CN111172145A

CN111172145A - 固定化酶及其生产功能性低聚糖的方法

Info

Publication number: CN111172145A
Application number: CN202010027186.5A
Authority: CN
Inventors: 曾宪维; 谢志龙; 杨新球; 魏远安; 陈振鹏; 戴健兴; 陈子健; 伍剑锋; 浣金刚
Original assignee: Quantum Hi Tech China Biological Co Ltd
Current assignee: Quantum Hi Tech Guangdong Biology Co ltd
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2020-05-19
Also published as: WO2021139158A1

Abstract

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及固定化酶及其生产功能性低聚糖的方法。其中，具有胺基官能团的离子交换树脂与酶液混合进行反应，生成固定化酶；该酶的固定化过程中无需使用交联剂，避免了交联剂残留对食品安全性可能带来的影响。经过本发明方法制得的固定化酶在生产功能性低聚糖过程中，转化批次和生产效率得到了很大程度的提高。

Description

固定化酶及其生产功能性低聚糖的方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及固定化酶及其生产功能性低聚糖的方法。

背景技术

低聚糖也称寡糖，是指含有2～10个单糖分子通过糖苷键连接而成的低度聚合糖，可分为普通低聚糖和功能性低聚糖。普通低聚糖如蔗糖、乳糖、麦芽糖等，可被机体消化吸收。功能性低聚糖又称为非消化性低聚糖，由2～10个单糖分子脱水通过α、β型等糖苷键连接形成的支链或直链的低度聚合糖，如低聚果糖、低聚半乳糖、乳果糖、低聚异麦芽糖等。由于肠胃道内没有水解功能性低聚糖的酶系统，也不被人体胃酸、胃酶降解，因此不能被人体消化吸收而直接进入大肠内，被有益细菌特别是双歧杆菌利用，是双歧杆菌的有效增殖因子。

由于功能性低聚糖的这个特性，其具有明显的调节人体肠胃功能、防治便秘及腹泻的功效。另外，功能性低聚糖口感自然，甜度较蔗糖低，纯度越高甜度越低，但具有低热量。因此，功能性低聚糖可用于食品、食品添加剂及保健食品、特医食品及药品等。例如，低聚果糖、低聚半乳糖作为食品添加剂(营养强化剂)可添加在婴幼儿配方食品中，乳果糖可作为药品有治疗便秘的作用，等等。

随着社会的不断发展进步，人们对于低聚糖的消费能力日趋加强。功能性低聚糖的工业化生产工艺需要保持安全有效、简洁易于实现、节能环保等特性，因此对生产工艺的创新及优化变得格外重要。

目前功能性低聚糖的生产主要以游离酶(或菌体细胞)、固定化酶的方式进行酶解转化，然后采取二次酶解转化、膜过滤或色谱方式进行提纯。在固定化酶的生产制备过程中，基本上都会选择戊二醛等作为固定化酶载体的交联剂。而在营养强化剂低聚糖的生产过程中限制戊二醛的使用。除此之外，固定化果糖基转移酶，目前报告的最高转化次数仅为85次(专利201510000076.9)；固定化β-半乳糖苷酶的使用批次仅为8批次(专利201480049114.3)。

因此，亟需一种新的适于工业生产的安全且高效制备固定化酶的方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个方面提供了一种使酶固定化的方法，该酶的固定化过程中无需使用交联剂，避免了交联剂残留对食品安全性可能带来的影响。

本发明的另一方面提供了一种由上述方法制备得到的固定化酶。

本发明的又一方面提供了一种使用上述固定化酶生产功能性低聚糖的方法。

本发明的技术方案如下文所述。

根据本发明的一些实施方式，本发明提供了一种固定化酶的方法，包括：将离子交换树脂与酶液混合直接进行反应，得到固定化酶；其中，所述离子交换树脂的官能团为胺基。

根据本发明的一些实施方式，所述胺基为仲胺基、叔胺基或季铵基。

根据本发明的一些实施方式，所述离子交换树脂为大孔型树脂，优选为苯乙烯系树脂、酚醛树脂，更优选为苯乙烯-聚苯乙烯树脂。

所述固定化酶是指采用物理或化学的方法，将酶固定在固相载体上，或者将酶包埋在微胶囊或凝胶中，从而使酶成为一种可以反复使用的形式。现有技术中，生产功能性低聚糖的固定化酶，大都是采用双功能团的交联剂戊二醛将酶与固相载体结合在一起。而本发明将具有特定胺基官能团的树脂与酶液混合直接进行吸附反应，酶蛋白分子进入大孔树脂孔隙，与树脂中的胺基结合，在整个过程中无需加入戊二醛等作为交联剂。而且，经过本发明方法制得的固定化酶在使用过程中，转化批次和生产效率得到了很大程度的提高。

根据本发明的一些实施方式，所述反应在电导3～20ms/cm条件下进行；优选地，所述反应在电导5～15ms/cm条件下进行。

根据本发明的一些实施方式，所述反应温度为6～35℃；优选为8～25℃；更优选为8～20℃。

根据本发明的一些实施方式，所述反应时间为5～40h；优选为6～24h。

根据本发明的一些实施方式，所述离子交换树脂与酶液按照1g：10～200U的比例进行混合；优选1g：60～150U。

根据本发明的一些实施方式，所述离子交换树脂为活化后的离子交换树脂，活化的方法为：强碱性树脂用碱和酸依次浸泡，弱碱性树脂直接用去离子水浸泡清洗。

离子交换树脂在使用前进行活化，可以去除树脂中可能存在的对酶有影响的有机物，提高固定化效率。

对于官能团为季铵基的离子交换树脂，其活化的方法为：依次用强碱和强酸浸泡，然后用去离子水洗至弱酸性或中性。

具体而言，根据本发明的一些实施方式，所述季铵基树脂的活化方法为：先将离子交换树脂在2～10％的氢氧化钠溶液中浸泡8～20h，去离子水洗至pH7.0～9.5；再用2～10％的盐酸溶液浸泡1～3h，去离子水洗至pH5～7，既得活化后的离子交换树脂。

根据本发明的一些实施方式，对于官能团为仲胺基、叔胺基的离子交换树脂，其活化方法为：采用去离子水浸泡2～5h，既得活化后的离子交换树脂。

根据本发明的一些实施方式，所述酶液可以为果糖基转移酶、蔗糖酶、菊糖酶、α-葡萄糖苷酶、乳糖酶或β半乳糖苷酶。

根据本发明的一些实施方式，本发明提供了一种固定化酶的方法，该方法包括：

(1)树脂处理：大孔型苯乙烯-聚苯乙烯(交联聚苯乙烯)为共聚物，仲胺基、叔胺基或季胺基为官能团的离子交换树脂；

其中，所述强碱型离子交换树脂(季胺基)经过2～10％的氢氧化钠溶液浸泡8～20h，去除树脂中可能存在的有机物，然后用水清洗至pH7.0～9.5，用2～10％的盐酸溶液浸泡1～3h，去除树脂中可能存在的金属离子，用去离子水清洗至洗水pH5～7；弱碱型离子交换树脂(叔胺基、仲胺基)采用去离子水浸泡2～5h进行树脂活化备用。

(2)按60～150U/g树脂的酶活单位的添加量，将提取精制后的酶液加入所述活化好的树脂中，在8～20℃、电导5～15ms/cm在反应釜中进行吸附反应8～24h，制得固定化酶。

本发明的另一方面还提供一种上述方法制备得到的可用于低聚糖工业化生产的固定化酶。该方法安全、节能、高效。

本发明的另一方面还提供一种固定化酶生产功能性低聚糖的方法，包括以下步骤：

1)按照如上所述方法制备固定化酶；

2)采用间歇式或连续式的生产方法以步骤1)得到的固定化酶生产功能性低聚糖；

根据本发明的一些实施方式，所述间歇式生产方法为：底物与所述固定化酶在酶解罐中搅拌反应。

根据本发明的一些实施方式，所述连续式生产方法为：底物经固定化酶柱循环反应。

根据本发明的一些实施方式，所述连续式生产方法为：将所述固定化酶装入反应柱中，40～60％浓度的底物在40～65℃，pH4～7的条件下通过此柱，得到功能性低聚糖。

底物是参与生物酶催化反应的物质，经过酶的催化变成另一种，或多种物质。此处的底物是指在特定固定化酶的作用下，可以反应得到功能性低聚糖的物质。

根据本发明的一些实施方式，所述底物为被所述固定化酶作用后产生功能性低聚糖的物质。

根据本发明的一些实施方式，所述底物为蔗糖、长链菊粉、葡萄糖或乳糖。

根据本发明的一些实施方式，所述固定化酶的用量为1～30U/g底物。

根据本发明的一些实施方式，所述步骤2)之后，还包括将所述功能性低聚糖脱色、灭菌、色谱提纯的步骤。

根据本发明的一些实施方式，所述步骤2)之后，还包括将所述功能性低聚糖经混床脱色，高温灭菌处理后进行色谱系统进行纯化的步骤。

根据本发明的一些实施方式，所述固定化酶按1～30U/g底物的添加量加入酶柱或酶解罐中，将底物在温度40～65℃、pH4～7的环境下，物料经反应3～36h可得到纯度为50～65％的功能性低聚糖溶液。

根据本发明的一些实施方式，将所述功能性低聚糖溶液经混床脱色，高温灭菌处理后进色谱系统进行提纯，制得纯度95％以上的功能性低聚糖产品。

根据本发明的一些实施方式，所述固定化酶还可以回收利用。

本发明中的带有固定化酶的离子交换树脂在进行低聚糖生产之后，可以回收利用。具体而言，根据本发明的一些实施方式，所述回收利用包括对使用过的离子交换树脂反复进行水洗、强碱浸泡、弱碱浸泡，以再生树脂的步骤。

根据本发明的一些实施方式，所述回收利用包括将使用后的离子交换树脂经去离子水漂洗去除残留糖液，然后采用2～10％的氢氧化钠溶液浸泡8～20h，清洗掉酶蛋白；去离子水洗至中性，然后用2～10％的盐酸溶液浸泡1～3h，去离子水洗至pH4.5～7.0；重复1～3次，得到再生的树脂。

本发明选取具有特定胺基官能团的离子交换树脂作为固定化酶载体，其能与酶蛋白分子结合进行固定化酶的生产，不仅不需使用戊二醛交联，而且在实际生产过程中固定化酶的使用寿命较报道有较大的提升；且固定化所用的载体都能经过简单的工艺进行回收再利用，进一步降低生产成本同时也更加经济环保。在功能性低聚糖提取工艺上，采用上述固定化酶工艺结合色谱工艺进行生产，能生产出纯度95％以上的产品，以低聚半乳糖为例，文献报道的最高纯度为90％，而按此工艺生产的产品纯度可以达到95％以上。

附图说明

图1为根据本发明的一种工业化生产流程图；

图2示出了不同批次的固定化酶转化效率图。

具体实施方式

图1为根据本发明的一种工业化生产流程图，以下结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

固定化酶的实际酶活收率＝(固定化酶重量×固定化酶酶活)/(酶液酶活×酶液体积)。

固定化酶的加酶量＝(吸附前酶活量-吸附后的酶活量)/树脂重量，如吸附前酶活100u/mL，吸附后5u/mL，吸附液5mL，树脂添加量4g，则固定化酶的酶活为118.75u/g树脂。

实施例1 固定化果糖基转移酶的生产

取1600L酶活19.38u/mL电导5.26ms/cm的酶液。按130u/g投放经活化的季胺基树脂238kg；在10℃，搅拌速度50rpm，酶液pH5.48的条件下吸附16h，吸附液酶活为1.30u/mL，清洗后共得固定化酶234kg；经检测固定化酶的酶活为125.5u/g树脂。

其中，季胺基树脂的活化过程为：经过5％的氢氧化钠溶液浸泡16h，然后用水清洗至pH8.5，用2～10％的盐酸溶液浸泡2h；用去离子水清洗至洗水pH5.5。

固定化酶的实际酶活收率＝(234000×125.5)/(19.38×1600000)＝94.70％。

实施例2 固定化果糖基转移酶生产低聚果糖

在5m³转化罐中加入5000kg浓度为50％的蔗糖溶液，往酶柱中按每克蔗糖5u酶的比例加入固定化果糖基转移酶240kg转化温度49±1℃，pH5.5，转化5h；转化后糖浆不经过酶分离，直接过滤、浓缩、灭菌，得到低聚果糖含量58.72％(干基)，百利度(Brix)为76.2％的低聚果糖浆。

在5m³转化罐中加入5000kg浓度为50％的蔗糖溶液，往酶柱中加入用季叔胺基树脂生产的固定化酶300kg，转化温度48±3℃转化5h；转化后糖浆不经过酶分离，直接过滤、浓缩、灭菌，得到低聚果糖含量59.23％(干基)，百利度(Brix)为76.3％的低聚果糖浆。

使用酶柱转化不需要经过固定化酶的分离回收，工艺简洁，且由于固定化酶在酶柱中不受搅拌剪切力的影响，能有效避免固定化酶因搅拌而出现载体破碎的情况，固定化酶使用100批次后(总反应时间超过600h、平均每批反应时间为6h)，低聚果糖含量仍能达到54.73％(干基)。

实施例3 固定化果糖基转移酶生产高纯度低聚果糖

收集经酶柱转化后的糖浆约30m³，混合均匀，进料低聚果糖含量为57.06％，然后经过灭菌及脱盐脱色处理，洗提水经过闪蒸脱气除去溶解氧，控制物料温度50～65℃，pH7～8，经色谱提纯后经过浓缩得到含量为96.98％(干基)，Brix为75.3％的高纯度低聚果糖浆。

实施例4 固定化β-半乳糖苷酶的生产

取β-半乳糖苷酶酶活为93.34u/mL，电导率为9.81ms/cm的精制酶液330L；按110u/g树脂的酶量加入活化好的叔胺基树脂280kg；12℃吸附16h，残液酶活为0.75，清洗后制得固定化酶275kg。经检测固定化酶酶活为106.73u/g；酶活收率为90.26％。

实施例5 固定化β-半乳糖苷酶生产低聚半乳糖

往8m³反应罐中加入浓度48％乳糖溶液(对应乳糖质量为3吨)，按20u/g乳糖的量加入制备好的固定化酶550kg，反应温度55℃，搅拌速度100rpm，反应17h后，经酶分离、糖浆过滤、浓缩、灭菌产出含量为61.80％(干基，离子色谱法检测)，百利度(Brix)为75.2％的低聚半乳糖浆产品，可满足作为营养强化剂的需求。

固定化酶经连续转化生产11批次后(总转化时间264h，平均转化时间24h)，低聚半乳糖含量仍可达到55.32％。

实施例6 固定化β-半乳糖苷酶生产高纯度低聚半乳糖

往8m³反应罐中加入浓度48％乳糖溶液6m³，按20u/g乳糖的量加入制备好的固定化酶550kg，反应温度55℃，搅拌速度100rpm，反应14h；

转化后糖浆经过酶分离，糖浆过滤得到含量为57.50％(干基)，乳糖含量22.37％(干基)，Brix为48％的低聚半乳糖溶液，备用。

收集转化后的糖浆约25m³，混合均匀，然后经过灭菌及脱盐脱色处理，洗提水经过闪蒸脱气除去溶解氧，控制物料温度50～65℃，pH5～6，经色谱提纯后经过浓缩得到含量为97.64％(干基)，Brix为75.2％的高纯度低聚半乳糖浆。与专利201210325339.X生产出纯度90％的低聚半乳糖相比，采用固定化酶结合色谱工艺提纯的方法能生产纯度高于95％的低聚半乳糖产品，达到更高的纯度等级。也是目前唯一能够量产95％纯度以上低聚半乳糖产品的工艺，达到国际先进水平。

实施例7 交联剂对固定化β-半乳糖苷酶使用性能的影响

两个250mL三角瓶中分别加入6g叔胺基树脂、100mL去离子水，向其中一个三角瓶中添加30％浓度的戊二醛，使瓶内戊二醛的浓度为0.15％；两个三角瓶置于25℃交联12h。

按110u/g树脂的加酶量加入同一批次酶液，12℃吸附16h，制得固定化酶。

对所制得的固定化酶按20u/g乳糖进行连续摇瓶转化8批次(每次转化时间24h)，摇瓶检测结果如图2所示，可以看出，叔胺基树脂在固定化β-半乳糖苷酶时不添加戊二醛作交联剂(即戊二醛浓度0％)与添加戊二醛(戊二醛浓度0.15％)相比，不添加能更好的表现出固定化酶的转化性能。

另外，在8个批次中，无交联剂的固定化酶在1～5批次时，转化效率呈下降趋势，而在第6批次时转化效率回升，7到8批次的转化效率虽然也有下降，但第8批次的转化率仍可以达到55％，相比于第一批次的57％，下降幅度很小。与专利201480049114.3经8次反应GOS含量由69.00％下降到48.93％，用本发明方法生产的固定化β-半乳糖苷酶转化性能更加平稳，酶的使用寿命增加一倍以上。

实施例8 固定化酶生产条件对β-半乳糖苷酶使用性能的影响

1.酶活添加量的影响

取酶活为89.72u/mL，电导率为7.20ms/cm，酶液5mL分别加入两个50mL玻璃三角瓶A和B，A中加入活化的叔胺基树脂4g，B中加入同样的树脂2g；在12℃摇床吸附，摇床轻微晃动使树脂能与酶液均匀接触，16h后检测残液酶活A为1.35u/mL、B为7.24u/mL。按(吸附前酶活-吸附残液酶活)*酶液体积/树脂量的方式计算单位树脂的酶活分别为A：110.46u/g；B：206.2u/g；经摇瓶检测所制得的固定化酶活分别为A：108.32u/g；B：153.85u/g；从理论酶活与实际检测酶活之间的差距可以看出，单位树脂固定酶量过多时，固定化酶在使用并不能全部参与反应，降低了酶的使用效率。

2.电导条件的影响

取酶活为96.25u/mL，酶液5mL分别加入两个50mL玻璃三角瓶A和B，A中用1％硫酸铵溶液调节电导至9.8ms/cm；B不调节电导(检测电导为1.13ms/cm)，往A、B三角瓶中均加入活化的叔胺基树脂4g；在12℃摇床吸附，摇床轻微晃动使树脂能与酶液均匀接触，16h后检测残液酶活A为1.89u/mL、B为0.32u/mL。

将所制得的固定化酶A、B进行连续摇瓶转化验证，A酶连续转化5次(每次转化时间24h)GOS含量为56.21％；B酶转化5次含量为46.73％。

综上，本发明选取大孔型苯乙烯-聚苯乙烯为共聚物，胺基胺基(仲胺基、叔胺基、季胺基)为官能团的离子交换树脂作为固定化酶生产载体，采用吸附法进行固定化酶的生产；底物经固定化酶解反应后生成功能性低聚糖；然后配合色谱提纯工艺对终产物进行提纯，可以工业化生产出纯度98％以上的低聚果糖和低聚半乳糖产品。所选的胺基树脂能在不需要戊二醛等作为交联剂的情况下能很好的与酶分子结合，表现出十分稳定的转化特性。固定化酶的稳定性强，以季胺基树脂生产的固定化果糖基转移酶工业化生产时能600h以上；以叔胺基树脂生产的固定化β-半乳糖苷酶工业化生产时能连续使用264h以上；酶的固定化过程中未加入戊二醛等交联剂，所生产的固定化酶在使用后能轻松实现树脂的再生利用。固定化酶结合色谱工艺(尤其是固定化酶酶柱)进行工业化生产时能有效降低酶的使用成本、提高产品收率、减少工艺过程中清洗脱色压力，是一种清洁、高效的方法。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims

1.一种固定化酶的方法，其特征在于，包括：将离子交换树脂与酶液混合进行反应，生成固定化酶；其中，所述离子交换树脂包含仲胺基、叔胺基或季铵基官能团。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换树脂为大孔型树脂，优选为苯乙烯系树脂、酚醛树脂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应在电导3～20ms/cm条件下进行；优选地，所述反应在电导5～15ms/cm条件下进行。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述反应时间为5～40h，温度为6～35℃；优选反应时间为8～24h，温度为8～25℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换树脂与酶液按照1g：10～200U的比例进行混合；优选1g：60～150U。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的固定化酶的方法，其特征在于，所述离子交换树脂为活化后的离子交换树脂，活化的方法为：强碱性树脂用碱和酸依次浸泡，弱碱性树脂直接用去离子水浸泡。

7.根据权利要求6所述的固定化酶的方法，其特征在于，对于官能团为季铵基的离子交换树脂，其活化的方法为：依次用强碱和强酸浸泡，然后用去离子水洗至弱酸性或中性。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的固定化酶的方法，其特征在于，所述酶液为果糖基转移酶、蔗糖酶、菊糖酶、α-葡萄糖苷酶、乳糖酶或β半乳糖苷酶。

9.一种固定化酶生产功能性低聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据权利要求1至8任意一项所述的方法制备固定化酶；

2)采用间歇式或连续式的生产方法以步骤1)得到的固定化酶生产功能性低聚糖。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述连续式生产方法为：将所述固定化酶装入反应柱中，40～60％浓度的底物在40～65℃，pH4～7的条件下通过此柱，得到功能性低聚糖。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在在于，所述底物为被所述固定化酶作用后产生功能性低聚糖的物质。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其特征在在于，所述步骤2)之后，还包括将所述功能性低聚糖脱色、灭菌、色谱提纯的步骤。

13.根据权利要求9至12任一项所述的方法，其特征在于，还包括对使用过的离子交换树脂进行水洗、强碱浸泡、弱碱浸泡，以再生树脂的步骤。