KR100284174B1 - 스피라마이신의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (ⅰ) 스피라마이신의 조생성물을 물과 유기 극성용매 30 ∼ 70 : 70 ∼ 30(v/v)의 혼합물에 용해시키고, 황산, 염산 또는 인산을 첨가하여 pH 5.0 내지 5.5로 조절하는 제 1공정; (ⅱ) 상기 pH가 조절된 조생성물 용액을 수지상에 적용시켜 선택적으로 스피라마이신을 흡착시키는 제 2공정; (ⅲ) 상기 흡착된 스피라마이신을 물과 유기 극성용매 30 ∼ 70 : 70 ∼ 30(v/v)의 혼합물로 용출시키는 재 3공정; 및, (ⅳ) 전기 용출액에 황산, 염산 또는 인산을 첨가하여 pH 5.0 내지 5.5로 조절한 뒤, 진공농축시켜 결정화하는 제 4공정을 포함하여 이루어지는 스피라마이신의 정제방법을 제공한다.
본 발명의 정제방법에서는, 흡착 수지에 의해 불순물이 거의 완전히 제거되므로, 재결정화가 필요없이, 스피라마이신을 간단히 고순도로 정제할 수 있으며, 정제에 사용된 흡착 수지를 재생하여 계속 사용할 수 있으므로 매우 경제적이다.
Description
본 발명은 스피라마이신을 고순도로 정제하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 스피라마이신 조생성물 중에 공존하는 발효 제조 공정에서 생긴 유기 불순물 및 무기 불순물의 양을 최소화하기 위하여, 흡착 수지 상에서 불순물을 제거하는 방법에 관한 것이다.
스피라마이신은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.
[단, 상기 식에서,
R이 H인 경우는 스피라마이신 I, COCH3인 경우는 스피라마이신 II, COCH2CH3인 경우는 스피라마이신 III이다.]
본 명세서의 상세한 설명 전반 및 특허청구범위에서, 스피라마이신은 스트렙토마이세스 앰보파시엔스(Streptomyces ambofaciens)의 배양에 의해 얻어지는 스피라마이신 I, 스피라마이신 II 및 스피라마이신 II의 혼합물, 이의 염, 또는 다른 방법으로 얻어지는 이와 동일한 물질을 의미한다.
스피라마이신의 정제방법에 관해서는 이미 몇몇 특허에 개시되어 있으며, 가장 일반적인 제조방법이 미국 특허 제3,000,785호에 개시되어 있다. 상기 특허에 따른 정제방법은 스트렙토마이세스 앰보파시엔스 NRRL 2420(Streptomyces ambofaciens NRRL 2420)으로 발효 생산하여 그 배양물을 알칼리 용액과 벤젠으로 추출하고, 벤젠 추출물을 30℃ 내에서 농축하고, 부틸알콜을 가하고, 황산으로 pH 5.0으로 조정한 후, 에테르를 가하여 침전시키고, 침전물을 여과하고, 에테르로 세척한 후 건조하는 공정으로 이루어진다. 이러한 방법은 최종 생성물에 불순물이 상당량(10% 이상) 존재하여, 의약품으로 사용할 경우, 부작용을 유발할 수 있으며, 부틸알콜을 사용하므로 작업자의 건강을 해칠 위험도 있다.
한편, 미국 특허 제3,011,947호의 방법에 따르면, 스피라마이신 조생성물을 벤젠에 용해하고, 이 용액을 알루미나가 충전된 일반적인 칼럼 형태의 적합한 용기 중에 함유시켜 용출시킨 후, 용출물을 농축 결정화하여 스피라마이신을 정제한다. 그러나, 이 방법도 역시 최종 생성물에 불순물이 과다하게 함유되어 순도가 낮으며, 1회 사용 후에 재생이 어려운 알루미나를 사용하므로 비용이 많이 드는 단점이 있다.
오늘날 항생 물질 분야에서 목적하는 물질의 순도가 지니는 의미는 지대하다. 순도의 미차는 각 물질이 지니는 효능에 중요한 변화 요소로 작용하며, 또한 다량 포함되어 있는 미지의 불순물에 의한 부작용도 발생할 우려가 높으므로, 보다 높은 순도를 갖는 원료 물질을 보다 고수율로 얻고자 하는 노력이 경주되고 있는 바, 상기 여러 방법들에 의해 수득되는 스피라마이신은 여전히 높은 불순물 함량을 나타내어, 순도가 낮고 수율 또한 높지 않은 문제점이 있어, 이에 대한 개선의 필요성이 절실하다.
이에 본 발명자들은, 상기와 같은 문제점을 개선시키기 위하여, 보다 효율적으로 상기 화학식 1로 표시되는 스피라마이신을 제조하고자 연구한 결과, 스피라마이신의 조생성물을 산성 조건하에서 흡착 수지 상에 흡착시킨 후 용출시키면 불순물이 거의 완전히 제거된 고순도의 스피라마이신을 얻을 수 있다는 사실을 알게 되어, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 스피라마이신의 정제방법에 관한 것으로,
(ⅰ) 스피라마이신의 조생성물을 물과 유기 극성용매 30 ∼ 70 : 70 ∼ 30(v/v)의 혼합물에 용해시키고, 황산, 염산 또는 인산을 첨가하여 pH 5.0 내지 5.5로 조절하는 제 1공정;
(ⅱ) 상기 pH가 조절된 조생성물 용액을 수지상에 적용시켜 선택적으로 스피라마이신을 흡착시키는 제 2공정;
(ⅲ) 상기 흡착된 스피라마이신을 물과 유기 극성용매 30 ∼ 70 : 70 ∼ 30(v/v)의 혼합물로 용출시키는 재 3공정; 및,
(ⅳ) 전기 용출액에 황산, 염산 또는 인산을 첨가하여 pH 5.0 내지 5.5로 조절한 뒤, 진공농축시켜 결정화하는 제 4공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 스피라마이신의 정제방법에 대하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제 1공정: 스피라마이신 조생성물의 용해 및 pH 조절공정
본 발명의 정제방법을 적용하고자 하는 스피라마이신은 스트렙토마이세스 앰보파시엔스(Streptomyces ambofaciens)를 이용한 발효법, 또는 이와 유사한 합성방법에 의해 생산된다. 그러나, 이러한 스피라마이신 조생성물은 다량의 유기 또는 무기물 등의 불순물을 함유하고 있으므로, 이를 실제 임상에 적용하기 위해서는 보다 고순도로 정제할 필요성이 있다. 따라서, 우선, 상기에서와 같은 발효법 등에 의해 생산되어 불순물이 함유된 스피라마이신 조생성물을 물과 유기 극성용매 30 ∼ 70 : 70 ∼ 30(v/v)의 혼합물에 용해시킨다. 이때, 유기 극성용매로는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴 및 이소프로필알콜 중에서 선택된 1종을 이용한다. 다음으로, 전기 조생성물 용액에 황산, 염산 또는 인산 등의 산용액을 첨가하여 용액의 pH를 5.0 내지 5.5로 조절한다.
제 2공정: 스피라마이신 흡착공정
상기 공정에서 pH가 조절된 조생성물 용액을 수지상에 적용시켜 선택적으로 스피라마이신을 흡착시킨다. 이때, 흡착수지는 고도의 다공성 폴리머로 이루어진 것으로, 이러한 수지는 수지 표면이 할성화되어 있어 불순 유기물 및 무기물을 효율적으로 흡착하는 것이 바람직하며, 예를 들면, 앰버라이트(Amberlite) XAD2 수지, 또는 HP20 수지 등을 사용할 수 있다.
제 3공정: 스피라마이신 용출공정
상기 공정에서 흡착된 스피라마이신을 물과 유기 극성용매 30 ∼ 70 : 70 ∼ 30(v/v)의 혼합물로 용출시킨다. 이때, 유기 극성용매는 제 1공정에서와 같이 메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴 및 이소프로필알콜 중에서 선택된 1종을 사용한다. 유기 극성 용매의 함량이 상기 범위보다 과량이면 용출분리된 용출액내의 스피라마이신이 불순해질 수 있는 문제점이 있으며, 또한 상기 범위보다 너무 소량을 첨가하면 본 발명의 목적물인 스피라마이신이 용출되지 않는 문제점이 있게 된다.
제 4공정: 농축 및 결정화 공정
전기 공정에서 수득한 용출액에 황산, 염산 또는 인산을 첨가하여 pH를 5.0 내지 5.5로 조절한 뒤, 통상의 방법에 따라 진공농축 및 결정화 공정을 거쳐 고순도의 스피라마이신을 얻는다.
이상에서와 같은 본 발명의 정제방법에 따르면, 흡착 수지에 의하여 불순물이 거의 완전히 제거되므로, 더 이상의 재결정화 할 필요없이 간단한 방법을 통해 99%이상의 고순도를 지닌 스피라마이신을 정제할 수 있게 된다. 또한, 본 발명에서 사용되는 흡착 수지는 순수한 메탄올과 증류수를 이용하여 반복 세척하여 재사용할 수 있으므로 경제적이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
스피라마이신의 정제
순도가 90%이고, 불순물 함량이 10%인 스피라마이신 10g을 메탄올:물(50:50 v/v) 혼합물 10ml에 용해하고, 황산을 사용하여 pH 5.5로 조절한 후, 이 용액을 직경 3cm인 칼럼 중에 함유된 Amberlite XAD2 수지 상에 흡착시켰다. 생성물을 물-메탄올 혼합용액(50:50 v/v)로 용출하여 순수한 스피라마이신 20ℓ의 용출물을 수집하였다. 황산으로 pH를 5.5로 재조절한 후, 역삼투막(M.W :300) 상에서 400psi의 압력으로 농축하여 300ml 용적으로 농축하고, 40℃의 진공농축기를 이용하여 거의 농축한 후, 소량의 메탄올로 용해한 후 에틸 에테르를 가하여 결정을 석출시킨 후 서서히 냉각시켰다. 결정화하여 생성물을 여과한 다음, 40℃에서 4시간 동안 진공건조시켰다. 그 결과, 스피라마이신 8.5g을 얻었다.
스피라마이신의 순도 측정
하기 조건하에 HPLC를 사용하여 스피라마이신의 순도를 측정하였다.
시료 용액 : 스피라마이신 50mg을 메탄올 10ml에 녹인 용액
컬럼 : Lichrocart, RP-18 endcapped(5㎛), Merck사제
용리액 : 소디움 도데실 설페이트 6.635g + 물 2.5L →
인산 3.4ml + 아세토니트릴 2.5L → 여과
주입 부피 : 20 ㎕
검출기 : UV, 254nm
유량 : 0.8ml/분
온도 : 실온
지연 시간 : 25분
이러한 방법으로 측정한 결과, 상기에서 수득한 스피라아니신의 순도는 99.5%이었고, 불순물 함량은 0.5%이었다.
흡착 수지의 재생
순도 90% 이상의 메탄올을 수지 체적의 2배에 해당하는 양으로 상기 흡착 수지에 통과시킨 후, 과량의 증류수로 세척하는 방법을 3회 반복하여, 재생된 흡착 수지를 얻었다.
실시예 2
재생 흡착 수지를 이용한 스피라마이신의 정제
순도가 90%이고, 불순물 함량이 10%인 스피라마이신 100g을 메탄올:물(50:50 v/v) 혼합물 100ml에 용해하고, 황산을 사용하여 pH 5.5로 조절한 후, 이 용액을 직경이 12cm인 유리 칼럼 중에 함유된 상기 재생 Amberlite XAD2 수지상에 흡착시켰다. 생성물을 물-메탄올 혼합용액(50:50 v/v)로 용출하여 순수한 스피라마이신 300ℓ의 용출물을 수집하였다. 황산으로 pH를 5.5로 재조절한 후, 역삼투막(M.W.: 300) 상에서 400psi의 압력으로 농축하여 3000ml 용적으로 농축하고, 40℃의 진공 농축기를 이용하여 거의 농축한 후, 소량의 메탄올로 용해한 후 에틸 에테르를 가하여 결정을 석출시킨 후, 서서히 냉각시켰다. 결정화하여 생성물을 여과한 다음, 40℃에서 4시간동안 진공건조시켰다. 그 결과, 얻어진 스피라마이신은 순도가 99.6%(불순물 함량 0.4%)였고, 각각의 불순물 피크는 0.1%이하였으며, 수율은 86%였다.
본 발명의 정제방법에서는, 흡착 수지에 의해 불순물이 거의 완전히 제거되므로, 재결정화가 필요없이, 스피라마이신을 간단히 고순도로 정제할 수 있으며, 정제에 사용된 흡착 수지를 재생하여 계속 사용할 수 있으므로 매우 경제적이다.
Claims (3)
- (ⅰ) 스피라마이신의 조생성물을 물과 유기 극성용매 30 ∼ 70 : 70 ∼ 30(v/v)의 혼합물에 용해시키고, 황산, 염산 또는 인산을 첨가하여 pH 5.0 내지 5.5로 조절하는 제 1공정;(ⅱ) 상기 pH가 조절된 조생성물 용액을 수지상에 적용시켜 선택적으로 스피라마이신을 흡착시키는 제 2공정;(ⅲ) 상기 흡착된 스피라마이신을 물과 유기 극성용매 30 ∼ 70 : 70 ∼ 30(v/v)의 혼합물로 용출시키는 재 3공정; 및,(ⅳ) 전기 용출액에 황산, 염산 또는 인산을 첨가하여 pH 5.0 내지 5.5로 조절한 뒤, 진공농축시켜 결정화하는 제 4공정을 포함하여 이루어지는 스피라마이신의 정제방법.
- 제 1항에 있어서,상기 수지는 앰버라이트 XAD2 또는 HP20인 것을 특징으로 하는 스피라마이신의 정제방법.
- 제 1항에 있어서,상기 유기 극성용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴 및 이소프로필알콜 중에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 스피라마이신의 정제방법.
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