KR920007687B1

KR920007687B1 - 갈락토올리고당의 제조법

Info

Publication number: KR920007687B1
Application number: KR1019870014336A
Authority: KR
Inventors: 게이스께 마쯔모또; 나쯔꼬 다무라; 쯔네가즈 와따나베
Original assignee: 가부시끼가이샤 야쿠르트혼샤; 마쯔조노 히사미
Priority date: 1986-12-15
Filing date: 1987-12-15
Publication date: 1992-09-14
Also published as: CA1333779C; EP0272095A3; AU8258087A; KR880007744A; EP0272095A2; AU603165B2; NZ222902A

Abstract

내용 없음.

Description

갈락토올리고당의 제조법

제1도는 본 발명의 제조법에 있어서의 당분해처리를 위한 순환 조작법의 설명도.

제2도는 실시예 1에 있어서의 당분리 처리의 결과를 나타낸 그래프.

본 발명은 생체내에서 비피도 박테륨균 증식 촉진 작용을 갖는 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다. 유당의 β-갈락토실기전이 반응등에 의하여 생성하는 갈락토오즈- 클로코오즈계의 올리고당은 모유 올리고당의 주용 구성성분이며, 그리고 사람 장내에 생식하는 유용세균인 비피도 박테륨균의 증식 촉진 인자료서 유용한 것이다.(일본 특공소 58-20266호 공보 등). 일반식 Gal-(Gal)n-Glc(단 Gal은 갈락토오즈 잔기, Glc는 글루코오즈 잔기, n은 1~4의 정수를 각각 나타낸다)로나타내는 이 올리고당(이 명세서에서는 이를 갈락토올리고당이라고도 한다)은 그후, 발효유나 유아용 분유에 첨가되는 등 여러 가지의 분야에서 이용되게 되었다. 유당으로부터 갈락토올리고당을 생성시키는 방법으로서는, 유당에 아스페르길루스 오리자에의 β-갈락토시다아레를 작용시키는 방법(전기된 공보), 크리프토코쿠스 속 효모를 이용하는 방법(일본 특개소 60-251896호 공보)등이 있는데, 어느 방법에 의하여도 유당의 모두를 갈락토올리고당으로 변환할 수는 없으며, 얻어지는 것은 20~60%정도의 갈락토올리고당 이외에 미반응의 유당 주성분의 이당류와, 부생하는 글루코오즈, 갈락토오즈 등의 단당류를 함유하는 당혼합물의 용액(이 용액을, 본 명세서에서는 당액이라 한다)이다. 그러므로, 비피도 박테륨균 증식촉진 인자로서의 활성이 높은 갈락토올리고당 제품을 얻기 위하여는, 당액의 정제, 즉 이 당액중의 갈락토올리고당과 다른 당류를 분리하여 가급적 순도가 높은 갈락토올리고당을 얻음이 필요하게 된다.

그러므로, 종래의 정제법으로서는 먼저, 활성탄법이 있었다(전기된 공보). 이 방법은, 활성탄 컬럼에 당액을 흘려서 그속의 당류를 컬럼에 흡착시키고, 이어서 물 또는 저농도의 에탄올로 단당류 및 유당을 용출시켜서 제거하고, 그후 고농도의 에탄올로 갈락토올리고당을 용출시켜서 용출액으로부터 갈락토올리고당을 얻는 것으로서 주된 분리 형태는 흡착분배이다. 그러나, 이 방법은 분자 크기에 의한 당의 분리가 불충분하여 고순도의 갈락토올리고당을 얻고자하면 수율이 극히 나쁜 결점이 있다. 또 에탄올을 사용하므로 에탄올값, 에탄올의 회수비, 증류장치 건설비 등이 증대하여 정제비용이 높은 것도 문제이다. 3차원 가교결합을 형성시킨 덱스트란, 셀루로우즈, 폴리아크릴아미드 등을 기재로하는 겔 여과제를 사용하여, 분자 크기에 의한 당의 분리를 행하는 겔 여과법도 있었으나, 이는 겔 여과제의 수명이 짧은 점, 단위 수지당의 적정부하량이 작고, 과부하상태에서는 당의 분리능이 극단으로 악화는 점, 그럼에도 불구하고, 겔 자체가 상당히 고가인 점 등에 의하여 실험실 규모로 밖에 실시할 수가 없다. 기타 일반적인 올리고당의 분리법으로서는 이온 교환기를 갖지 않는 다공성 폴리머로써된 합성 흡착제를 사용하는 방법이 있다(일본 특개소 61-130297호 공보). 이 방법은 합성 흡착제를 충전한 컬럼에 처리된 액을 공급하고, 흡착된 당류를 물 또는 물과 알콜의 농도 구배에 의하여 용출시킨 것으로서, 당과 흡착제 사이의 친화력의 차이에 의하여당의 분자량이 작은 순으로, 용출되어 분리가 행해진다. 그러나, 이 방법을 당액의 정제에 적용하여도 물만의 용출에서는 3당류 이상의 갈락토오리고다의 회수에 시간이 너무 걸리며, 회수율도 만족할만 하지 못하며, 뿐만아니라 회수당 농도가 낮음이 확인되었다. 용출에 알콜 수용액을 사용하면, 갈락토올리고당의 회수율은 올라가지만, 다음의 당액을 부하하기 전에 컬럼내를 물로 평형화하지 않으면 안되므로, 연속적인 분리가 안되며, 알콜값도 필요하게 된다. 요컨데, 이방법도 비효율적이고 가격이 많이 들고 실제적인 것은 못된다. 한편, 당액에는 전술한 바와 같이 상당한 미반응 유당이 함유되어 있으므로, 이를 효율적으로 회수하여 원료 유당으로서 재이용함이 갈락토올리고당의 제조가를 낮추기 위하여 바람직하다. 그러나, 회수 유당의 재이용에는 그 유당이 글루코오즈나 갈락토오즈 등의 단당류를 함유하면, β-갈가토시다제를 유당과 작용시켰을 때, 전이 2당류를 발생하며 결과로서 갈락토오리고당의 생성량이 저하할뿐 아니라, 갈락토오즈에 의하여 효소반응이 억제되어서 반응의 진행이 늦어지는 문제가 있다. 따라서, 재이용하는 회수 유당은 가급적 단당류 함유율이 낮은 것이 아니면 안되는데, 종래의 갈락토올리고당 분리 정제법에 의하여는 β-갈락토시다제 처리에 재이용 가능한 정도로 단당류 함유율이 낮은 유당을 동시에 얻기는 곤란하였다.

본 발명의 목적은, 상술된 것과 같은 형상을 고려하여, 당액으로부터 종래의 것보다도 효율적으로 고순도의 갈락토올리고당을 회수할 수 있는 정제공정을 포함하는 고품질 갈락토올리고당의 제조법을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 낮은 가격으로, (β-갈락토시다제를 사용할 경우에도 사용가능한 정도로) 단당유 함유율이 낮은 유당을회수하고, 회수 유당을 원료 유당으로서 재이용하여 종래의 방법보다도 훨씬 이점이 많은 고순도의 갈락토올리고당을 수득할 수 있는 갈락토올리고다어의 제조접을 제공하는 것이다. 즉, 본 발명은 유당으로부터 갈락토올리고당에의 전이반응을 일으킬 수 있는 임의의 효소 또는 미생물을 유당에 작용시켜서, 갈락토올리고당을 함유하는 당액을 얻고, 이어서 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의하여 상기 당액중의 당 성분의 분리를 행함으로써 컬럼 용출액으로부터 갈락토올리고당 고함유 분액을 수거함을 특직으로 하는 제1의 발명과 상기 제1발명의 제법에 있어서 또한 컬럼 용출액으로부터 유당 고함유 분액을 수거하고, 이를 원료 유당의 일부로서, 재이용함을 특징으로 하는 제2의 발명의 두 발명으로써 된다. 본 발명의 제법에 있어서는, 먼저 임의의 방법에 의하여 유당으로부터 갈락토올리고당을 제조한다. 즉, 유당으로부터 갈락토올리고당에의 전이반응을 일으킬 수 있는 효소(예를들면, β-갈락토시다제)또는 미생물(예를들면, 크리프토코쿠스 효모)을 유당에 작용시켜서, 갈락토올리고당을 함유하는 당액을 얻는다. 효소를 사용하여 유당을 처리하는 대표적인 처리법에 대하여 설명하면, 예를들면 아스페르길루스 오리자에의 β-갈락토시다제를 사용하여 농도 10~90 중량%, 효소 농도 1~100단위/ml에서 pH 약 3~8, 온도 약 20'C이상에 있어서, 효소 처리를 행한다. 반응이 진행됨에 따라서, 글루코오즈, 갈락토오즈와 같은 단당류의 양 및 갈락토올리고당의 양이 거의 직선적으로 증가하지만, 그후는 매우 복잡한 변화를 나타내어, 올리고당은 어느 시점에서부터 서서히 감소하는 경향을 나타낸다. 따라서 통상은 최고의 올리고당 수율을 부여하는 시점에서 반응을 정지한다. 효소 반응은 처리액을 약 90'C 이상으로 5~10분간 가열하면 정지시킬수가 있다. 미생물을 이용하는 경우에는 유당을 함유하는 배지에서 그 미생물을 배양하고, 배양액중에 갈락토올리고당을 생성 시킨 후, 미생물을 제거하여 당액을 얻는다. 전이반응에 효소를 사용한 경우에서나 또는 미생물을 사용한 경우에 얻어진 당액이 필요에 따라서, 분탄에 의한 탈색처리나, 이온 교환수지에 의한 탈염처리 등의 예비적 정제를 실시하여 당농도가 낮은 경우에는, 당액을 다시 감압하여 농축하는 등하여 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의한 정제를 행한다. 당류의 분리 정제에 사용하는, 강산성 양이온 교환수지는 크로마토그래피 용으로서 적당한, 가급적 입경의 균일도가 높은 것이 바람직하다. 또한, 그 중에서도 스티렌디비닐벨젠 공중합체를 기재로 하여, -SO₃-기를 교환기로 하는 Na형, K형 또는 Ca형의 수지가 바람직하다. Na형의 수지는 특히 당류분리능이 뛰어나서, 가장 바람직하다. 본 발명의 제법에 있어서, 특허 바람직한 강산성 양이온 교환수지의 구체예에 서는 유니비이드(Unibead) UBK-101L, 동 UBK-530(모두 미쯔비시가세이주식회사제품)이 있다. 상술한 바와같이 상기된 이온 교환수지를 사용하는 컬럼 크로마토그래피는, 수지 컬럼 피처리 당액 및 용출용의 물의 온도를 약 50~90'C, 바람직하게는 약 60~80'C의 범위에서 가급적으로 일정하게 유지하여 실시함이 양호한 분리를 달성하기 위하여 필요하다. 컬럼에 공급하는 당액의 당 농도는, 30~65'C(w/w)정도가 적당하며, 이보다도 농도가 높으면, 분리 패터에 혼란을 일으킨다.

강산성 양이온 교환수지를 사용하여 행하는, 크로마토그래피에 의한 당액 구성 성분의 분리는, 분자 크기 배제효과(가교수지내에 침투할 수 없는 큰 분자크기의 당으로부터 먼저 용출시키는 효과)에 의한다.

분리조작은, 기본적으로 다음과 같이하여 행한다.

① 컬럼에 당액을 공급하고 수지에 당류를 흡착시킨다. 그 양은 수지량의 약 2~20% (v/v)가 바람직하다. ② 컬럼에 SV 약 0.1~2/시간으로 물을 흘려서 당류를 용출시킨다.

③ 용출액으로부터 최초에 용출하는 갈락토올리고당 고함유 분액을 수거하고, 이하 순차로 용출하는 갈락토올리고당 및 유당-분액(두성분의혼합분액), 유당 고함유 분액, 유당 및 단당류 분액(두 성분 혼합분액) 및 단당류 고함유 분액을 수거한다(필요하지 않으면, 갈락토올리고당을 함유하지 않은 용출액의 분액은 생략한다.)

대량의 당액을 연속적으로 처리하여, 고순도의 갈락토올리고당을 얻고자 할 때에는 제1도에 나타낸 바와 같이, 직렬접속의 2개의 컬럼 C-1, C-2를 사용하여 다음과 같은 1순환내 6단계의 순환 조작법을 이용함이 유리하다(제1도중의 번호는 단계 번호를 나타낸다). 1단계: 당액 S를 상부 컬럼 C-1에 주입한다. 이때, 하부 컬럼 C-2의 출구로부터는 전회 주입한 당액 S로부터 분리된 유당 고함유 분액 L이 용출한다. 2단계 : 상부 컬럼 C-1과 하부 컬럼 C-2의 연결로부터 하부 컬럼 C-2에 물 W을 주입하고, 하부 컬럼 C-2 출구호부터의 유당 고함유 분액 L의 용출을 종료시킨다. 3단계 : 유당 고함유 분액 L에 이어서, 하부 컬럼 C-2 출구로부터 용출하여 오는, 유당 및 단당류 분액 L·M(전회 주입한 당액 S로부터 분리된 것)을 상부 컬럼 C-1에 되돌린다. 4단계: 상부 컬럼 C-1 입구로부터 물 W을 주입하고, 하부 컬럼 C-2의 출구로부터 단당류 고함유 분액 M(전회 주입한 당액 S로부터 분리된 것)을 용출시킨다. 5단계 : 상부 컬럼 C-1의 입구로부터 물 W를 주입하고, 1단계에서 공급한 당액 S로부터 분리된 갈락토올리고당 고함유 분액 O를 하부 컬럼 C-2의 출구로부터 용출시킨다. 6단계 : 갈락토올리고당 고함유 분액 O에 이어서, 하부 컬럼 C-2의 출구로부터 용출하여 오는, 갈락토올리고당 및 유당분액 O·L을 상부 컬럼 C-1로 되돌린다. 이 방법에 의하면, 고순도의 갈락토올리고당, 유당 및 단당류를 모두 회수가 용이한 고농도 용출액의 형태로, 반연속적으로 얻을 수가 있으며, 갈락토올리고당의 정제 손실도 거의 없다. 그리하여, 1,2단계에서 얻은, 유당 고함유 분액은, 제2발명의 제법에 있어서, 그대로 갈락토올리고당 조제원료로서 재이용할 수가 있다. 그리고 갈락토올리고당 조제법이 전술과 같이 단당류의 존재로 쉽게 영향받는 β-갈락토시다제 법의 경우에는 회수 유당중의 단당류의 양이 문제가 되는데, 단당류 함유율이 충분히 낮아지도록 분액 조건을 선택함으로써 또는 새로이 삽입되는유당과 혼합하여 사용함으로써 전이반응에 지장이 없을 정도로 단당류 함유율이 낮은반응원료를 조제함은 용이하다. 그러나, 필요하다면, 유당 고함유 분액을 농축하여 유당을 정출시키는 방법에 의하여 다시 단당류를 제거하고나서 재이용할 수도 있다. 본 발명의 갈락토올리고당 제조법은, 종래의 제조법과 비교하면 당음과 같이 많은 점에서 유리하다. (1) 극히 고순도이고 따라서 비피도박테륨 균중식 촉진 인자로서의 활성이 높은, 갈락토올리고당을 용이하게 제조할 수가 있다. 또한 단당류 및 유당의 함유율이 낮은, 제품이 얻어짐으로써 감미 및 칼로리가 사용상의 장해로 되거나 유당 불내증 체질자가 설사를 일으키는 등의 문제도 없어지고, 또한 동결건조법 또는 분무건조법에 의하여 단당류의 취급을 용이하게하는 분말화하기도 용이하게 된다. 이상에 의하여 갈락토올리고당의 뛰어난 성질을 종래보다도 넓은 범위에서 활용할 수가 있다. (2) 크로마토그래피에 사용하는, 강산성 양이온 교환수지는 염가일뿐만 아니라 내압축성, 내구성, 조작성에 뛰어나므로, 공업적인 대규모 실시에 접합하다. (3) 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 크로마토그래피는 이온교환기를 갖지 않은흡착수지나 활성탄을 사용하는 방법과 달라서 유기용매를 필요로 하지 않으며, 물만으로써 용출할 수 있으므로, 1순환 종료때마다 컬럼을 물로 평형화할 필요도 없다. 따라서, 연속적인 정제조작을 용이하게 그리고 능률적으로 행할 수가 있으며 갈락토올리고당 및 유당의 순도 및 회수율도 높다. 또한 유기용액 사용에 따른 회수비 기타의 비용도불필요하므로, 경상비가 대단히 낮다. (4) 회수는 유당의 고순도이며, 많은 경우, 그대로 반응 원료로서 재이용할 수 있는 품질을 갖는다. 따라서, 이를 재이용함으로써 대단히 높은 수율로, 갈락토올리고당을 제조할 수가 있다. (5) 상기 (2) ~ (4)에 의하여 극히 염가로 갈락토올리고당을 제공할 수가 있다. (6) 회수되는 단당류 고함유 분액은, 감미 시럽으로서 식료품 제조에 그대로 이용할 수 있으며, 또 감미료원료로서 이용할 수가 있다.

[실시예]

다음에 실시예를 제시하여, 본 발명을 설명한다.

[실시예 1]

약방 유당 500g을 1ι의 온수에 용해하고, 이 용액에 pH 4.5의 완충액 및 β-갈락토시다제 1만 단위를 가지고, 혼합물을 40'C에서 5시간 반응시켰다. 이어서, 반응액을 95'C로 가열하여 효소를 실활시키고, 여과후 강산성 양이온 교환수지(Diaion SK1B)와 강염기성 음이온 교환수지(Diaion PA308)와의 혼상수지탑을 통하여 탈염처리하고, 다시 당농도가 43% w/w가 될 때까지 농축시킨다. 얻어진 당액의 당조성은 갈락토올리고당 24.2%, 유당 43.6%, 글루코오즈 23.5%, 갈락토오즈 8.7%이다. 이 당액을 60'C로 가열한 크로마토그래피용 강산성 양이온 교환수지 컬럼(내경 10mm, 길이 1000mm의 자켓(jacket) 부컬럼; 사용수지. 유니비이드 UBK-101L, Na 형)에 수지량의 5%를 가한후, 60'C의 온수로 용출한다. 당액 및 온수의 주입속도(SV)는 0.5/시간으로 한다. 컬럼으로부터의 용출액을 2mι씩 분취하여 당조성을 고속 액체크로마토그래피에 의하여 분석한다. 그 결과를 제2도에 나타낸다.

[실시예 2]

식품 등급(grade)의 유당 4kg을, 2.3ι의 온수에 용해하고, 실시예 1에서 사용한 것과 같은 효소를 8만 단위 가하고, 수득된 혼합물을 67'C에서 2시간 반응시킨다. 그후, 반응액을 95'C로 10분간 가열하여, 효소를 실활시켜 분탄과 셀라이트(celite)를 가하고 여과하여 이온 교환 수지를 사용하여 여액을 탈염 처리한다. 얻어진 당액(전당농도 62.5%; 당조성: 갈락토올리고당 29.5%, 유당 45.2%, 단당류 25.3%)을 60'C로 가열한 크로맡그래피용, 강산성 양이온 교환수지 컬럼(내경 35.5mm, 길이 910mm의 스테인레스강제 컬럼 2본을 직렬로 연결한 것; 사용수지: 유니비이드 UBK-530, Na형, 1810mι)을 사용하는 전술한 1순환내 6단계의 순환조작법에 의하여 36순환으로, 연속 처리한다. 그리고 1회의 당액 사입량은 120mι이고, 용출액 온수의 온도는 60'C이고, 당액 및 온수의 주입속도(SV)는 0.254/시간으로 한다. 이에 의하여 얻어진 각당 분액의 조성은 다음과 같다.

갈락토올리고당 고함유 분액(9ι)은 감압농축하고, 수득된 농축물을 동결건조하여 백색분말상의 갈락토올리고당 800g을 얻는다.

[실시예 3]

실시예 1과 같이하여 유당에 아스페르길루스 오리자에의 β-갈락토시다제를 작용시켜서, 당조성이 갈락토올리고당 30.1%, 단당류 19.9%의 당액을 얻는다. 이 당액을 이온교환수지로 탈염 탈색하여 얻어진 전당 농도 55% w/w의 당액 20ι를 실시예 2의 경우와 같이, 이온 교환수지를 충전한 컬럼(내경 15cm, 길이 120mm의 스테인레스 제 컬럼 2본을 직렬로 연결한 것)을 사용하는 전술한 순환조작법에 의하여 처리한다. 단, 당액사입량은 1.87l/순환으로 하고, 갈락토올리고당 고함유 분액, 유당 고함유 분액 및 단당류 고함유 분액은, 당용액의 11순환분을 처리하여 컬럼 용출액으로부터 각각 수거하고, 농축한다. 유당 고함유 분액의 농축액(고형 함량 8.12kg ; 당조성 : 갈락토올리고당 13.5%, 유당 81.9%, 단당류4.6%)은 유당 5.88kg을 혼합하고나서 혼합물을 상기와 같은 효소반응, 예비적 정제 및 당분리 처리를 행한다. 이와같은 효소처리와 당분리 처리를, 10회 반복하고 얻어진 갈락토올리고당 고함유 분액의 농축액을 탈색용 이용 교환수지 컬럼에 통하여 약간의 착색을 제거하고 당농도 50% w/w의 투명용액 66l을 얻는다. 투명용액을분무 건조한 결과 , 유동성이 양호한 백색분말(갈락토올리고당 순도 90%) 32kg을 얻는다. 또 단당류 고함유 분액의 농축액(농도 70% w/w, 단당류 순도 99%, 글루코오즈/갈락토오즈=3/1)이 얻어졌으며, 이는 그대로 부드러운 감미시럽으로서 이용가능하다.

Claims

유당으로부터 일반식 Gal-(Gal)n-Glc(단, 식중 Gal은 갈락토오즈 잔기, Glc는 글루코오즈 잔기, n은 1~4의 정수를 각각 나타낸다)로 나타내는 올리고당에의 전이반응을 일으킬 수 있는 효소 또는 미생물을 유당에 작용시켜서, 상기 올리고당을 함유하는 당액을 얻고, 이어서 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 컬럼 크로마토크래피에 의하여 상기 당액중의 당성분의 분리를 행하고, 컬럼 용출액으로부터 갈락토올리고당 고함유 분액을 수기함을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조법.
제1항에 있어서, β-갈락토시다제를 상기 유당에 작용시켜서, 올리고당을 생성시키는 방법.
제1항에 있어서, 스티렌디비닐벤젠 공중합체를 기재로하고, -SO₃-기를 교환기로하는 강산성 양이온 교환수지의 Na형의 것을 상기 컬럼 크로마토그래피에 사용하는 방법.
유당으로부터 일반식 Gal-(Gal)n-Glc(단, 식중 Gal은 갈락토오즈 잔기, Glc는 글루코오즈 잔기, n은 1~4의 정수를 각각 나타낸다)로 나타내는 올리고당에의 전이반응을 일으킬 수 있는 효소 또는 미생물을 유당에 작용시켜서, 상기 올리고당을 함유하는 당액을 얻고, 이어서 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의하여, 상기 당액중의 당성분의 분리를 행하고, 컬럼 용출액으로부터 갈락토올리고당 고함유 분액을 수거하며, 컬럼 용출액으로부터 유당 고함유 분액을 수거하고, 이 분액을 원료 유당의 일부로하여 재이용함을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조법.
제4항에 있어서, β-갈락토시다제를 유당에 작용시켜서 올리고당을 생성시키는 방법
제5항에 있어서, 스티렌디비닐벤젠 공중합체를 기재로 하여 -SO3-기를 교환기로하는강산성 양이온 교환수지의 Na혀의 것을 상기 컬럼 크로마트그래피에 사용하는 방법.