KR100385152B1 - 카프레오마이신의 정제방법 - Google Patents

카프레오마이신의 정제방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100385152B1
KR100385152B1 KR10-2001-0013048A KR20010013048A KR100385152B1 KR 100385152 B1 KR100385152 B1 KR 100385152B1 KR 20010013048 A KR20010013048 A KR 20010013048A KR 100385152 B1 KR100385152 B1 KR 100385152B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
capreomycin
capreomycin sulfate
sulfate
reverse osmosis
present
Prior art date
Application number
KR10-2001-0013048A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20020072962A (ko
Inventor
장준환
서정우
계홍석
권영기
Original Assignee
씨제이 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이 주식회사 filed Critical 씨제이 주식회사
Priority to KR10-2001-0013048A priority Critical patent/KR100385152B1/ko
Publication of KR20020072962A publication Critical patent/KR20020072962A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100385152B1 publication Critical patent/KR100385152B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis

Abstract

본 발명은 미생물 배양액으로부터 얻어진 카프레오마이신 황산염(capreomycin sulfate)에 대해 흡착제로서 알루미나(alumina) 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 카프레오마이신 황산염을 정제하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 고순도 및 저독성의 카프레오마이신 황산염을 간단한 공정에 의해 얻을 수 있다.

Description

카프레오마이신의 정제방법{Process for the purification of capreomycin}
본 발명은 카프레오마이신(capreomycin)의 정제방법에 관한 것으로서, 더욱상세하게는, 미생물 발효액으로부터 일련의 정제과정을 거쳐 얻어진 카프레오마이신 황산염(capreomycin sulfate)의 중간원료로부터 고순도 및 저독성의 카프레오마이신 황산염을 간단하게 정제하는 방법에 관한 것이다.
카프레오마이신은 카프레오마이신 ⅠA, ⅠB, ⅡA 및 ⅡB로 명명된 4 종의 생물학적 활성성분으로 구성된 공지의 폴리펩타이드 항생제 복합체이다. 카프레오마이신 ⅠA(R=OH) 및 ⅠB(R=H)는 하기 화학식 1의 구조를 가지며, 카프레오마이신 ⅡA 및 ⅡB는 각각 카프레오마이신 ⅠA 및 ⅠB로부터 β-라이신 잔기가 결여된 구조를 갖는다.
카프레오마이신은 수많은 그램-양성 및 그램-음성 세균에 대해 활성을 갖는 것으로 보고되었으나, 주로 항결핵제(antituberclosis agent)로서 사용되고 있다.
한편, 결핵은 산업혁명 이후 인구의 도시 집중화, 열악한 노동조건과 생활환경 등으로 인해 급속도로 퍼지며 20세기초까지 사망원인 1위를 차지하였다. 그후, 다양한 항결핵제의 개발로 발병률이 점차 낮아지다가, 최근들어 후천성면역결핍증(AIDS; Acquired ImmunoDeficiency Syndrome)과 약제내성균(MDRTB; Multi-Drug Resistance TuBerculosis)의 출현으로 다시 인류를 위협하고 있다. 특히, 제1세대 결핵치료제인 리팜피신(rifampicin) 또는 에탐부톨(ethambutol) 등에 내성을 갖는 MDRTB를 치료하기 위한 대체 약물인 제2세대 결핵치료제로서 카프레오마이신이 널리 사용되고 있다.
이러한 카프레오마이신을 제조하기 위한 방법으로는, 스트렙토마이세스 카프레올루스(Streptomyces capreolus)를 배양하거나[미합중국 특허 제3,143,468호(1964. 8. 4)], 닥틸로스포란지움 바리에스포럼(Dactylosporangium variesporum)을 동화가능한 탄소 및 질소원을 함유하는 수성 영양배지에서 호기배양하는, 발효에 의한 방법[미합중국 특허 제4,026,766호(1977. 5. 31)]이 알려져 있으며, 이때 카프레오마이신은 황산염의 형태로 존재하게 된다. 그러나, 이러한 미생물 배양액으로부터 카프레오마이신 황산염을 고순도로 정제해낼 수 있는 방법은 아직 특별히 개발된 바 없다.
단지, 미합중국 특허 제4,026,766호에서는 카프레오마이신 복합체를 양이온 교환수지(바람직하게는, 암모늄 형태의 앰버라이트(Amberlite) IRC-50)에 흡착시켜 여과 또는 원심분리된 브로쓰로부터 회수한후, 적절한 용출제로 용출시키고 활성분획을 합하여 활성탄소에 흡착 및 용출시킨후 수층을 염기성 수지(예: 하이드록실 형태의 앰버라이트 IR-45)로 중화시켜 유리 염기 형태의 카프레오마이신을 수득할 수 있다고 기재하고 있다. 또한, 상기 특허에서는 필요한 경우, 카프레오마이신 복합체를 통상의 다양한 흡착제를 이용하는 칼럼 크로마토그래피 등에 의해 추가로정제하여 단일 항생제(카프레오마이신 ⅠA, ⅠB, ⅡA 또는 ⅡB)로서 얻을 수 있다고 일반적으로 기술하고 있다. 그러나, 흡착제로서 실리카겔을 사용하는 것이 바람직한 것으로 기재하고 있고, 기타의 흡착제를 사용하는 경우 사용 용매 및 유속 등의 조건에 대한 설명 및 구체적인 실시예는 전혀 찾아볼 수 없다.
따라서, 미생물 배양액으로부터 1차 정제과정을 거친 카프레오마이신 황산염의 중간원료로부터 보다 높은 순도와 낮은 독성을 갖는 카프레오마이신 황산염을 간단하게 정제해낼 수 있는 새로운 방법의 개발이 여전히 요구되어 왔다.
본 발명자들은 상기 목적에 부합하는 카프레오마이신 황산염의 새로운 정제방법을 개발해내기 위하여 지속적인 연구를 수행해왔으며, 그 결과 흡착제로서 알루미나(alumina) 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 고순도 및 저독성의 카프레오마이신 황산염을 간단하게 정제해낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 흡착제로서 알루미나 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피를 수행함으로써, 미생물 배양액으로부터 얻어진 카프레오마이신 황산염으로부터 기존의 정제방법을 통해 제거되지 않는 불순물을 제거하여 기존의 카프레오마이신 황산염보다 순도가 높고 독성이 낮은 카프레오마이신 황산염을 간단하게 정제해낼 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.
도 1은 카프레오마이신 황산염의 중간원료(China Xin-Yang Zhongke Pharm. Co., Ltd.), 본 발명의 실시예에 따라 정제된 카프레오마이신 황산염, 카프레오마이신 황산염 시약(Sigma), 카파스타트(Dura), 및 USP 표준품의 TLC 분석결과를 나타내는 도면;
도 2a는 카프레오마이신 황산염의 중간원료(China Xin-Yang Zhongke Pharm. Co., Ltd.)의 HPLC 분석결과를 나타내는 도면;
도 2b는 본 발명의 실시예에 따라 정제된 카프레오마이신 황산염의 HPLC 분석결과를 나타내는 도면;
도 2c는 카프레오마이신 황산염 시약(Sigma)의 HPLC 분석결과를 나타내는 도면;
도 2d는 카파스타트(Dura)의 HPLC 분석결과를 나타내는 도면; 및,
도 2e는 USP 표준품의 HPLC 분석결과를 나타내는 도면.
본 발명은 미생물 배양액으로부터 얻어진 카프레오마이신 황산염에 대해 흡착제로서 알루미나 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 카프레오마이신 황산염을 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 알루미나 수지는 염산, 수산화나트륨 및 황산으로 순차적으로 활성화된 것이 바람직하다. 또한, 미생물 배양액으로부터 얻어진 카프레오마이신 황산염은 역삼투압수(R/O water)에 용해된 것이고, 역삼투압수를 칼럼에 흘려주면서 크로마토그래피를 수행하는 것이 바람직하다. 상기 칼럼 크로마토그래피로부터 얻어진 용출액은 역삼투에 의해 농축한후, 에탄올에 점적하여 정석(晶析)하는 것이 보다 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 미생물 발효액으로부터 얻어진 카프레오마이신 황산염의 중간원료로부터 고순도 및 저독성의 카프레오마이신 황산염을 제조하는 간단한 방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 반정제 원료를 고순도 및 저독성으로 정제하는 간단한 방법에 관한 것으로서, 바람직하게는, 하기 단계를 포함하는 것이다:
(ⅰ) 알루미나 수지를 염산, 수산화나트륨 및 황산으로 순차적으로 활성화시킨후, 미생물 발효액으로부터 일련의 정제과정을 거친 중간원료(예: China Xin-Yang Zhongke Pharm. Co., Ltd. 제품)를 역삼투압수에 용해시켜 칼럼에 흘려준다;
(ⅱ) 카프레오마이신 성분을 UV 265 nm에서 검출하면서 용출액을 모아 역삼투 방식으로 농축한다;
(ⅲ) 상기 농축액을 교반기내의 에탄올에 점적하여 침전물을 생성시킨후, 여과 및 감압건조한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일뿐 이들에 의해 본 발명을 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1:수지의 활성화
바이오-래드 이코노-칼럼(Bio-rad econo-column)에 알루미나 수지 5 ℓ를 충진하고 2 N 염산 10 ℓ와 2 N 수산화나트륨 10 ℓ를 순차적으로 흘려주어 활성화시켰다. 이어서, 0.2 N 황산 10 ℓ를 흘려주어 2차로 활성화시켰다. 이렇게 활성화된 칼럼을 pH 4가 될때까지 역삼투압수로 세척하였다. 이때 사용한 칼럼은 길이와 직경의 비가 5(L/D=5)인 칼럼이었고, 유속은 2.5 ℓ/시간이었다.
실시예 2:카프레오마이신 황산염의 분리
반정제 원료(China Xin-Yang Zhongke Pharm. Co., Ltd. 제품) 120 g을 500 ㎖의 역삼투압수에 용해시킨 용액을 실시예 1의 칼럼에 흘려주고 계속해서 역삼투압수를 흘려주었다. 카프레오마이신 황산염을 UV 265 nm에서 검출하고(검출기: LKB 2158 UVICORD SD), 용출하기 시작할때부터 2 ℓ씩 12 ℓ를 분취하여 이를 박막 크로마토그래피(TLC; Thin Layer Chromatography)와 고압액체크로마토그래피(HPLC; High Pressure Liquid Chromatography)로 확인하였다.
실시예 3:농축 및 정석
실시예 2에서 얻은 용출액을 분자량 280의 나노필터(Nanomax-95 막, Millipore)를 이용하여 역삼투압에 의해 약 500 ㎖로 농축하였다. 이때 100 g의 카프레오마이신 황산염을 얻을 수 있었다. 이 농축액을 에탄올 2 ℓ가 함유되어 있는 정석조에 점적하며 교반하였다. 이때 교반속도는 180 rpm, 온도는 상온(15∼35℃), 점적속도는 5 ㎖/분이었다. 점적이 완료된후 침전이 생성되도록 약 30 분간 방치하였다.
실시예 4:여과 및 건조
실시예 3에서 얻은 혼합액을 여과한후, 36 ℃에서 감압건조하여 98 g의 분말을 얻었다. 이 분말에 250 ㎎/㎖ 농도가 되도록 물을 가하여 용해시킨후, 동결건조하였다.
실험예 1:카프레오마이신 황산염의 순도 비교실험
본 발명의 방법에 따라 정제한 카프레오마이신의 순도를 기존 제품의 순도와 비교하기 위하여, 상기 실시예에서 얻은 제품, 및 카파스타트(Capastat™sulfate, Dura), 카프레오마이신 황산염 시약(Sigma) 및 미합중국의약품기준(USP) 표준품을 TLC로 비교분석하였다. 이때 사용한 TLC의 조건은 아래와 같았다:
TLC 플레이트: 머크(Merck) 05642 실리카겔 60F254 플레이트
전개용매: 페놀, 증류수 및 암모니아수의 30:10:1 혼합용매
발색시약: 에탄올중의 0.5% 닌히드린 용액
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 레인 1은 중간원료, 레인 2는 상기 실시예에서 얻은 제품, 레인 3은 카프레오마이신 황산염 시약, 레인 4는 카파스타트 및 레인 5는 USP 표준품을 각각 나타낸다. 도 1로부터, 본 발명의 방법에 의해 정제된 제품이 타 제품에 비해 불순물 없이 깨끗한 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 이들을 아래 조건의 HPLC로 비교분석하였으며(Shimatsu SCL-10A 세트), 그 결과를 도 2a 내지 2e에 나타내었다:
칼럼: 슈펠코 슈퍼코실(Supelco supercosil) LC-CN 칼럼(4.6 ㎜×15 ㎝)
이동상: 0.5 g/ℓ의 암모늄 바이설페이트와 메탄올의 55:45 혼합용액
유속: 1.5 ㎖/분
검출: 268 nm UV
도 2에서, 5분대에 나오는 피크가 카프레오마이신 ⅠA, 7분대에 나오는 피크가 카프레오마이신 ⅠB를 나타내고 이들을 합한 비율이 90%를 넘어야 한다(USP 기준). 도 2a는 중간원료, 도 2b는 상기 실시예에서 얻은 제품, 도 2c는 카프레오마이신 황산염 시약, 도 2d는 카파스타트, 및 도 2e는 USP 표준품을 이용하여 얻은 결과를 각각 나타낸다. 도 2로부터, 본 발명의 방법에 의해 정제된 제품이 매우 높은 순도를 가짐을 확인할 수 있었다.
실험예 2:카프레오마이신 황산염의 약효 비교실험
본 발명의 방법에 의해 정제된 카프레오마이신 황산염의 약효를 카파스타트의 약효와 비교하기 위하여 여러 가지 세균군을 대상으로 통상의 최소저해농도(MIC; Minimal Inhibition Concentration) 측정방법에 따라 약효시험을 수행하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 정제한 카프레오마이신 황산염이 기존 제품인 카파스타트와 비교하여 동등 내지 우수한 약효를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실험예 3:카프레오마이신 황산염의 독성 비교실험
본 발명의 방법에 의해 정제된 카프레오마이신 황산염의 독성을 카파스타트의 독성과 비교하기 위하여, 표 2 및 3에 기재된 성별의 마우스 및 투여량을 이용하여 사망일을 측정함으로써 독성시험을 수행하였다. 그 결과를 표 2 및 표 3에 각각 나타내었다.
상기 표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 정제한 카프레오마이신 황산염이 기존 제품인 카파스타트에 비해 훨씬 낮은 독성을 가짐을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따르면, 기존의 제품보다 순도가 높고 독성이 낮은 카프레오마이신 황산염 제품을 간단한 공정에 의해 얻을 수 있으므로, 이를 공업적으로 응용하여 우수한 품질의 카프레오마이신 황산염을 생산할 수 있다.

Claims (5)

  1. 미생물 배양액으로부터 얻어진 카프레오마이신 황산염(capreomycin sulfate)에 대해 흡착제로서 알루미나(alumina) 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 카프레오마이신 황산염을 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 알루미나 수지가 염산, 수산화나트륨 및 황산에 의해 순차적으로 활성화된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 미생물 배양액으로부터 얻어진 카프레오마이신 황산염이 역삼투압수(R/O water)에 용해된 것이고, 역삼투압수를 칼럼에 흘려주면서 크로마토그래피를 수행하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 칼럼 크로마토그래피로부터 얻어진 용출액을 역삼투에 의해 농축하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 얻어진 농축액을 에탄올에 점적하여 정석(晶析)하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
KR10-2001-0013048A 2001-03-14 2001-03-14 카프레오마이신의 정제방법 KR100385152B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2001-0013048A KR100385152B1 (ko) 2001-03-14 2001-03-14 카프레오마이신의 정제방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2001-0013048A KR100385152B1 (ko) 2001-03-14 2001-03-14 카프레오마이신의 정제방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020072962A KR20020072962A (ko) 2002-09-19
KR100385152B1 true KR100385152B1 (ko) 2003-05-23

Family

ID=27697320

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2001-0013048A KR100385152B1 (ko) 2001-03-14 2001-03-14 카프레오마이신의 정제방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100385152B1 (ko)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4026766A (en) * 1976-05-05 1977-05-31 Bristol-Myers Company Fermentation process
JPS56142250A (en) * 1980-04-08 1981-11-06 Sankyo Co Ltd Antibiotic, mycoplanecin c, and its preparation
JPS5748996A (en) * 1980-09-05 1982-03-20 Kitasato Inst:The Antibiotic am-3603 and its preparation
WO1991008300A1 (en) * 1989-11-27 1991-06-13 Biochin Biotechnológiai Leányvállalat Process for the preparation of vancomycin
KR930013138A (ko) * 1991-12-26 1993-07-21 김정순 이온교환수지 및 알루미나 수지를 이용한 반코마이신의 정제
WO1995007997A1 (en) * 1993-09-17 1995-03-23 Won Cheol Shin New antifungal antibiotic, and new bacillus sp. microorganism which can produce the above antibiotic and its manufacturing method
WO1999003800A1 (de) * 1997-07-18 1999-01-28 Dynamit Nobel Gmbh Explosivstoff-Und Systemtechnik Geschoss-patrone

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4026766A (en) * 1976-05-05 1977-05-31 Bristol-Myers Company Fermentation process
JPS56142250A (en) * 1980-04-08 1981-11-06 Sankyo Co Ltd Antibiotic, mycoplanecin c, and its preparation
JPS5748996A (en) * 1980-09-05 1982-03-20 Kitasato Inst:The Antibiotic am-3603 and its preparation
WO1991008300A1 (en) * 1989-11-27 1991-06-13 Biochin Biotechnológiai Leányvállalat Process for the preparation of vancomycin
KR930013138A (ko) * 1991-12-26 1993-07-21 김정순 이온교환수지 및 알루미나 수지를 이용한 반코마이신의 정제
WO1995007997A1 (en) * 1993-09-17 1995-03-23 Won Cheol Shin New antifungal antibiotic, and new bacillus sp. microorganism which can produce the above antibiotic and its manufacturing method
WO1999003800A1 (de) * 1997-07-18 1999-01-28 Dynamit Nobel Gmbh Explosivstoff-Und Systemtechnik Geschoss-patrone

Also Published As

Publication number Publication date
KR20020072962A (ko) 2002-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG61190B1 (bg) Метод за получаване и/или пречистване на клавуланова киселина или нейна фармацевтично приемлива сол или естер
EP1612216B1 (en) Process of purifying vancomycin hydrochloride
EP0241758A2 (en) A process for recovery of glycopeptidic antibiotics
JPS6240292A (ja) 抗生物質ゾフイマリン
KR100385152B1 (ko) 카프레오마이신의 정제방법
CN115850354A (zh) 一种聚酮类化合物efrotomycin及其制备方法和应用
CN110117310B (zh) 一种达托霉素的纯化方法
JPS6158593A (ja) 新規サフラマイシンａ誘導体およびその製造法
CN106565784B (zh) 头孢洛林酯二钠盐的纯化方法
CA2273021A1 (en) Purification of fermented clavulanic acid
AU4814300A (en) Halo- or hydroxy-substituted nocathiacin antibiotics
KR101033845B1 (ko) 은 이온 용액 결정화에 의한 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제방법
KR100284174B1 (ko) 스피라마이신의 정제방법
US4209612A (en) Fortimicin factors KF and KG and process for production thereof
KR100910165B1 (ko) 은 이온 용액 추출을 이용한 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제방법
KR101022067B1 (ko) 고순도 타크로리무스의 회수방법
NZ244774A (en) Protein-associated chromophore from actinomadura, pharmaceutical compositions and production
CA1247029A (en) Cephem compounds and their production
KR100280367B1 (ko) 푸시딘산의 정제방법
JP2883708B2 (ja) 新規な抗かび性抗生物質デキシロシルベナノマイシンａならびにその製造法
JPS6337098B2 (ko)
SU1547711A3 (ru) Способ получени даунорубицин-гидрохлорида
KR840001657B1 (ko) 마이코프라네신 유도체의 제조방법
JPH05155896A (ja) 新規マクロライド化合物及びその製造法
EP1266905A1 (en) Process for producing purified erythromycin

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130315

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140228

Year of fee payment: 12

LAPS Lapse due to unpaid annual fee