JPH05501358A - バンコマイシンの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バンコマイシンの調製方法 本発明は、同化可能な炭素及び窒素源並びに無機塩を含む培養培地上でミクロポ リスポラ　オリエンタリス（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｏｒｉｅｎｔａｌ ｉｓ　）種に属する菌株のアミノグリコシド耐性突然変異体を用いることによっ て、好気性発酵により微生物学的手段でバンコマイシン抗生物質を調製するため の方法に関する。

バンコマイシンは、ミクロポリスポラ　オリエンタリス種に属する株により生成 される糖ペプチドタイプの抗生物質である。初期の系統的な分類において、これ らの菌株は、それぞれストレプトマイセス　オリエンタリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）及びノカルジア　オリエンタリス（Ｎｏｃａｒ ｄｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）として言及されて来た［Ｍ、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏ ｗなど、：Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、　Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　Ｌｔｄ、。

Ｌｏｎｄｏｎ、１２９ページ（１９８４））、上記両株の性質は、アメリカ特許 第３．０６７、０９９号明細書に初め記載された。

産業規模でのバンコマイシンの調製のためには、ミクロポリスポラ　オリエンタ リス微生物が同化可能な炭素及び窒素源並びに無機塩を含む培養培地上で好気性 条件下で増殖され、次に発酵の間に生成される抗生物質がその発酵ブイヨンから 分離される（アメリカ特許第４．４００．７５３号及び第４．６６７、０２４号 明細書を参照のこと）。

バンコマイシン抗生物質は２つの必須成分から構造的に成る：糖単位、化学的に α−０−バンクサミン−β−０−グルコシル及びいわゆる偽ペプチドであり、そ して純粋なペプチドでないヘプタペプチド。この差異は重要である。なぜならば 微生物において、純粋なペプチド及びタンパク質は、すべての生存生物において 実質的に同一であるタンパク質合成システムにおいて、いわゆるリポソームの表 面上で合成され；そして偽ペプチドタイプの二次代謝生成物は上記システムにお いてではなく、リポソームとは無関係な複合酵素の表面上で生成されるからであ る。リポソーム、すなわち細胞の“正常な”タンパク質合成システムは、リポソ ームリボ核酸及びタンパク質から構成される。アミノグリコシドタイプの抗生物 質、たとえばストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びゲンタマイ シンは、リポソームリボ核酸の特異的部位に結合される場合、それらは“正常な ”タンパク質合成のために必要な構造体を有するリポソームの進行を妨げるよう な態様でそれらに対して敏感な微生物に対して作用することがまた知られている 。アミノグリコシド抗生物質に対して耐性である微生物において、リポソームを 構成するリポソームリボ核酸の構造が、アミノグリコシドの結合が阻害されるよ うな態様で変えられ、それによってそれらはリポソーム構造に影響を及ぼすこと ができず、そして不活性になる。

偽ペプチドタイプの二次代謝生成物はリポソーム上でなく、リポソームとは異な る複合酵素の表面上で合成され、そしてリポソームリボ核酸を含まないので、ア ミノグリコシドタイプの抗生物質はこれらの酵素に対する効果を実質的に有さな い。実際、非リポソームペプチド又は偽ペプチド合成のアミノグリコシド誘発性 変化のいづれかの証拠を付与するデータ又は観察は文献には見出されない。

バンコマイシンの調製のための既知の方法の収率はかなり低い。

従って、初期方法に比較して高い生産性をもたらす方法を本発明の研究の間、バ ンコマイシンを生成するミクロポリスポラ　オリエンタリス　ＮＣＡＩＭＯ０１ ０９１株が突然変異誘発効果にゆだねられ、次にアミノグリコシド耐性突然変異 体が単離された。突然変異誘発は、突然変異誘発物質としてＮ−メチル−Ｎ′− ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン又はＵ■放射線を用いることによって文献に従 って行なわれた。

他の既知の突然変異誘発物質、たとえば放射線又は窒素マスタード、等がまた知 られている。

ストレプトマイシン及びカナマイシンを含む選択培養培地上で増殖されたストレ プトマイシン−及びカナマイシン−耐性コロニーの中に、元の株のバンコマイシ ン産生能力に比較して有意に高いバンコマイシン産生能力を有する多くのコロニ ーが見出されたことが、突然変異誘発処理の後、驚くべきことには観察された。

産業上の発酵の観点から最っとも好ましい性質を示す２種の子孫株が、それぞれ ＮＧＡＩＭＯＯＩ０９２及びＮＣＡＩＭＯＯ１０９３としてＮａｔｉｏｎａｌ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓ ｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　（ブダペスト条約下で国際寄託権 として認知されている）で寄託された。

本発明者の観察は下記表に要約される。

可溶性スターチ　１０ｇ Ｄｉｒｃｏ酵母抽出物　４ｇ 炭酸カルシウム　１ｇ 寒天　１５ｇ 蒸留水　１０００ＩＩｌまで。

ｐＨ値を、オートクレイプ処理の前、硫酸を添加することによって７．０に調整 する。

ストレプトマイシン及びカナマイシンを、培養培地において１０００μｇ／ｆｆ １１の濃度で使用する。

ＶＳ−１培地の代わりに、通常知られており、そして通常のＣｚａｐｅｋ−Ｄｏ ｘ培養培地をまた使用することができる。

ＮＣＡＩＭＯＯ１０９２及びＮＣＡＩＭＯＯ１０９３株及びそれらの子孫株の好 都合な性質は、それらが炭素源として使用される産業的品種の原料、たとえばコ ーン、小麦及びジャカ°イモスターチ、デキストリン、サッカロース、グルコー ス、グリセロール、カルシウムグルコネート、及びトウモロコシ、ジャガイモ及 びアミラーゼにより液体化される小麦スターチを利用することにあり；そしてそ れらはダイズ粉、コーンスチーブリッカー、タンパク質加水分解物、たとえば内 袖出物、カゼイン加水分解物及び酵母抽出物、並びにアンモニウム塩及び硝酸塩 を窒素源として使用する。

従って、次の組成を有する発酵培地（ＶＦ−２）が好ましくは使用され得る： グリセロール　６０ｇ ダイズ粉　２０ｇ カルシウムグルコネート　１２ｇ リン酸二水素カリウム　０．２ｇ 塩化マグネシウム　０．２ｇ 炭酸カルシウム　３．０ｇ 水道水　１０００ｍｌまで。

実験用発酵のためには、ＶＦ−２培養培地５０ｍ１が５００ｍ１の体積のフラス コに用いられる。

ＮＣＡＩＭＯＯ１０９２及びＮＣＡＩＭＯＯ１０９３並びにそれらの子孫株の他 の好ましい性質は、バンコマイシンの生成が、硝酸塩が発酵の開始で培養培地に 添加される場合、窒素源としてダイズ粉を含む培養培地で行なわれる発酵におい て有意に高められることにあることが本発明の研究の間に観察された。従って、 たとえば上記列挙される成分の他に、硝酸ナトリウム又は硝酸カリウム塩を０． １〜２．５％、好ましくは０，６〜１．０％の量でＶＦ−２培養培地に添加され れば、発酵の最後でのバンコマイシン生成が、同じ組成であるが、しかし硝酸塩 成分を含まない培養培地において得られたバンコマイシン生成に比べて３０〜４ ０％高い。

従って、本発明によれば、バンコマイシン抗生物質は、ミクロポリスボラ　オリ エンタリス種に属するＮＣＡＩＭＯＯ１０９１株のアミノグリコシド耐性突然変 異体、好ましくはＮＣＡＩＭＯＯ１０９２及びＮＣＡＩＭＯＯ１０９３株が同化 可能な炭素源、たとえばコーン−、ジャガイモ−１小麦−スターチ及び／又はア ミラーゼにより液体化されるコーン−、ジャガイモ−１小麦−スターチ及び／又 はグリセロール及び／又はグルコース及び／又はデキストリン及び／又はサッカ ロース及び／又はカルシウムグルコネート並びに同化可能な窒素源として、たと えばダイズ粉及び／又はコーンスチープリッカー及び／又はタンパク質分解物、 たとえば内袖出物、酵母抽出物、カゼイン加水分解物並びに無機塩、好ましくは 硝酸塩を含む培養培地上で、２０〜４０℃、好ましくは３０℃で好気性条件下で 増殖せしめられ、次に抗生物質が既知の手段により発酵ブイヨンから分離される ような手段で調製される。

本発明の方法を用いることによって、発酵ブイヨン中における３６００〜３８０ ０μｇ／ｍｌの抗生物質含有率が発酵の終りで達成される。

これらの値は、現在までの文献に記載される方法を用いることによって得られた 結果よりも有意に高い。たとえばアメリカ特許第３．０６７、０９９号明細書に よれば、たった１８０μｇ／ｍｌのバンコマイシン含有率が実験発酵において達 成され：そして発酵ブイヨン中の活性物質含有率は、発酵の最後で撹拌され、そ して空気を通された装置における１、５ｍ３の体積の発酵においてさえ２００μ ｇ／ｍｌよりも高くなかった。

実験条件下での他の発酵方法を用いることによって、発酵ブイヨンにおける９５ ０μｇ／ｍ１のバンコマイシン含有率が得られ（ヨーロッパ特許第８５．０２０ ．４３５号明細書及びアメリカ特許第４．６６７、０２４号明細書）；他の方法 において、２１４０μｇ／ｍＩは、発酵の最後で、１２０リツターの作業体積の 撹拌され、そして空気を通された発酵器において産業規模で達成された最高の値 であった。

発酵ブイヨン及び最終生成物中の抗生物質含有量の定量決定が、ＵＳＰ　ＸＸｎ に規定の寒天拡散方法を用いることによってＡＴＣＣ６６３３のバシラス　サブ チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に対して行なわれた。バンコマ イシン有効値は、商業的に入手できるＵＳＰ文献標準規格に関連された。

ＨＰＬＣ方法がバンコマイシン最終生成物の定量分析のために使用された［Ａｎ ｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ。

２７／４，５０３　（１９８５）；及びＣｏｄｅ　ｏｆ　Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅ ｇｉｓｔｅｒ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、第４５５．８５章（１９８８）に従って〕。

ミクロポリスボラ　オリエンタリス種に属するＮＣＡＩＭ００１０９２及びＮＣ ＡＩＭＯＯ１０９３株を用いることによって行なわれる発酵が、次の非制限的な 例に詳細に示され下記組成を有する実験室用種子培養培地に、−２０〜−３０℃ の間の凍結状態で貯蔵されたミクロポリスボラ　オリエンタリス　ＮＣＡＩＭＯ Ｏ１０９２株の増殖性培養物を接種する： グルコース　１０ｇ 可溶性スターチ　２０８ コーンスチープリッ力−１０ｇ ダイズ粉　１４ｇ リン酸二水素カリウム　３ｇ 炭酸カルシウム　２ｇ 無機塩の溶液　１０ｍ１ 蒸留水　１０００ｍｌまで。

ｐＨは、殺菌後７．２であった。培養培地１００ｍ１に、増殖性培養物２ｍｌが ５００ｍ１の体積の三角フラスコ中において添加される。

無機塩の溶液の成分は下記の通りである：硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４・ＬＯ）　 １．　０　ｇ硫酸銅（ＣｕＳＯ４・５１１２０　）　０．　１　ｇ硫酸亜鉛（Ｚ ｎＳＯ，・７！（２０）　２．　８　ｇクエン酸鉄アンモニウム　２．８ｇ 塩化コハコハル（ＣＤＣＩ２−　ＬＯ）　０．　１　ｇ過硼酸ナトリウム（Ｎａ Ｊ４０７・ＨｚＯ）　０．　１　ｇモリブデン酸ナトリウム（ＮａＪｏ［）＜　 −Ｌ（ｌ　）　０．　０４　ｇ蒸留水　１０１００Ｏまで。

実験用種子培養物の調製を、２．５ｃｍのストロークの長さを有する回転振盪機 上で１８　Ｏｒｐｍで２０〜２４時間、３０℃で培養することによって行なう。

下記成分を有する５００ｍ１の三角フラスコにおける５０ｍ１の発酵培地に上記 で得られた培養物１＋ｎｌを接種する： グリセロール　６０ｇ ダイズ粉　２０ｇ カルシウムグルコネート　１２ｇ リン酸二水素カリウム　０．　２ｇ 塩化マグネシウム　０．２ｇ 炭酸カルシウム　３．０ｇ 水道水　１０００ｍｌまで。

殺菌後、ｐＨ値は７．２〜７．４である。発酵は、２．５ｃｍのストロークの長 さを有する回転振盪機上で１８　Ｏｒｐｍで１２０時間、３０℃で行なわれる。

発酵の最後で、発酵ブイヨン中のバンコマイシン含有率は２８００μｇ／ｍ１で ある。

例２ −２５〜−３０℃の間で保存されたミクロポリスポラ　ＮＣＡＩＭＯＯ１０９３ 株の増殖性培養物により例１に記載される実験室用種子培養培地を接種した後、 種子培養物及び発酵の調製を例１に記載されるようにして行なう。発酵の最後で 、発酵ブイヨン中のバンコマイシン含有率は２３４０μｇ／ｍｌである。

例３ 例１で調製されたミクロポリスポラ　オリエンタリス　ＮＣＡ　ＩＭＯ０１０９ ２株の接種物により、例１の方法を用いることによって例１に記載される発酵培 養培地を接種した後、硝酸す）　ＩＪウム又は硝酸カリウムを、殺菌の前、発酵 培養培地に添加し、０，６％最終濃度を得る。培養は例１に記載されるようにし て行なわれ、そして発酵の最後での発酵ブイヨン中のバンコマイシン含有率は３ ７２０μｇ／ｍｌである。

例４ １２リツトルの体積のガラス発酵器に置かれた例１に記載される接種用培養培地 ８１を、例２に従って調製されたミクロポリスポラ　オリエンタリス　ＮＣＡＩ ＭＯＯ１０９２株の実験室用種子培養物１ｍｌにより接種する。培養は、５００ ｒｐｍで１７〜２０時間撹拌し、そして６１／１／分で空気を通しながら３０℃ で行なわれた。例３に記載される組成を有する１２１の体積のガラス発酵器に置 かれた殺菌発酵培養培地８１を、上記で得られた培養物８００ｍ１により接種す る。

発酵は、６００　ｒｐｍで１２０時間撹拌し、そして６１／分で空気を通しなが ら３０℃で行なわれる。発酵の最後での発酵ブイヨン中のバンコマイシン含有率 は３８２０μｇ／ｍ１である。

例５ 接種培養物を、例１に記載されるようにしてミクロポリスポラ　オリエンタリス 　ＮＣＡＩＭＯＯ１０９２株から調製する。上記培養物１００ｍ１を、次の組成 を有する１、５ｍ’の体積の予備発酵器における殺菌培養培地１ｍ３に接種する ：コーンスターチ　２０ｋｇ ダイズ粉　１０ｋｇ サッカロース　１０ｋｇ 炭酸カルシウム　２ｋｇ ダイズ油　４ｋｇ ポリプロピレン　グリコール　０．５ｋｇ水道水　１０００１まで。

培養培地のＰＨ値を、殺菌の後、そのｐＨ値が５．５〜６．０になるように硫酸 により調整する。予備発酵は、１００　ｒｐｍで１７〜２０時間撹拌しながら、 ０．４〜０．５バールの内部圧力下で０．５１／１／分の空気付与しながら３０ ℃で行なわれる。このようにして調製された接種物を、次の組成を有する３ｍ３ 体積の発酵器で調製された殺菌発酵培地２ｍ３に導入する： グリセロール　１２０ｋｇ ダイズ粉　４０ｋｇ カルシウムグルコネート　２４ｋｇ 硝酸ナトリウム　２０ｋｇ 炭酸カルシウム　８ｋｇ 塩化マグネシウム　０．４ｋｇ リン酸二水素カリウム　０．４ｋｇ 水道水　２０００１まで。

培養培地のｐＨ値を、殺菌の後、そのｐＨ値が７．０〜７．２になるように水酸 化ナトリウムの添加により調整する。２　ｍ　３の殺菌発酵培養培地を、開発さ れた産業用種子培養物１００】により接種し、そして発酵は次のパラメーターに より９６〜１２０時間行なわれる： 温度　３０℃ ０〜１７時間目までの空気付与　０．５１／１／分１７時間目から終りまでの空 気付与　１．０１／Ｉ／分内部圧力　０．　４〜０．５バ一ル ０〜１７時間目までの撹拌　５０ｒｐｍ１７時間目から終りまでの撹拌　１００ 　ｒｐｍ発酵の終結で、発酵ブイヨンは、次の方法で発酵ブイヨンから単離され るバンコマイシン３７００μｇ／ｍｌを含む。

２ｍ３の体積の発酵ブイヨンを１５℃に冷却し、２５体積％の水道水（発酵ブイ ヨンの体積に基づいて計算された）により希釈し、そして塩化ナトリウムを一定 の撹拌下で、そして１５℃に冷却しながら２０ｇ／ｌの量（その元の体積のため に計算される場合）で添加する。塩化すｌ−Ｕラムの溶解の後、そのｐＨ値を水 酸化ナトリウムの添加により８．４〜８．６に調整し、次に０．４％パーライト フィルター助剤を添加し、そして撹拌を１５℃で２時間続ける。次に、このよう にして処理された発酵ブイヨンを、減圧下で２ｍ２の表面積の予備積層された真 空ドラムフィルターを通して濾過し、そして濾過された発酵ブイヨンを、撹拌器 を備える冷却可能な容器に集める。

発酵ブイヨンから、バンコマイシンをＡｍｂｅｒｌｉｔｅ　Ｉ　ＲＣ５０（Ｈ１ 相）イオン交換樹脂に結合し、そのうち３００Ｉを連続して連結される２種のカ ラム（４００ｍｍＸ　２０００ｍｍ＜７）大きさ）に充填する。結合の線流速は ２〜３ｍ／時である。

吸着の後、カラムを、脱イオン水１５００〜２０００１により結合のために使用 されたのと同じ線流速で洗浄する。バンコマイシンを、０．５〜１−０ｍ／時の 線流速で０．５ＮのＮＨ４ＯＨ溶液によりカラムから溶離する。溶離の間、１０ ０１の両分を集め、ここでバンコマイシンの量及び純度をＨＰＬＣ試験により調 節する。適切な純度の両分を集め、４００〜６００１の主要画分を得る。その組 合された主要画分のｐＨ値をＩＮの塩酸により８．０に調整した後、その溶液を 逆浸透装置で８〜１２％のバンコマイシン濃度まで濃縮する。

濃縮の間、溶液のｐＨ値は５，４〜５．６に徐々に調節される。

溶液に存在する無機塩を除去するために、いわゆるシアフィルトレージョンを、 濃縮の後に行ない、すなわち濃縮された溶液を再び脱イオン水により希釈し、そ して再び濃縮する。

濃縮の終結で、溶液の体積は５．２〜５．４のｐＨ値を有する２３〜４０＋の溶 液である。溶液のｐＨを、１０％塩酸の添加により２．５〜２．８に調整し、次 にその濃縮物を活性炭（Ｃａｒｂｏ　ＣＥｘｔｒａ炭素）により透明にする。バ ンコマイシン含有量（ＨＰＬＣにより測定された）のために計算された多量の２ ９％炭素を個々の透明化のために使用する。３８０ｎｍで１ｃｍのキュベツトで 分光光度的に測定される溶液の色がＡ＝０．４よりも高い場合、その透明化が上 記のようにしてくり返えされる。

続いて、透明化された溶液を、Ｄｉａｉｏｎ　ＳＫ　ＩＢ（Ｈ＋相）の強い酸性 カチオン交換カラムに通す。４１の樹脂により充填された直径１２０ｍｍのカラ ムが８ｍ／時の線流速で使用される。バンコマイシンをカラムから蒸留水により 洗浄する。イオン交換段階の後、１．８〜２．０であるその得られた溶液のｐＨ 値を、弱い塩基性アニオン交換樹脂（ＯＨ−相）を含む２１の体積で及び直径１ ２０ｍｍのカラムに６ｒｎ／時の流速でそれを通すことによって３．０〜３．５ に調整する。カラムを蒸留水により洗浄し、そしてバンコマイシンを含む洗浄溶 液を集め主要画分を得る。その得られた溶液を、３００００表示分子量の排除を 有する限外濾過膜（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅ１１ｉｃｏｎ装置）を通して濾過す る。３０〜４０１のバンコマイシンを含む限外濾過溶液を、殺菌濾過されたアセ トン１１倍体積により沈殿せしめ、次に減圧下で２０時間、殺菌条件下で４０〜 ５０℃で乾燥せしめ、そして最後に粉末化する。

２　ｍ　３の出発発酵ブイヨンから、２８７３ｇのバンコマイシン塩酸塩が、微 生物学的測定に基づいて９６８μｇ／ｍｇよりも高い生物学的能力を伴って得ら れる。

国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．同化可能な炭素及び窒素源及び無機塩を含む培養培地上で、ミクロポリスポ ラ種に属する菌株を用い、且つ好気性発酵により微生物学的手段でバンコマイシ ン抗生物質を調製するための方法であって、無機塩として硝酸塩を含む培養培地 に微生物としてミクロポリスポラオリエンタリス種に属する菌株のアミノグリコ シド耐性突然変異体を含み、そして発酵の後、それ自体既知の方法で、生成され る抗生物質を分離することを含んで成る方法。
2. ２．ミクロポリスポラオリエンタリス種に属する菌株のアミノグリコシド耐性突 然変異体としてストレプトマイシン耐性ＮＣＡＩＭ００１０９２株又はその子孫 株を用いることを含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．ミクロポリスポラオリエンタリス種に属する菌株のアミノグリコシド耐性突 然変異体としてカナマイシン耐性ＮＣＡＩＭ００１０９３株又はその子孫株又は アミノグリコシド耐性ＮＣＡＩＭＯ０１０９３株又はその子孫株を用いることを 含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．培養培地に０．４〜１．４％の濃度で無機塩として硝酸塩を用いることを含 んで成る請求の範囲第１〜３項のいづれか１項記載の方法。
5. ５．発酵を２５〜３５℃、好ましくは２９〜３０℃の温度で行なうことを含んで 成る請求の範囲第１〜４項のいづれか１項記載の方法。
6. ６．発酵培地として、好ましくはダイズ粉、グリセロール、カルシウムグルコネ ート、コーンスターチ、硝酸ナトリウム及び／又はカリウムを含む培養培地を用 いることを含んで成る請求の範囲１〜５項のいづれか１項記載の方法。
7. ７．イオン交換クロマトグラフィー処理の後、バンコマイシン抗生物質を分離す るために逆浸透手段及びバンコマイシン抗生物質溶液を精製するために１０００ ０〜５００００の表示分子量の排除を有する限外フィルターによる限外濾過を用 いることを含んで成る請求の範囲第１〜６項のいづれか１項記載の方法。