JPH04103593A - 新規オリゴ糖及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は新規なオリゴ糖及びその製造方法に関する。

〈従来の技術〉 ビフィズス菌は人体の大腸内に生育し、腸内腐敗生成物
の生成抑制や整腸作用等、生理的に有用な腸内細菌であ
ることが知られている。

しかし、ビフィズス菌は乳幼児の腸管内には多数生育し
ているが、加齢に伴いその数が著しく低下するため、近
年ビフィズス菌の増殖を促進する物質（ビフィズス菌増
殖因子）について多くの研究がなされ２種々のビフィズ
ス菌増殖因子が開発されている。

例えば、ガラクトオリゴ糖（特開昭８Ｏ−２０２Ｈ号）
、フラクトオリゴ糖（特開昭５８−２０１９８０号）、
イソマルトオリゴ糖、ラクチュロース等が現在ビフィズ
ス菌増殖因子として知られている。

最近、Ｗｓ内におけるビフィズス菌の増殖にとって最も
効果的な因子はオリゴ糖であることが明らかになるに伴
い、各種オリゴ糖がビフィズス菌増殖因子として利用さ
れている。

本発明で原料として用いる４゛ガラクトシルラクトース
を製造する公知の方法としては、スポロポロマイセス争
シンギュラリス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏ腸！ｃｅｓ　ｓｉ
ｎｇｕＩａｒＩｓ）　ＣＣａｎ、Ｊ−Ｃｂｅｙｉｊｓｔ
ｒｙ　Ｖａｌ、４２．　ｐ！３４１〜１３４４．３１１
８４）　、　クリプトコ、カスφローレンティＣＣｒｙ
ｐｔｏｃａｒ、ｃｕｓ　１ａｕｒｅｎｔｉｊ）　（特公
平２−１１７８６）　、　　リポマイセス　スターキー
（Ｌｉｐｏ＊ｙｃｅｇ　５ｔａｒｋｅｙｉ）　（特開昭
８３−１８５３７３）、ロドトルラーミヌタ（Ｒｈｏｄ
ｏｔｏｒｕｌａ　ｍ１ｎｕｔａ）、ステリグマトマイセ
スナエリビアエ（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ　ｅ
ｌマ１ａｅ）、　　シロ／へシディウム◆マグナム（Ｓ
ｉｒｏｂａｇｆｄｉｕｍ　ｍａｇｎｕｍ）　（＠開平２
−７２８９０）などが報告されている。

４°ガラクトシルラクトースは消化酵素ではほとんと加
水分解されず、ビフィズス菌の棲息する大腸まで到達し
、またビフィズス菌に選択的に利用されるためビフィズ
ス菌増殖因子として効果の高いオリゴ糖であるが、甘味
度が砂糖の２０％と低く、甘味性が物足りないという欠
点がある。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明は、ヒフィズス菌増殖促進作用を有し、しかも甘
味度の高い新規なオリゴ糖及びその製造方法を提供する
ことを目的とする。

以下本発明の詳細な説明する。

く本発明の構成〉 本発明に係る新規オリゴ糖は、 の構造式で示される〇−β−Ｄ−ガラクトピラノシルー
（１→４）−〇−β−Ｄ−ガラクトピラノシルー（１→
４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１−２）−β
−Ｄ−フラクトフラノシド（４’ＧＬＦと略称）からな
る。

また、同新規オリゴ糖は、ローネラ争アクアティリス（
Ｒａｈｎｅｌｌａ　ａｑｕａｔｉｌｉｓ）ＪＣＭ−１６
８３株のレバンシュークラーゼを用い、シュークローズ
のフラクトース残基をＯ〜β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−（１→４）−〇−β−ｐ−ガラクトピラノシルー（１
→４）−ｏ　−グルコピラ／−ス（４゛ガラクトシルラ
クトース、４“Ｇしと略称）の構造を有するガラクトオ
リゴ糖に転移させて製造する。

く本オリゴ糖の特性〉 本発明に係るオリゴ糖は下記の物理的および化学的特性
を有する。

■元素分析値： ｃ　：　４２．８７９６Ｈ：　８．３８％の温度で１０
分間加水分解して得られる生成糖のモル比が、ガラクト
ース：グルコース：フラクトース＝２：ｌ：ｌであるこ
とがら、本発明のオリゴ糖は２分子のガラクトースと１
分子のグルコースと１分子のフラクトースから成ること
が確認された。

［α］　　Ｄ２０　　＝　＋５２．７　〜５４．８■紫
外線吸収スペクトル： 特異な吸収はない。

トルは第１図に示すとおりである。

し、その測定結果からみて、本発明のオリゴ糖は４分子
のヘキソースからなる糖類であることが確認された。

ロホルム、ベンゼンに不溶で、含水アルコールに難溶で
ある。

■呈色反応ニ アニリン、 フタル酸反応およびアンモニ ア、硝酸銀反応は陽性で、ニンヒドリン反応および環化
第二鉄反応は陰性である。

■酸性、塩基性並びに中性の別： 中性を示す。

［相］物質の色： 乾燥粉末化したものは白色を呈する。

この固形物は、薄層クロマトグラフィーや高速液体クロ
マトグラフィーなどにより分析したところ単位物質であ
ることが判明し、またインへルターゼにより４“ＧＬと
フラクトースに加水分解されること、β−ガラクトシダ
ーゼによりガラクトースとラクトシュークローズ（Ｃａ
ｌβ１−＋　４ＧＩＣ（Ｅ　ｌ　＋　２βＦｒｕ）また
はガラクトースとラクトースに加水分解されること、お
よび１３　Ｃ−ＮＭＲ分析結果などから、０−β−ｐ−
ガラクトピラノシル−（１→４）−〇−β−０−ガラク
トピラノシルー（１→４）−〇−α−０−グルコピラノ
シルー（１→２）−β−ｐ−フラクトフラノシド（４’
ＧＬＦ）と同定した。

く本発明方法の具体的手段〉 本発明方法の具体的手段は次のとおりである。

シュークローズを主炭素源として含む培地に４’ＧＬを
加え、ローネラ属に属する微生物を接種し、好気的に培
養して培養液中に４°ＧＬＦを生成蓄積すること、およ
び培養で得られたローネラ属に属する微生物の菌体また
は菌体処理物を、４’ＧＬとシュークローズを含む液に
反応させて４°ＧＬＦを生成させる。

培養法における４°ＧＬＦ生成に用いる培地の４°ＧＬ
とシュークローズの濃度はそれぞれ１〜２０％で１：ｌ
Ｏ〜１０：ｌの割合の範囲で使用することができるが、
好ましくは４°ＧＬ、シュークローズ　３：２でそれぞ
れ９％、６％程度が適当である。培地にはその他機生物
の増殖に必要な窒素化合物、例えばペプトン、アミノ酸
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のいずれを加
えてもよく、さらに酵母エキスや燐酸塩等を加えて使用
する。

このように調製した培地に前培養しておいたローネラ・
アクアティリスを接種し、２０〜３７℃、好ましくは３
０℃の温度の好気的条件下において１〜７日間、好まし
くは２〜３日間振とう培養すると４’ＧＬＦが培地中に
蓄積する。

このようにして得られた４　’　ＧＬＦを含有Ｔる培養
液は、第２図に示すように、原料である４°ＧＬ、シュ
ークローズと生成物である４°ＧＬＦとグルコースおよ
び少量のフラクトースが蓄積されたものであり、その他
のオリゴ糖の生成が極めて少ない、このため通常の分離
、精製、固形化手段にて単位物質としての４°ＧＬＦを
効率よく得ることができる。

また、培養によって得られたローネラｅアクアティリス
の菌体および菌体処理物による４’ＧＬＦの生成は、　
４’ＧＬとシュークローズの濃度がそれぞれ１〜４０％
で、１　：　１０〜１０：１の割合のかなり広い範囲で
使用することができるが、好ましくは４’ＧＬ、シュー
クローズ３　：　２−１’ソ、ｔＬぞれ３０％、２０％
程度が適当である。

反応に使用する菌体はグルコースやシュークローズまた
は他の単糖類、二軸類を炭素源とし、それに微生物の増
殖に必要な窒素化合物（ペプトン、アミノ酸、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム等）やミネラルを含む培地
で増殖させた菌体を使用する。

また、得られた菌体および菌体抽出物をアルギン酸カル
シウムやカラギナンなど通常の方法で固定化した菌体処
理物を使用してもよい。

培養液または菌体反応液を遠心分離やケイ藻土濾過など
の手段によって菌体を除去し、得られた上澄み液または
濾液に公知の手段を適宜アプライすることにより４’Ｇ
ＬＦを精製することができる。

例えば、上記の上澄み液を減圧濃縮し、濃縮液をカーボ
ン・セライトカラム（１：　１）に通して吸着させ、水
で十分に洗浄してグルコース等の単糖を除去する。

次ぎにエタノールを５％含む溶出液でシュークローズを
溶出させ、引き続きエタノールｌｏ％を含む溶出液で４
°ＧＬを溶出した後、エタノール１５％を含む溶出液で
４“ＧＬＦを溶出するかくして得られた４°ＧＬＦ溶出
液を減圧濃縮した後、真空乾燥法、凍結乾燥法等により
固形化することができる。

本発明による式（１）のオリゴ糖は、ビフィズス菌の種
類に関係なく生体内で顕著な増殖促進作用を示すもので
あって、たとえば、ビフィドバクテリウム・アドレッセ
ンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｄｏｌ
ｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビア４ドパクテリウム・ビア４ダ
ム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ
ノビフィトバクテリウム・ブレーへ（Ｂｉｆｉｄｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｓ　ｔ＋ｒｅｖｅ）　、ビフィドバクテリ
ウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　１ｎｆａｎｔｉｓ）ビフィドバクテリウム争ロン
ガム（Ｂｉｆ　ｉｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｏｎｇ
ｕｅ）等の大腸内常在菌のビフィズス菌に対して活性を
示す。

したがって、本発明による上記オリゴ糖は、シロップや
乾燥粉末の形態でそのままで適用し得るが、飲料や加工
食品に添加して用いてもよく、さらには経口薬剤の一成
分として適用することも可能である。

〈実施例〉 以下に実施例を示して、本発明およびその効果を具体的
に説明する。

ｐ）Ｉ　　　　　７．０ 上記組成の培地１！；Ｌを小型ジャーファーメンタ−に
入れ、別に前培養しておいたローネラーアクアティリス
（Ｒａｈｎｅｌｌａ　ａｑｕａｔｉｌｉｓ）ＪＧＭ−１
８８３の培養液５０１１を接種し、３０℃で２日間通気
培養（３００ｒｐｍ）を行った。

高速液体クロマトグラフィーにより生成した４”ＧＬＦ
を測定したところ、３８．５ｇの４°ＧＬＦが生成した
。

得られた培養液ｌｎを遠心分離（１５０００ｒｐｍ）に
より菌体を除去し、上澄み液を減圧濃縮により２００厘
１まで？５Ｉｉｉｌシた。この濃縮液をカーボン参セラ
イトカラム（１：　１）へ通液し、水１０文を１交／ｂ
ｒの流速で流して単糖を溶出させ、５％エタノール２５
！ｌでシュークローズを溶出させ、ｌＯ％エタノール２
０文で４’ＧＬを溶出させた後、１５％エタノール３５
立を流し、活性炭に吸着されている４°ＧＬＦを溶出さ
せた。

４’ＧＬＦを含む溶出液を減圧濃縮した後、凍結乾燥を
行い白色の粉末４’ＧＬＦ　２８．７ｇを得た。

文Ｊｌヱ 実施例１に示した培地組成から４’ＧＬを除いた培地Ｉ
ＪＩを小型ジャーファーメンタ−に入れ、別に前培養し
ておいたローネラ・アクアティリス（Ｒａｂｎｅｌｌａ
　ａｑｕａｔｉｌｉｓ）ＪＣＭ−１８８３ノ培［１０１
を接種し、３０℃で１日間通気培養を行った。

培養終了後、遠心分離機（１５０００ｒｐ■）にて菌体
な回収し、回収した菌体を蒸留水２００１で２回洗浄後
、蒸留水５０＋ｍｌに懸濁した。

この菌体懸濁液（０１１６６０２０）に４’ＧＬ２２５
、　、シュークローズ１５０ｇ含む１／１５１１１燐酸
緩衝液ＣＰ）１７．０）　１９．を加え、５０℃で１８
時間反応を実施した。

反応終了液中の４’ＧＬＦ量は、高速液体クロマトグラ
フィーで測定した結果１１９ｇであった。

この反応液をカーボン・セライトカラム（１：　ｌ）を
用い実施例１と同様の条件で４°ＧＬＦの分画を行った
ところ、８８ｇの４°ＧＬＦ凍結乾燥粉末を得た。

（Ｄｉｆｃｏ製） Ｌ−システィン塩酸塩 馬消化血液 肝臓エキス ０．５ｇ ４０層１ ７５鳳１ 精製水 ｐＨ ７、０ ｐＨ７，６ 表−１に示す大腸内代表菌について、 ４’ＧＬＦの資化性を調べた。

対照として４１１；Ｌ、グルコース、ラクトースの３種
類の糖も同時に資化性の試験を行った。予め上記ＥＧＬ
Ｆ培地で前培養を行った各種菌体液０．０５■ｌを、４
’ＧＬＦなどの各種糖が０．５％含まれるＰＹＦ培地に
接種し、嫌気条件下３７℃で４８時間培養を行った。

糖の資化性の判定は、細菌の増殖における培養液の濁度
の上昇、およびＰＨ低下の２点で行い、その結果は表−
１に示すとおりである。

表−１に示されるように、４°ＧＬＦはビフィズス菌に
よく資化され、大腸菌をはじめクロストリジウム属の菌
など、腸内における増殖が好ましくない細菌に対しては
グルコースやラクトースと比較して利用され難く、した
がってビフィズス菌増殖効果の選択性の高い糖であった
・ 以下余白 各種大腸内細菌によるＣＧＬＦの資化性菌　　　種　　
　　　　　　　　　株数　４’ＧＬＦ　　４’ＧＬ　　
グル　　ラフコース　ドース

【図面の簡単な説明】

第１図は、培養液の糖組成を示す高速液体クロマトグラ
フ、 第２図は、４°ＧＬＦの赤外吸収スペクトルを示すグラ
フである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）▲数式、化学式、表等があります▼ の構造式で示される￥Ｏ￥−β−＿Ｄ−ガラクトピラノ
   シル−（１→４）−￥Ｏ￥−β−＿Ｄ−ガラクトピラノ
   シル−（１→４）−￥Ｏ￥−α−＿Ｄ−グルコピラノシ
   ル−（１→２）−β−＿Ｄ−フラクトフラノシドからな
   る新規オリゴ糖。
2. （２）ローネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ　
   ａｑｕａｔｉｌｉｓ）ＪＣＭ−１６８３株のレバンシュ
   ークラーゼを用い、シュークローズのフラクトース残基
   を￥Ｏ￥−β−＿Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）
   −￥Ｏ￥−β−＿Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）
   −＿Ｄ−グルコピラノース（４’ガラクトシルラクトー
   ス、４’ＧＬと略称）の構造を有するガラクトオリゴ糖
   に転移させ、特許請求の範囲第１項に示される構造式の
   オリゴ糖を生成させる新規オリゴ糖の製造方法。