A2为包埋对象，固定化后主要用于大豆毛油的精炼过程中。在CN1141343A中介绍了一种关于磷脂的酯交换方法，其中涉及了一种对细胞外磷脂酶A2的固定化方法，以氨基丙基化的玻璃珠为载体，用交联-吸附的方法将来源于Lecitase固定之上，来催化甘三酯和磷脂的酯交换反应。在CN102199634A中，描述了一种以DA201大孔型吸附树脂为载体的固定化过程，固定化产品主要用于富含甘二酯的功能性油脂的制备。 

另外，“磷脂酶Lecitase ultra的固定化、结构表征及性质研究（刘宁、赵谋明、汪勇、付敏）”中，描述了一种用大孔吸附型树脂DA201为载体固定磷脂酶 lecitase ultra的方法，但没有提到应用。 

“Hugo S.Garcia、In-Hwan Kim，Enrichment of lecithin with n-3fatty acids by acidolysis using immobilized phospholipase A1”中，描述了一种用酚醛型吸附树脂固定磷脂酶A1的方法，并用于DHA型磷脂的生产，在底物摩尔比1：8，反应时间24h，温度50℃的情况下，DHA接入率达到35%。 

“Ning Liu、Yong Wang，Immobilization of lecitase ultra for production of diacylglycerols by glycerolysis of soybean oil”中，描述了一种用大孔型吸附树脂固定磷脂酶A1的方法，并应用于甘二酯的生产，在合适的条件下，固定化酶重复35次，DAG含量从55%下降至25%。 

但是，上述已有的关于磷脂酶A1的固定化方法，在应用上均存在一定的缺陷，尤其是在生产甘二酯的情况下，固定化磷脂酶的应用范围窄，效果不突出，在工业上很难实施大规模的应用。另外，应用于DHA磷脂生产的情况下，反应时间过长、容易造成DHA的氧化。并且，在现有文献和专利中少有提到固定化磷脂酶A1可用于酯化反应，关于固定化酶的酯化，目前市场上只有诺维信公司产的novozyme435有较强的酯化功能，但价格昂贵。 

实际上，酯化反应在油脂工业生产上有很重要的应用，可用来制备甘二酯，功能性甘三酯，生物柴油等产品。另外，酸解反应可以用于制备磷脂型DHA等功能性磷脂。 

因此，本领域迫切需要开发出新的磷脂酶A1的固定化方法，使得固定化的磷脂酶既具有较强的酯化功能，并且可以进行磷脂的酸解反应，从而扩大磷脂酶在油脂工业的应用范围。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种磷脂酶A1的固定化方法。本发明的另一目的是提供一种固定化的磷脂酶A1。另外，本发明的目的还在于提供本发明的固定化磷脂酶A1在工业中的应用。 

本发明的第一方面，提供了一种磷脂酶的固定化方法，所述方法包括步骤： 

a）将选自大孔型吸附树脂或离子交换树脂的载体与磷脂酶A1接触，使所述磷脂酶A1固定于所述载体； 

b)干燥步骤a)中所得的固定有磷脂酶A1的载体，以获得所述固定化磷脂酶A1。 

在本发明的一个优选实施例中，所述载体与磷脂酶接触前，还包括前处理的步骤。 

在本发明的一个优选实施例中，所述大孔吸附树脂的前处理方法为：将所述大孔吸附树脂置于水中浸泡去杂，然后用有机溶剂浸泡1～24小时，优选2～12小时，以去除有机杂质和不溶物，再用水洗去所述溶剂，优选的，所述有机溶剂为：乙醇、正己烷、丙酮或石油醚。 

在一个优选例中，所述水为去离子水，蒸馏水或双蒸水。 

在另一个优选例中，大孔吸附树脂的前处理中所用的乙醇是浓度范围为100%-50%(V/V)的乙醇。 

在另一个优选例中，大孔吸附树脂的前处理中所述溶剂的添加量范围为树脂体积的0.5-10倍，优选1-5倍。 

在本发明的一个优选实施例中，所述离子交换树脂的前处理方法为：i）使用酸液处理树脂，或酸液和碱液交替处理树脂，ii）使用碱液处理树脂后，将所述树脂水洗至水呈中性。在一个优选实施例中，所述碱液浓度为0.05mol/L～1mol/L。在另一个优选实施例中，所述酸液浓度为0.05mol/L～1mol/L。在一个优选实施例中，所述处理为浸泡或冲洗所述树脂。在一个优选实施例中，所述酸液和碱液交替处理树脂的次数为1-5次。在一个优选实施例中，上述优选方案组合使用。 

在一个优选例中，所述水为去离子水，蒸馏水或双蒸水。 

在另一个优选例中，离子交换树脂的前处理中的所述酸选自：HCl、H₂SO₄或H₃PO₄，所述碱选自：NaOH、氨水或KOH。 

在另一个优选例中，每次碱液和酸液浸泡或冲洗的时间为1-24小时。 

在本发明的一个优选实施例中，所述大孔型吸附树脂为极性大孔型吸附树脂或非极性大孔型吸附树脂，所述离子交换树脂为阳离子交换树脂，优选为强碱性或弱碱性的阳离子交换树脂，或阴离子交换树脂，优选为强碱性或弱碱性的阴离子交换树脂。在一个优选实施例中，优选的树脂的孔径为50～150nm，比表面积为200-2000㎡/g。在一个优选实施例中，所述极性大孔型吸附树脂选自：DA201、LSA-10、Amberlite XAD7HP、LX1010C或其组合。在一个优选实施例中，所述非极性大型孔吸附树脂选自：D101、HPD100A、AmberliteXAD-4或其组合。在一个优选实施例中，所述阳离子交换树脂选自：D113、D001、Ambetlite IRC50或其组合。在一个优选实施例中，所述阴离子交换树脂选自：D311、D382、NKX-8、D213、D201、LX1000HA或其组合。 

在本发明的一个优选实施例中，所述磷脂酶A1选自：嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus），尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），南极假丝酵母（Candida  antarctica），褶皱假丝酵母（Candida rugosa），米黑根毛霉（Rhizomucor miehei），爪哇毛霉（Mucor javanicus），雪白根霉（Rhizopusnivenus），米黑毛霉（Mucor miehei），假单孢菌（Pssudomonas sp.），米根霉（Rhizopus oryzae），黑曲霉（Aspergillus niger），卡门柏青霉（Penicillium camembertii），产碱杆菌（Alcaligenes sp.），伯克霍尔德氏菌（Burkholderiasp.）,疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosa），或粘稠杆菌（Chromobacterium viscosum）表达的磷脂酶；通过基因工程，蛋白质工程改造而得的磷脂酶A1，或市售的磷脂酶A1。 

在另一个优选例中，所述市售的磷脂酶为丹麦诺维信公司的商品名为Lecitase Ultra的磷脂酶A1酶液或丹尼斯克公司产商品名为FoodPro LysoMax oil的磷脂酶液。 

在一个优选实施例中，所述载体和磷脂酶A1的比例为1:0.5～1:5，优选为1:0.8～1:1.2。 

在一个优选实施例中，所述载体和磷脂酶A1的固定化时间为1～30小时，优选为2～8小时。 

在一个优选实施例中，所述步骤b）中的干燥方式选自流化床干燥、自然干燥或真空干燥。 

在另一个实施方式中，所述固定化方法为吸附法、吸附交联法或吸附交联两相法。 

本发明还提供了一种固定化磷脂酶A1或其包装产品。 

本发明提供的固定化磷脂酶是通过前述的方法制得。 

本发明还提供了前述固定化磷脂酶A1或其包装产品用于催化酯化、酸解或水解反应的用途。 

本发明还提供了一种进行酯化、酸解或水解反应的方法，所述方法包括使用前述的固定化磷脂酶A1作为催化剂。 

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，发现了一种固定化磷脂酶A1的方法，通过采用特定的载体对液体磷脂酶A1进行了固定化，其结果意外地发现固定化后的磷脂酶A1可以以甘油和甲醇、乙醇为酰基受体进行酯化反应，即具有较强的酯化功能，还发现以此方法制作的固定化磷脂酶A1可以将DHA等长链脂肪酸为酰基供体进行酯化或酸解反应。这些反应类型在油脂工业上有巨大的发展潜力，通过 本发明制备的固定化磷脂酶，可以在上述反应中反复使用，且反应效率高，成本低，有潜在的工业应用。在此基础上，完成了本发明。 

本发明提供了一种固定化磷脂酶A1方法，进一步说，提供了一种可以进行酯化反应和酸解反应的固定化磷脂酶A1方法。该方法包括酶固定化，干燥步骤，优选的方案中还包括载体的处理步骤。 

1.载体的选择以及处理 

如本文所用，术语“大孔型吸附树脂”是指一类不含交换基团且具有大孔结构的高分子吸附树脂，其具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从溶液中有选择地吸附有机物。 

如本文所用，术语“离子交换树脂”是指带有官能团(有交换离子的活性基团)、具有网状结构、不溶性的高分子化合物，常用作离子交换层析介质。 

所述载体选自：极性大孔型吸附树脂、非极性大孔型吸附树脂、强碱性或弱碱性的阳离子交换树脂或阴离子交换树脂，所述树脂的孔径为10-1000nm，比表面积为200-2000㎡/g。 

本发明中所使用的载体可包括但不限于：大孔型吸附树脂，例如非极性的D101、HPD100A、AmberliteXAD-4等，极性的DA201、LSA-10、Amberlite XAD7HP、LX1010C等，离子交换树脂，例如阳离子交换树脂，如D113、D001、Ambetlite IRC50等，阴离子交换树脂，如D311、D382、NKX-8、D213，D201，LX1000HA等。 

在本发明中，所述载体优选骨架为丙烯酸甲酯型和苯乙烯型的碱性离子交换树脂。具体如下：丙烯酸甲酯型的树脂包括：丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸甲酯，交联聚丙烯酸甲酯，交联聚甲基丙烯酸甲酯及甲基丙烯酸酯与苯乙烯或二乙烯苯的共聚物。其中离子交换基团为胺基基团，优选伯胺基团，也可连接仲胺、叔胺、季胺等碱性基团。功能基团含量为0.1-3.5mmol/g，优选0.5-3.0mmol/g。孔径分布为1-200nm，优选25-100nm。粒径分布为0.1-0.5mm，优选0.15-0.3mm。比表面积100-10000㎡/g，优选200-600㎡/g。苯乙烯型的树脂包括：苯乙烯与二乙烯苯的共聚物，上面接有碱性离子交换基团，优选季胺基碱性基团，也可连接伯胺、仲胺、叔胺等弱碱性离子交换基团。功能基团含量为0.1-3.5mmol/g（1.2-3.0mmol/g）。孔径分布1-200nm，优选55-100nm。粒径分布为0.1-1.3mm，优选0.3-0.7mm。比表面积100-10000㎡/g，优选200-600㎡/g。 

本发明的载体还可为基于以上或其它树脂的改性或改良树脂，例如通过重氮 化或氨基化改性的树脂或采用其它化学改性手段经功能化处理的树脂。可参考例如徐敬亮等，氨基功能载体固定化酶研究进展化工进展201029(3):494-496。 

本领域技术人员应理解，可用于本发明中的聚苯乙烯，丙烯酸型大孔吸附树脂和离子交换树脂除了以上用商品名所限定的具体产品以外，还包括任何具有其它商品名的市售树脂产品或通过自行制备或加工得到的树脂，只要它们具有与所述具体产品相同或相似的结构和吸附或交换性能。 

本发明的载体的前处理方法为，大孔型吸附树脂的处理方法是水洗去杂-醇洗去残留溶剂-水洗至中性，离子交换树脂处理方法是酸碱交替处理，后处理至中性备用。具体步骤如下: 

大孔型吸附树脂的处理方法：将载体置于去离子水(也可用蒸馏水，双蒸水)中浸泡去杂，然后用适当的溶剂浸泡1～24h，去除有机杂质和其它不溶物，再用去离子水(或蒸馏水、双蒸水)洗去溶剂，置于去离子水(或蒸馏水、双蒸水)中备用。其中，所用溶剂可为：乙醇，优选浓度范围为100%-50%(v/v)的乙醇；甲醇、丙酮、石油醚等有机溶剂。所述溶剂的添加量范围为树脂体积的0.5-10倍，优选1-5倍。 

离子交换树脂：用低浓度(0.05mol/L-1mol/L)的碱液(例如NaOH、KOH或氨水)和酸液(例如HCl、H₂SO₄或H₃PO₄)(酸液和碱液的浓度均为0.05mol/L-1mol/L)交替处理(处理方法可为例如：先用碱液浸泡树脂1～3h(优选2h)，然后洗至中性，再用酸浸泡或冲洗1～3h(优选2h)后，洗至中性，重复该过程1-5次)树脂1-5次，最后一次处理仅用碱液，每次处理时间为1-24小时，处理完毕后用水(优选去离子水、蒸馏水或双蒸水)洗至水呈中性，再浸泡在水(优选去离子水、蒸馏水或双蒸水)中保存备用。经上述处理的离子交换树脂内部的pH保持为碱性，更有利于酶发挥其活性。 

2.酶固定化 

称取一定量处理过的载体于容器中，放入一定量的磷脂酶A1酶液，于15～35℃(优选15～25℃，更优选室温)水浴摇床(可以采用气浴摇床，机械搅拌器和磁力搅拌器，涡流搅拌器的形式)中以10～200rpm(优选50～150rpm)固定。期间每隔一定时间取上清测定剩余蛋白含量来判断酶蛋白的吸附程度，然后取出放入培养皿中吸去残留液体。 

磷脂酶A1来源可以为嗜热丝孢菌/尖孢镰刀菌（Thermomyces lanuginosus/Fus arium oxysporum）在合适的培养条件下发酵而得，也可以是通过基因工程，蛋白 质工程等现代生物学手段改造而得，包括化学修饰的酶，蛋白质工程的突变体或基因工程菌产生的酶。 

用于固定化过程中的酶液可无需经过任何分离、纯化等改变其原有组成或环境的前处理。也可对酶液进行稀释或pH调节等处理，以适于反应。 

用于本发明的磷脂酶A1的来源包括但不限于： 

嗜热丝孢菌/尖孢镰刀菌（Thermomyces lanuginosus/Fusarium oxysporum）在合适的培养条件下发酵而得；嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）中获得的磷脂酶A1基因，通过转基因米曲霉（Rhizopus oryzae）表达，进行深层发酵而得；或者通过地衣芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵生产的液态酶制剂；或者由地衣芽孢杆菌（Bacillus subtilis）得到的，由基因改性毕赤酵母经过发酵生产；或者通过猪胰脏提取的磷脂酶A1。 

本发明的磷脂酶A1，还可以来源于南极假丝酵母（Candida antarctica），褶皱假丝酵母（Candida rugosa），米黑根毛霉（Rhizomucor miehei），爪哇毛霉（Mucor javanicus），雪白根霉（Rhizopusnivenus），米黑毛霉（Mucor miehei），假单孢菌（Pssudomonas sp.），米根霉（Rhizopus oryzae），黑曲霉（Aspergillu s niger），卡门柏青霉（Penicillium camembertii），产碱杆菌（Alcaligenes sp.），伯克霍尔德氏菌（Burkholderiasp.）,疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosa），粘稠杆菌（Chromobacterium viscosum）的发酵产物。 

另外，还可以为商业上可获得的，如丹麦诺维信公司的商品名为Lecitase Ultr a的磷脂酶液或者丹尼斯克公司产商品名为FoodPro LysoMax oil的磷脂酶液。 

在一个优选实施例中，所述载体和磷脂酶A1的比例为1:0.5～1:5（W/V质量/体积），优选为1:0.8～1:1.2。 

在本发明的一个具体实施方案中，所述载体和磷脂酶A1的比例为1:0.5，1:0.6，1:0.7，1:0.8，1:0.9，1:1.0，1:1.1，1:1.2，1:1.3，1:1.4，1:1.5，1:1.6，1:1.7，1:1.8，1:1.9，1:2.0，1:2.1，1:2.2，1:2.3，1:2.4，1:2.5，1:2.6，1:2.7，1:2.8，1:2.9，1:3.0，1:3.1，1:3.2，1:3.3，1:3.4，1:3.5，1:3.6，1:3.7，1:3.8，1:3.9，1:4.0，1:4.1，1:4.2，1:4.3，1:4.4，1:4.5，1:4.6，1:4.7，1:4.8，1:4.9，或1:5.0。 

在一个优选实施例中，所述载体和磷脂酶A1的固定化时间为1～30小时，优选为2～8小时。 

在本发明的一个具体实施方案中，所述载体和磷脂酶A1的固定化时间为1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小 时，11小时，12小时，13小时，14小时，15小时，16小时，17小时，18小时，19小时，20小时，21小时，22小时，23小时，24小时，25小时，26小时，27小时，28小时，29小时，或30小时。 

所述固定方式，可采用水浴摇床或气浴摇床，搅拌机或磁力搅拌器等常规方式。 

固定期间，可每隔一定时间(例如5min～1h)取上清测剩余蛋白含量来判断酶蛋白的吸附/结合程度。剩余蛋白含量的测定可采用考马斯亮蓝法、lorry法、双缩脲法、BCA法等常规蛋白质定量检测方法进行。通常，在剩余蛋白含量低于 

0.1mg/ml～0.5mg/ml时，终止固定步骤。当然，本领域普通技术人员可根据具体的需要(如质量控制要求等)对固定程度进行调整和控制。 

3.干燥 

在固定化步骤进完成以后，通过干燥步骤去除体系中多余的水分，干燥的方式可选自：流化床干燥、自然干燥以及真空干燥。 

流化床干燥，该干燥在流化床中进行(例如德国格拉特公司，型号：midi glatt)，参数设置为进风温度45～55℃(优选40℃)，进风压力为0.1-1.2巴（优选0.6巴），流化至水分含量为0.5％-15％（优选1％-5％）将样品取出备用。 

自然干燥，将固定好的酶先通过抽滤出去可见水分，然后摊开放在通风低温的地方晾干。 

真空干燥，将固定好的酶放入真空干燥箱(厂商：宾德亚太(香港)有限公司，型号：VD23)内，30℃抽真空干燥至水分含量至1％-5％左右。 

本领域普通技术人员可根据需要和条件对常规干燥方法进行选择。 

4.其它可选步骤 

根据具体的需要，本发明的方法中还可额外具有如下的一个或多个可选步骤，例如(但不限于)： 

1将酶液经过过滤除去小分子，以消除酶液中的小分子对酶活的影响。过滤方法可为例如：在超滤膜器上进行超滤(厂商：美国密理博公司，型号：小型)，然后加入磷酸缓冲液(例如pH为5的0.1mol/L的磷酸缓冲液)，并调整到适当的酶蛋白浓度。 

2在固定化步骤中可以加入丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、甘露醇、乳糖、糊精、白蛋白和/或海藻糖等物质增强酶的稳定性，它们各自的优选添加量为：糊 精1～20%(W/V)；白蛋白0.05～5%(W/V)；海藻糖0.1-10%(W/V)。丙二醇1-25%，山梨醇10-50%，甘露醇10-50%，乳糖10-30%，聚乙烯吡咯烷酮0.1-10%。可添加一种或多种上述物质，以获得所需的稳定效果。 

3对载体进行改性处理，通过化学手段接上活性基团。例如，可参考徐敬亮等，氨基功能载体固定化酶研究进展化工进展201029(3):494-496。 

本发明的优点： 

1.本发明中提供了一种磷脂酶A1的固定化方法，该方法中采用选取特定载体和固定化方法，使得原来没有酯化功能的磷脂酶具备了酯化功能并且可以识别长链脂肪酸，保持了原液体酶的水解，酸解功能并提高效率。 

2.通过本发明的磷脂酶A1的固定化方法，使得固定化磷脂酶A1可以在磷脂改性过程中反复使用，提高利用效率，降低生产成本。 

实施例 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《生物化学与分子生物学实验教程》(梁宋平主编高等教育出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 

以下实施例中所使用的磷脂酶购自丹麦诺维信公司（商品名：Lecitase Ultra），根据应用的需求可以做如下处理：1）不加处理直接进行固定化步骤，2）将酶液稀释或浓缩至一定程度进行固定化步骤，3）将酶液进行超滤，置换成需要的体系进行固定化步骤（pH5，0.1mmol/L磷酸盐缓冲液体系）。 

另外，在本发明中所采用的棒状薄层色谱/氢火焰离子化检测器(TLC/FID)是在薄层色谱法基础上，在专用色谱棒（氧化硅或氧化铝）上样品被展开并分离，该棒以恒定的速度通过氢火焰，棒薄层上的已分离的有机物质从氢火焰中获得能量而离子化，而氢火焰离子检测器检测这些离子产生的电流。由于电流强度与进入火焰区的每种有机物质的数量成正比，因而实现定量检测。 

1）下列实施例中通过吸附法固定磷脂酶A1： 

实施例1 

将D213载体先用蒸馏水冲洗去除杂质，放入0.5mol/L NaOH溶液中浸泡2h，水洗至中性，再放入0.5mol/L HCl溶液中浸泡2h，水洗至中性，反复上述步骤3次，最后用0.5mol/L NaOH溶液浸泡2h，水洗至中性。 

称取处理好的载体D21340g于250ml三角瓶中，加入lecitase Ultra酶液80ml，置于25℃摇床中150rpm振荡，1.5h后取出混合物进行抽滤，把固体部分进行流化干燥，流化床（Midi Glatt）进风温度40℃，进风压力0.6巴，干燥至水分含量5％左右。标记为酶1。 

实施例2 

称取按照实施例1的载体处理方法处理的载体D31140g于250ml三角瓶中，加入lecitase Ultra酶液80ml，置于25℃摇床中150rpm振荡，1.5h后取出混合物进行抽滤，把固体部分进行流化干燥，流化床（Midi Glatt）进风温度40℃，进风压力0.6巴，干燥至水分含量5％左右。标记为酶2。 

实施例3 

称取按照实施例1的载体处理方法处理的载体D20140g于250ml三角瓶中，加入lecitase Ultra酶液80ml，置于25℃摇床中150rpm振荡，1.5h后取出混合物进行抽滤，把固体部分进行流化干燥，流化床（Midi Glatt）进风温度40℃，进风压力0.6巴，干燥至水分含量5％左右。标记为酶3。 

实施例4 

称取按照实施例1的载体处理方法处理的载体D38240g于250ml三角瓶中，加入lecitase Ultra酶液80ml，置于25℃摇床中150rpm振荡，1.5h后取出混合物进行抽滤，把固体部分进行流化干燥，流化床（Midi Glatt）进风温度40℃，进风压力0.6巴，干燥至水分含量5％左右。标记为酶4。 

实施例5 

将D101树脂先用蒸馏水浸泡，除去可见杂质，再用95%乙醇浸泡2h以上最后用蒸馏水冲洗至无醇味，备用。接着，称取处理好的载体D10140g于250ml三角瓶中，加入80ml lecitase Ultra酶液80ml，置于40℃摇床中150rpm振荡，1.5h后取出混合物进行抽滤，把固体部分进行流化干燥，流化床（Midi Glatt）进风温度40℃，进风压力0.6巴，干燥至水分含量5％左右。标记为酶5。 

2）下列实施例中通过吸附-交联法固定磷脂酶A1 

实施例6 

称取按照实施例1的载体处理方法处理的载体D31140g于250ml三角瓶中，加入lecitase Ultra酶液80ml，置于50℃摇床中150rpm振荡，1.5h后取出混合物进行抽滤，然后加入等体积的浓度为1%的戊二醛进行交联2h，抽滤除去水分，把固体部分进行流化干燥，流化床（Glat，midi）进风温度50℃，进风压力0.6巴，干燥至水分含量5％左右。标记为酶6。 

3）下列实施例中通过两相法固定磷脂酶A1 

实施例7 

首先将载体D311树脂干燥以除去水分。将干燥的该树脂50g加入到300mL溶有5g Tween20的异丙醇溶液，再真空下旋转蒸发除去异丙醇，使表面活性剂均匀的覆盖到树脂表面。向33mL lecitase ultra酶液中加入9.9mL的正己烷和23g的水形成双向体系，将混合液剧烈摇动数分钟后加入经表面活性剂处理过的D311载体10g。将混合物气浴摇床120rpm，30℃摇动5h。酶经吸附后抽滤并加入0.15%的戊二醛溶液33mL室温下继续摇动1h。滤除含有固定化酶的载体并在自然条件下干燥，从而得到固定化脂肪酶。标记为酶7。 

4）下列实施例中对于其他来源的磷脂酶A1进行固定化 

实施例8 

称取按照实施例1的载体处理方法处理的载体D31140g于250ml三角瓶中，加入FoodPro LysoMax oil酶液（丹尼斯克公司制）80ml，置于25℃摇床中150rpm振荡，1.5h后取出混合物进行抽滤，把固体部分进行流化干燥，流化床（Midi Glatt）进风温度40℃，进风压力0.6巴，干燥至水分含量5％左右。标记为酶8。 

实施例9 

称取按照实施例1的载体的处理方法处理的载体D31140g于250ml三角瓶中，加入蜡样芽孢杆菌产磷脂酶80ml（从蜡样芽孢杆菌得到，由基因改性毕赤酵母经过发酵生产，从平板上挑取一单菌落到种子培养基中，30℃,200r/min培养20-24小时后，接种于装有3L分批发酵培养基的5L发酵罐中进行分批培养，通过调节转速、罐压、空气流量和甲醇速度使溶氧大于20%，诱导发酵100小时左右）。置于25℃摇床中150rpm振荡，1.5h后取出混合物进行抽滤，把固体部分进行流化干燥，流化床（Midi Glatt）进风温度40℃，进风压力0.6巴，干燥至水分含量5％左右。标记为酶9。 

实施例10 

称取按照实施例5的载体处理方法处理的载体D10140g于250ml三角瓶中，加入蜡样芽孢杆菌产磷脂酶80ml（从蜡样芽孢杆菌得到，由基因改性毕赤酵母经过发酵生产），置于50℃摇床中150rpm振荡，1.5h后取出混合物进行抽滤，把固体部分进行流化干燥，流化床（Midi Glatt）进风温度40℃，进风压力0.6巴，干燥至水分含量5％左右。标记为酶10。 

5）下列实施例为应用例： 

实施例11 

固定化磷脂酶制备生物柴油反应 

PFAD（棕榈油脱臭馏出物，主要成分为酸（购自嘉里特种油脂（上海）有限公司））和甲醇摩尔比为1:1，酶添加量为10%（W/W），反应温度为65℃的气浴，震荡速度200rpm，甲醇7h之内分三次加。反应完毕后取出产物重新放入底物，按照上述条件进行反应。反应产物进行TLC-FID分析甲酯含量。所使用的具体的酶（例1～例10中获得的酶1～酶10以及已有的Lecitase Ultra、Novozyme435）以及酯化率示于表1。 

实施例12 

固定化磷脂酶A1对磷脂的酸解反应： 

方法：200mg粉末磷脂溶于0.83mL正己烷，粉末磷脂：DHA浓缩液=1:8（摩尔比），65℃，250rpm，在反应进行12h取样进行分析。此时，添加的磷脂酶的量为底物总重量的10%，所使用的具体的酶（例1～例10中获得的酶1～酶10以及已知的Lecitase Ultra、Novozyme435）以及产物中DHA型磷脂的收率示于表2。 

实施例13 

固定化磷脂酶对甘油和脂肪酸的酯化反应： 

0.5g甘油、5.34gDHA浓缩液（摩尔比为1:3）,10%（相对于底物总重量）酶用量、65℃、250rpm、抽真空条件下反应，真空表读数为1.1kPa～0.5kPa，反应8h。所使用的固定化磷脂酶（例1～例10中获得的酶1～酶10以及已有的Lecitase Ultra、Novozyme435）以及TLC-FID结果（TAG含量%）示于表3。 

6）实验结果与讨论 

表1生物柴油实验结果（酯化率％） 

由表1可知，分别采用吸附法、吸附-交联法以及两相法，选择特定的载体固定磷脂酶而得的例1～5中的酶1～5的酯化率与Lecitase Ultra相比均较高，其中酶1和酶3反应20批的酯化率均能达到80%以上，和novozyme435的酯化率相当，酶4、酶5、酶7、酶10反应20批的酯化率也均能达到70%左右，适合用于生物柴油等产品的制备。这表明通过本发明的特定的载体进行磷脂酶的固定化的情况下，经过固定化的磷脂酶具有较强的酯化功能。 

表2.磷脂的酸解反应结果（DHA磷脂占总磷脂的含量％） 

由上述表2可以看出，分别采用吸附法、吸附-交联法以及两相法，选择特定的载体固定磷脂酶而得的例1～14中的酶2、酶3、酶5、酶7的产物中的DHA磷脂占总磷脂的收率相对较高，在反应第三批基本能达到10%以上。因Lecitase Ultra为液体酶，在含水量相对固定化酶较高的情况下水解作用会优先发生，底物中的磷脂大部分发生了水解。采用Novozyme435时无法识别底物磷脂，也不会催 化其酸解反应。即，在磷脂酶的作用下，通过本发明的方法获得的酶1～10的DHA型磷脂占总磷脂的含量较高。 

表3.甘油和脂肪酸的酯化反应结果（产物中TAG的含量％） 

由表3的结果可知，分别采用吸附法、吸附-交联法以及两相法，选择特定的载体固定磷脂酶而得的例1～10中的酶的TAG含量较高，酶1～酶4，酶6～酶7反应第四批能达到10％以上，而采用Lecitase Ultra时无酯化效果,结果中TAG含量为0，采用Novozyme435时也能够达到一定的含量，但明显不如使用本发明的酶中酶1～酶5，酶6～酶8的情况。即，在使用本发明的磷脂酶的作用下，所获得的产物的TAG含量较高。 

如以上实施例所述，本发明通过采用特定的载体和技术手段对液体磷脂酶A1进行了固定化，发现固定化后的磷脂酶A1可以以甘油和甲醇、乙醇为酰基受体进行酯化反应，在实验中还发现以此方法制作的固定化酶可以将DHA等长链脂肪酸为酰基供体进行酯化或酸解反应。酸解反应可以用于制备磷脂型DHA等功能性磷脂。 

总而言之，通过此方法制备的固定化酶既可以进行酸解反应，也可以进行甘油、甲醇和脂肪酸的酯化反应，还能识别DHA(二十二碳六烯酸)，DPA（二十二碳五烯酸）等长链脂肪酸，以其为酰基供体进行酸解或酯化反应。酯化反应在油脂工业生产上有很重要的应用，可用来制备甘二酯，功能性甘三酯，生物柴油等产品，在油脂工业上有巨大的发展潜力。通过本发明制备的固定化磷脂酶A1，可以在上述反应中重复利用，且反应效率高，成本低，就有潜在的工业应用。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.一种磷脂酶的固定化方法，所述方法包括步骤： 

a）将选自大孔型吸附树脂或离子交换树脂的载体与磷脂酶A1接触，使所述磷脂酶A1固定于所述载体； 

b)干燥步骤a)中所得的固定有磷脂酶A1的载体，以获得所述固定化磷脂酶A1。 

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体与磷脂酶接触前，还包括前处理的步骤，优选的， 

所述大孔吸附树脂的前处理方法为：将所述大孔吸附树脂置于水中浸泡去杂，然后用有机溶剂浸泡1～24小时，优选2～12小时，以去除有机杂质和不溶物，再用水洗去所述溶剂，优选的，所述有机溶剂为：乙醇、正己烷、丙酮或石油醚； 

所述离子交换树脂的前处理方法为：i）使用酸液处理树脂，或酸液和碱液交替处理树脂，ii）使用碱液处理树脂后，将所述树脂水洗至水呈中性，优选的， 

所述碱液浓度为0.05mol/L～1mol/L；和/或 

所述酸液浓度为0.05mol/L～1mol/L；和/或 

所述处理为浸泡或冲洗所述树脂；和/或 

所述酸液和碱液交替处理树脂的次数为1-5次。 

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔型吸附树脂为极性大孔型吸附树脂或非极性大孔型吸附树脂，所述离子交换树脂为阳离子交换树脂，优选为强碱性或弱碱性的阳离子交换树脂，或阴离子交换树脂，优选为强碱性或弱碱性的阴离子交换树脂； 

优选的树脂的孔径为50～150nm，比表面积为200-2000㎡/g；更优选的， 

所述极性大孔型吸附树脂选自：DA201、LSA-10、Amberlite XAD7HP、LX1010C或其组合； 

所述非极性大型孔吸附树脂选自：D101、HPD100A、AmberliteXAD-4或其组合； 

所述阳离子交换树脂选自：D113、D001、Ambetlite IRC50或其组合； 

所述阴离子交换树脂选自：D311、D382、NKX-8、D213、D201、LX1000HA或其组合。 

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶选自：嗜热丝孢菌 （Thermomyces lanuginosus），尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），南极假丝酵母（Candida antarctica），褶皱假丝酵母（Candida rugosa），米黑根毛霉（Rhizomucor miehei），爪哇毛霉（Mucor javanicus），雪白根霉（Rhizopusnivenus），米黑毛霉（Mucor miehei），假单孢菌（Pssudomonas sp.），米根霉（Rhizopus oryzae），黑曲霉（Aspergillus niger），卡门柏青霉（Penicillium camembertii），产碱杆菌（Alcaligenes sp.），伯克霍尔德氏菌（Burkholderiasp.），疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosa），或粘稠杆菌（Chromobacterium viscosum）表达的磷脂酶；通过基因工程，蛋白质工程改造而得的磷脂酶A1，或市售的磷脂酶A1。 

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体和磷脂酶A1的比例为1:0.5～1:5，优选为1:0.8～1:1.2。 

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体和磷脂酶A1的固定化时间为1～30小时，优选为2～8小时。 

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b）中的干燥方式选自流化床干燥、自然干燥或真空干燥。 

8.一种固定化磷脂酶A1或其包装产品，其特征在于，所述固定化磷脂酶是通过权利要求1-7中任一项所述的方法制得。 

9.权利要求8所述的固定化磷脂酶或其包装产品用于催化酯化、酸解或水解反应的用途。 

10.一种进行酯化、酸解或水解反应的方法，所述方法包括使用权利要求9所述的固定化磷脂酶A1作为催化剂。